Способ получения протеолитического комплекса, предназначенного для применения в зоотехнике Советский патент 1991 года по МПК C12N9/52 A23K1/165 C12N9/52 C12R1/54 

Изобретение относится к биотехнологии и предназначено для применения в зоотехнике.

Цель изобретения - повышение общей протеолитической активности за счет преобладания в комплексе протеаз типа И и обеспечения ускорения роста животных в процессе кормления или в период беременности.

Способ заключается в следующем.

Ферментация. Используют штамм Streptomyces fradiae. типовой штамм WAKSMAN 3535, хранящийся в американском собрании типов культур АТСС под номером 10.745. Этот штамм может быть периодически регенерирован классическими способами диссоциации на агаровой среде для удаления возможных спонтанных мутантов со слабой протеолитической активностью. Этот штаммм может быть также улучшен классическими способами мутации, вызываемой с целью получения повышения протеолитической активности

Готовят предкультуру этого штамма сначала в колбах с перемешиванием, затем в промежуточном ферментере, затем осуществляют прививку в ферментере промышленного производства. Продуцирующая среда может иметь следующий состав, г/л соевая мука 15, глюкоза 30, дикалийфосфат 1; карбонат кальция 10. После стерилизации ее рН близко к 7,0, температуру ферментации поддерживают при 28°С и аэрацию Х|

О

СО

GO

при 0,3 объема стерильного воздуха на 1 обьем среды в 1 мин.

Значение рН среды, первоначально близкое к 7,0, начинает снижаться и спустя около 10 ч времени ферментации достигает 6,5, затем оно быстро повышается и спустя примерно 20 ч времени ферментации достигает 7,5, затем продолжает более медленно повышаться до достижения окончательно значения 8,2.

Важно поддерживать рН равным 7,5- 7,0 путем автоматического добавления кислотного раствора (3 н.соляной кислоты), что позволяет избежать фрагментации мицелия и выделения в среду некоторых вторичных метаболитов, протеаз тмпа.1а, ь и пептидаз (эти вторичные метаболиты и эти ферменты также остаются внутриклеточными} увеличивать продуцирование протеаз типа It, III, IV, которые представляют собой в основном внеклеточные ферменты, значительно увеличить продуцирование протеа- зы типа II.

Продолжительность ферментации может изменяться от 72 до 96 ч и конечный титр среды может составить около 15000 U.А./мл, что намного превышает известный титр (3000 U.A./мл).

Единица Ап5оп( сокращенно и.А.)здесь определяется как количество фермента, которое, инкубированное в течение 10 мин при 25°С и при рН 7,5 в присутствии денатурированного гемаглобина, выделяет из этого субстрата эквивалент 1 ид тирозина, определяемый спектрофотометрической абсорбцией при 280 нм на фильтрате, не осаждаемом трихлоуксусной кислотой.

Экстракция. Мицелий отделяют от продуцирующей среды путем осветляющей фильтрации.

Комплекс вместо того, чтобы его экстрагировать классическими методами выделения ферментов (последовательное осаждение, пропускание через колонку), экстрагируют методом ультрафильтрации.

Мембраны для ультрафильтрации, которые имеют порог разделения, соответствующий молекулярной массе 30000, непригодны, поскольку они могут пропускать более 50% комплекса. Мембраны, которые имеют порог разделения, соответствующий молекулярной массе 1000, также непригодны, поскольку они не позволяют отделять от комплекса некоторые вторичные метаболиты с незначительной молекулярной массой. Целесообразно использовать мембраны, которые имеют порог разделения, соответствующий молекулярной массе 2000-12000, используя полисульфоновую мембрану, выпускаемую

в продажу фирмой МИЛЛИПОР под названием PTGC, которая имеет порог разделения, соответствующий молекулярной массе 10000.

Полученный путем ультрафильтрации

концентрат затем подвергают распылению. Получают комплекс протеолитических ферментов в форме порошка светло-бежевого цвета, имеющий титр по крайней мере

2000 U.A./мг, не учитывая инертные основы, например высушенный крахмал, в известных случаях добавленные до или после распыления.

Общий выход в виде протеолитической

5 активности, который составляет около 70%, выше такового, который будет получаться в промышленности последовательными осаждениями или пропусканиями через колонки.

0 Характеристика нового комплекса: наличие (определенное ферментоэлектрофо- резом) протеаз типа II, III, IV при исключении протеаз типа 1а, ь и пептидаз; - преобладание протеазы типа II, которая

5 означает по крайней мере 40% общей протеолитической активности, причем протеазы типа III или IV обозначают каждая самое большее 30% этой общей активности.

Характеристики основных протеаз ком0 плекса,

Протеаза типа II. Молекулярная масса близка к 18000; изоэлектрическая точка близка с 9,0; путем электрофореза при рН 8,0 перемещение к катоду с относительно

5 слабой скоростью.

Протеаза типа III. Молекулярная масса близка к 14,000; изоэлектрическая точка близка к 9; путем электрофореза при рН 8,0 перемещение к катоду со средней скоро0 стью.

Протеаза типа IV. Молекулярная масса близка к 16500; изоэлектрическая точка близка к 9,0; путем электрофореза при рН 8,0 перемещение к катоду с относительно

5 большой скоростью.

Пример. Культивируют штамм S. fradiae ATCC 10745, осуществляя первую инокуляцию в ферментере общим объемом 2 м , полезный объем которого 1 м3. Пол0 ученный инокулят используют для культивирования в промышленном ферментере емкостью 30 м3 и полезной емкостью 20 м3. Ферментационная среда имеет следую5

щий состав для емкости 20 м , кг:

Соевая мука Глюхоза Дикалийфосфат Карбонат кальция Вода

300

600

20

200

Остальное

Перед ферментацией среду стерилизуют, ее рН доводят до 7,0, температуру ферментации устанавливают на 28 ±1°С, Среду в процессе ферментации аэрируют путем циркуляции 0,3 объема стерильного воздуха на 1 объем среды в 1 мин. Ферментацию осуществляют в течение около 72 ч при поддержании рН 7,0-7,5 путем систематического добавления 3 н,соляной кислоты.

После 72 ч концентрация протеолитиче- ского комплекса в среде составляет 15000 U.A./мл.

Экстракция. Культуральную среду фильтруют через кларгель на классическом пресс-фильтре с фильтрующей поверхностью 10 м .

Мицелий промывают на пресс-фильтре три раза водой.

Ультрафильтрация. Промывные воды соединяют с фильтратом и все вместе направляют на ультрафильтрационное устройство, имеющее фильтрующую поверхность с порогом раздлеления 1000G.

Скорость прохождения через фильтр около 1 м3 на 1 м2 фильтрующей поверхности в 1 ч, а конечная концентрация твердого продукта, полученного после фильтрации, составляет 100 кг/м3.

Концентрированный раствор распыляют и получают порошок с концентрацией не менее 2000 U.A./мг, как правило, 3000 U.A, содержащий типа II, П1 и IV (за исключением протеаз типа la, Id и пептидаз) с преобладанием прогеазы типа II, которая представляет по меньшей мере 40% общей протеояитической активности..

Полученный порошок бежевого цвета соединяют с крахмалом для промышленного использования.

Используемое ультрафильтрацирнное устройство является наиболее крупным торговым аппаратом марки UFP 10 выпу- скаемым фирмой Рон-Пуленк.

Подача на ультрафильтрующее устройство осуществляется с помощью нагнетающего насоса и регулируется открытием выходного клапана, который оебспечивает заданное давление, причем оптимум подачи составляет 1000 л/м2 ч.

Применение в зоотехнике предлагаемого комплекса приводит к наилучшим результатам, когда они осуществляются согласно следующим условиям.

Использование кормов с повышенным содержанием сырых белков. Констатировано, что комплекс стимулирует рост животных,отдаваяпредпочтение протеиногеназам по отношению к лалипо- геназе. Например, наблюдалось, что скелеты обработанных телят и свиней иногда

лучше классифицируются, поскольку они более мускулистые и менее жировые, но эти улучшения были нерегулярными.

Тенденция комплекса стимулировать 5 протеиновый анаболизм может полностью выражаться только в случае, если используемый корм имеет достаточное содержание сырых белков. Эксперимент эффективно подтвердил, что для достижения регулярной

0 значительной стимуляции протеинового анаболизма необходимым условием является использование относительно обогащенного сырыми белками корма, т.е. имеющего высокое содержание общего азотсодержа5 щего сырья (сокращенно М.А.Т.).

Например, это содержание М.А.Т. должно быть: 23% для кормов, предназначенных для цыплят; 22% для кормов при искусственном вскармливании, предназна0 ченных для телят или ягнят; 20% для кормов при отнятии от груди, предназначенных для беременных и кормящих свиноматок,

Использование таких кормов не соответствует, обычно, текущей практике, пото5 му что животные не всегда способны полностью усваивауь корм, имеющий повышенное содержание М.А.Т. В этом случае непереваренные белки могут привести к нарушению равновесия в кишечной флоре за

0 счет чрезмерного развития протеолитиче- ских бактерий и к увеличению частоты диарей (поносов). Использование комплекса как оаз и позволяет устранить эти явления, так как он придает животным способность

5 эффективно усваивать корма, имеющие повышенное содержание М.А.Т.

Кроме того, корма с повышенным содержанием М.А.Т. имеют стоимость выше таковой обычных кормов и добавление в них

0 комплекса еще более удорожает их. Однако это удорожание может быть компенсировано тем фактом, что с комплексом можно использовать корма менее энергоемкие, чем обычные корма. Во всяком случае ввиду

5 значительного зоотехнического эффекта общий экономический выигрыш от использования комплекса остается высоким.

Использование кормов, предназначенных для млекопитающих в период беремен0 ности, кормления и отнятия от груди, Предлагаемый комплекс стимулирует экзок- ринную активность поджелудочной железы. Это стимулирование подтверждается, в частности, экспериментами на крысе и выража5 ется в значительном увеличении внутрипанкреатической концентрации всех ферментов, которые выделяются панкреатическим каналом. Это увеличение может достигать 50% для амилазы, 70% для трипсиногена и химотрипсиногена. 80% для липазы.

Наличие эффекта стимуляции экзокрин- нои активности поджелудочной железы предполагает, что комплекс будет особенно эффективен а случае, когда проявляемся недостаточность поджелудочной железы (yes- мок а конце беременности) или когда нужно интенсифицировать ее деятельность при йоспооиэводстое(у самок, кормящих грудью Многочисленное потомство) или при адаптации (у молодых млекопитающих в период Отнятия мх от груди). Следующие примеры подтверждают сказанное.

Недостаточность деятельности поджелудочной железы, часто встречающаяся у сзмок в конце беременности, объясняется значительным расширением объема -чатки. которая давит на все пищеварительные органы. Добавление комплекса к корму, отпускаемому этим самкам, позволяет восстановить хорошую работу поджелудочной жепезы и впоследствии получить увеличение песа рождающегося приплода.

Нагр;/.мер, с помоа;ью только одного кормЕ/ ;:,лп беременных свиней или кормящих гранью свиней, имеющего содержание IV1.A.T - 8%, добавление комплекса в дозе 120 U.А. - а 1 г корма позволяет достигать увеличения на 7% веса рожденного приплода, 15 кг вместо 12,8 кг {10,7 поросят по i,4 кг вместо (0,Ј поросят по 1,25 кг).

ежедневное потребление пищи самка- Ми, кормящими грудью многочисленное потомство, должно быстро возрастать: между концом беременности и восмым днем кормления грудью оно должно Еозрасти в 2,5 раза (около 45 г вместо 18 г для крыс, 350 г вместо 140 г для кроликов, 6 кг вместо 2,4 кг для свиней).

Поджелудочная железа у самок в период кормления, следовательно, должна совершать значительную дополнительную работу и именно в этот период активность комплекса оказывается наиболее благотворной.

Например, с помощью единственного корма для беременных свиней млн кормящих грудь:о сэиней, имеющего содержание М.А.Т. 17%, добавление комплекса з дозе 120 U,A, HS I r корма позволяет достигать повышения на 25% веса отнятого от груди приплода на 21-й день: 54 кг вместо 43 кг (9,4 поросят по 5,7 кг вместо 9,1 поросенка по 4,7 кг).

В другом опыте, осуществленном в близких условиях, ко с отнятием от груди на 28-й день вместо 21-vo дня, увеличение вясз приплода также порядка величины, большей на 25%: 52 кг вместо 41 кг для 21-го дня

(9,7 поросят по 5,4 кг вместо 8,5 поросят по 4.8 кг) и 69 кг вместо 55 кг при отнятии от груди спустя 28 дней (9,7 поросят по 7,1 кг вмести 8,5 поросят по 6,5 кг).

Это повышение веса приплода происходит одновременно со снижением пищевого потребления, необходимого для поддержания свиней в хорошем состоянии, уменьшение которого в расчете на совокупность в

0 течение года составляет порядка 10% (около 1000 кг вместо 1100кг).

В период отнятия от груди молодые млекопитающие должны перейти от материнского молока к потреблению составных

5 кормов и их поджелудочная железа должна быстро адаптироваться к этой значительной перемене. Добавление комплекса в эти составленные корма тогда позволяет облегчать эту адаптацию. Например, с кормом

0 при отнятии от груди для поросят весом по 5 и 10 кг, имеющим содержание М.А.Т. 23%, добавление комплекса в дозе 120U.A. на 1 г корма позволяет достигать повышения на 15% среднего ежедневного прироста

5 (216 г вместо 188 г) и снижение на 15%

показателя потребления (1,59 вместо 1,83).

Как и в случае поросят, воздействие

комплекса в момент отнятия от груди может

быть значительным в случае крольчат и мо0 лодых жвачных животных (козлят, ягнят, те- лят). Для этих животных увеличение прироста среднего ежедневного веса под действием комплекса должно достигать 40% (47 г вместо 33 г в течение недели,

5 следующей за отнятием от груди пятинедельных кроликов, 797 г вместо 573 г в тече- ние месяца после отнятия от груди двухмесячных поросят).

Определение используемых предель0 ных доз. Для получения воспроизводимых высоких результатов комплекс должен использоваться в дозе, находящейся в относительно узком интервале, т.е. в дозе 40-160 U.A. на 1 г корма.

5В случае питания кормящих грудью свиней используемая доза составляет 120 U.A. на 1 г корма и увеличение веса приплода поросят при отнятии от груди на 21-й день составляет 25%, Если установить дозу в 200

0 U,A,/r, то увеличение веса происходит не более чем на 4%: 49 кг вместо 47 кг (8,2 поросят весом по 6,0 кг вместо 8,4 поросят по 5,6 кг).

Для питания поросят используемая до5 за составляет 120 U.A./r и улучшение зоотехнических результатов составляет 15%. Если эта доза зафиксирована на 200 U,A./r, то улучшение результатов становится нерегулярным, а лучшем случае она остается равной 15% спустя 3 недели опыта, но

становится равной нулю спустя 5 недель опыта.

Введение комплекса в корм животных в период беременности (например, свиноматкам или овцам) в дозе 200-400 г на 1 т корма позволяет увеличить приплоды (9,5 поросят в среднем вместо 9), а вес молодняка становится более регулярным (5,3 кг в среднем). Так, эксперимент, проведенный на ферме с двумя группами из 500 беременных евино- маток, одна группа которых (обработанная) получала энзиматический комплекс с кормом, показал, что: группа обработанных животных при опоросе дала 450 живых новорожденных вместо 335 у необработанных животных; в обработанной группе поросята в момент рождения весили на 10% больше, чем поросята от необработанных животных, а в конце месячного возраста их рост и состояние здоровья было лучше, чем у необра- ботанных животных.

Формула изобретения 1, Способ получения протеолитического комплекса, предназначенного для примене- ния в зоотехнике, предусматривающий культивирование Spteptomyces fradfae на

питательной среде, содержащей соевую муку, глюкозу, двузамещенную соль фосфорной кислоты, карбонат кальция и воду, до достижения заданной активности при 28°С и аэрации из расчета 0,3 обьема воздуха на 1 объем среды в 1 мин и оптимальном значении рН среды с последующим выделением целевого продукта фильтрованием, концентрированием и сушкой, отличаю- щи и с я тем, что, с целью повышения общей протеолитической активности за счет преобладания в комплексе протеаз типа I и обеспечения ускорения роста животных в процессе кормления или в период беременности, в качестве продуцента используют штамм Streptomyces fradlae ATCC 10745, концентрирование фильтрата ведут ультрафильтрацией с использованием мембраны на основе полисульфона, имеющей порог разделения 2-12000. а сушку проводят распылением.

2.Способ по п. 1, отличающийся тем. что рН среды поддерживают между 7 и 7,5.

3.Способ поп. 1, отличающийся тем, что процесс фильтрации ведут с использованием осветляющего агента.

Изобретение относится к биотехнологии и предназначено для применения в зоотехнике. Цель изобретения - повышение общей протеолитической активности за счет преобладания в комплексе протеаз типа I и обеспечения ускорения роста животных в процессе кормления или в период беременности. Способ получения протеолитическо- го комплекса заключается в культивировании штамма Streptomyces fradiae ATCC 10745, поддерживая рН куль- туральной среды 7-7.5, фильтрации в присутствии осветляющего агента, после этого ультрафильтрации через специфическую мембрану на основе полисульфона, имеющей порог разделения от 2 до 12000, распылительной сушке. Полученный протеолитический комплекс при его применении в зоотехнике стимулирует активность поджелудочной железы. 2 з.п ф-лы