ЛЕКАРСТВЕННЫЙ ПРЕПАРАТ ДЛЯ ОПТИМИЗАЦИИ ВЯЗКОСТИ СЛИЗИ И СТИМУЛИРОВАНИЯ ФУНКЦИИ КИШЕЧНИКА Российский патент 2003 года по МПК A61K35/74 A61K35/66 A61K38/46 C12N9/52 

Изобретение относится к области биологии и, более конкретно, к области клинической биохимии.

Данное изобретение относится к фармацевтическим и/или диетическим композициям на основе фермента или ферментного комплекса, содержащего данный фермент, которые могут способствовать профилактике и/или лечению заболеваний.

Более конкретно, оно относится к фармацевтическим композициям на основе фермента или ферментного комплекса, содержащего данный фермент, которые стимулируют функции кишечника и, таким образом, могут способствовать профилактике и/или лечению дегенеративных заболеваний, связанных со старением.

Изобретение, в частности, относится к фармацевтическим композициям, содержащим в качестве действующего начала один или несколько ферментов, выделенных из или содержащихся в ферментном комплексе, полученном с помощью культивирования Streptomyces fradiae в условиях, определенных в патенте Франции 2600340, принадлежащем Заявителю по данной заявке.

Указанный выше патент описывает получение и применение в зоотехнологии нового протеолитического комплекса, полученного из нитевидной бактерии Streptomyces fradiae; в дальнейшем данный комплекс именуется его текущим торговым названием PANSTIMASE^R.

Данная нитевидная бактерия способна одновременно продуцировать, по крайней мере, 5 протеиназ и 2 пептидазы; данные 7 ферментов были описаны K.Morihara et al. , (Biochem. Biophys. Acta, 1967, 139, 382). Будучи совместно добавленными в рацион, потребляемый животными, данные 7 ферментов вызывают чрезмерное снижение вязкости кишечной слизи и способны вызывать изъязвление стенки кишечника. Таким образом, будучи применены совместно, данные 7 ферментов обладают нежелательными эффектами в зоотехнологии.

В условиях, указанных в вышеупомянутом патенте, получают PANSTIMASE^R, который состоит лишь из 3 внеклеточных протеиназ с преобладанием одной из них, исключая внутриклеточные протеиназы и пептидазы. Будучи добавленным в рацион, потребляемый животными, PANSTIMASE^R вызывает умеренное снижение вязкости кишечной слизи и не способен оказывать агрессивное воздействие на стенку кишечника.

В то же время, оказывая относительно умеренное воздействие на белки кишечной слизи, PANSTIMASE^R оказывает более мощное воздействие на белки сырых продуктов, применяемых при составлении пищи, что улучшает их усвояемость.

В дополнение к данным непосредственным действиям в кишечнике, PANSTIMASE^R оказывает косвенное воздействие на различные органы, в частности на поджелудочную железу; как уже было указано в предшествующем патенте, было установлено, что его применение вызывает увеличение концентрации ферментов или проферментов в данном органе в размере от 50 до 80%.

Благодаря данным благоприятным эффектам PANSTIMASE^R применяют в настоящее время в качестве питательной добавки, добавляемой в рацион животных в целях улучшения их роста и продуктивности. Так, было обнаружено, что его применение также повышает сопротивляемость животных инфекционным заболеваниям бактериального или вирусного генеза, и что его применение сокращает определенные нежелательные эффекты старения.

Данные находки предполагали возможное применение в терапевтике применительно как к животным, так и к человеку, PANSTIMASE^R или активных ингредиентов, из которых он состоит, т.е. преобладающей внеклеточной протеиназы, продуцируемой Streptomyces fradiae, или смеси данной преобладающей внеклеточной протеиназы, по крайней мере, с одной из двух других внеклеточных протеиназ, продуцируемых Streptomyces fradiae.

Активные ингредиенты фармацевтических композиций требуют дополнительной очистки, сравнимой с таковой продукта, применяемого на животных. В условиях, описанных в предшествующем патенте, получают неочищенный PANSTIMASE^R, титр которого равен, по крайней мере, 2000 Е.А./мг.

Единица Anson (сокращенно Е. А.) определена здесь как количество фермента, которое, будучи инкубировано в течение 10 минут при 25^oС и при рН 7,5 в присутствии денатурированного гемоглобина, высвобождает из данного субстрата эквивалент 1 мкг тирозина, что определяют спектрофотометрически по поглощению при 280 нм на фильтрате, который не поддается осаждению трихлоруксусной кислотой.

Различное регулирование условий, описанных в предшествующем патенте, позволяет получать полуочищенный PANSTIMASE^R, титр которого равен, по меньшей мере, 4000 Е.А./мг. Традиционные методики фракционного осаждения или пропускания через колонку позволяют получать в чистом виде каждый из 3 белков, из которых состоит PANSTIMASE^R. Удельная активность преобладающей внеклеточной протеиназы составляет более, чем 100000 Е.А./мг и является значительно большей, чем таковая остальных 2 протеиназ; ее молекулярная масса составляет приблизительно 32 кДа, а ее изоэлектрическая точка составляет приблизительно 7,0.

Данная преобладающая протеиназа самостоятельно определяет основные физиологические свойства PANSTIMASE^R, в частности, благодаря тому, что она самостоятельно оказывает характерное воздействие на два важных белка: холерный энтеротоксин и коллаген.

Холерный энтеротоксин представляет собой гомолог ЛТ-токсина, продуцируемого некоторыми патогенными штаммами кишечной палочки; он состоит из субъединицы А, которая является агрессивной, и субъединицы В, которая является иммуногенной. При низкой концентрации, сравнимой с таковой в кишечнике животных, получающих пищу с добавлением PANSTIMASE^R, преобладающая протеиназа избирательно разрушает субъединицу А без разрушения субъединицы В, которая, таким образом, сохраняет способность к стимулированию иммунной системы.

Коллаген представляет собой наиболее распространенный белок среди животных: у млекопитающих различные типы коллагена составляют приблизительно одну треть от общего количества белка в организме. Известно, что растворимость мышечного коллагена в горячей воде является высокой, если его получают из молодых животных, и низкой, если его получают из старых животных.

Когда коллаген старых животных обрабатывают преобладающей протеиназой, его растворимость в горячей воде возрастает и становится сравнимой с таковой для молодых животных. Можно заключить, что данная протеиназа вызывает определенное "омоложение" коллагена.

Большинство результатов, полученных в исследованиях на животных, соответствуют исследованиям, проведенным с применением неочищенного или полуочищенного PANSTIMASE^R. В случае исследований на человеке, можно применить либо полуочищенный PANSTIMASE^R, либо очищенную протеиназу или протеиназы, из которых он состоит, т.е. преобладающую внеклеточную протеиназу либо смесь данной преобладающей внеклеточной протеиназы, по крайней мере, с одной из двух остальных внеклеточных протеиназ либо с протеиназой или с протеиназами, аминокислотные последовательности которых обладают, по крайней мере, 60% гомологией с таковой преобладающей внеклеточной протеиназы или с таковыми смеси протеиназ, как определено выше.

Настоящее изобретение относится к фармацевтическим и/или диетическим композициям, содержащим в качестве действующего начала преобладающую внеклеточную протеиназу, продуцируемую культурой Streptomyces fradiae, которая обладает удельной активностью, превышающей 100000 Е.А./мг, молекулярной массой, варьирующей от 30 до 36 кДа и, предпочтительно, составляющей приблизительно 32 кДа, и изоэлектрической точкой, составляющей приблизительно 7,0, и способна избирательно разрушать субъединицу А холерного энтеротоксина без разрушения субъединицы В, в виде смеси или в сочетании с инертным нетоксичным фармацевтически приемлемым наполнителем или носителем.

Настоящее изобретение также относится к фармацевтическим и/или диетическим композициям, содержащим в качестве действующего начала преобладающую внеклеточную протеиназу, как было определено, либо смесь данной преобладающей внеклеточной протеиназы, по крайней мере, с одной из двух остальных внеклеточных протеиназ, продуцируемых культурой Streptomyces fradiae, либо с протеиназой или с протеиназами, аминокислотные последовательности которых обладают, по крайней мере, 60% гомологией с таковой преобладающей внеклеточной протеиназы или с таковыми смеси протеиназ, как определено выше, в виде смеси или в сочетании с инертным нетоксичным фармацевтически приемлемым наполнителем или носителем. Гомологичные протеиназы могут представлять собой экстракты культур различных микроорганизмов и, в частности, Streptomyces fradiae или Streptomyces griseus.

Действующее начало вводят перорально, пульмонально или генитально в дозах, находящихся в интервале от 5000 до 100000 Е.А. Для этой цели действующее начало в виде смеси или в сочетании с традиционными наполнителями помещают в одну из фармацевтических форм, подходящих для данных типов введения.

В частности, действующее начало находится в одной из традиционных в фармакотехнологии форм, таких как таблетки, таблетки с покрытием, желатиновые капсулы, капсулы, порошки, растворы или суспензии, сухие аэрозоли, ovules и вагинальные таблетки.

Введение будет происходить от одного до трех раз в сутки, в зависимости от медицинских показаний.

Предполагается, что все результаты, полученные в исследованиях на животных, имеют то же самое происхождение: фундаментальное воздействие PANSTIMASE^R на кишечник; данное воздействие обладает различными аспектами, которые будут описаны далее.

Фармакологическое исследование фармацевтических композиций согласно изобретению. Воздействие PANSTIMASE^R на кишечник.

1 - Ворсинки.

Исследования, проводимые на относительно молодых крысах (в возрасте приблизительно 2 месяцев) с помощью фотонного микроскопа, показывают, что ворсинки претерпевают нормальное развитие как у контрольных крыс, так и у обрабатываемых крыс.

Данные исследования, проводимые на относительно пожилых крысах (в возрасте приблизительно 7 месяцев), показывают, что ворсинки у контрольных крыс атрофированы, тогда как у крыс, обрабатываемых со времени прекращения их молочного вскармливания в возрасте 4 недель, они настолько же развиты, как и у крыс в возрасте 2 месяцев. Таким образом, установлено, что применение PANSTIMASE^R вызывает определенное "омоложение" кишечника, ворсинки которого сохраняют свою исходящую способность к развитию и быстрой регенерации в течение более продолжительного периода времени.

Кишечник представляет собой не только физиологически неактивный фильтр; он также представляет собой крупнейшую из эндокринных желез (В. Leblank et al. , Rec. Med. Vet. 1981, 157, 629; K.Uvnas-Moberg, для Science, сентябрь 1989 года, 24). Будучи составлен небольшими клетками, которые быстро регенерируют в течение всей жизни, кишечник представляет собой орган с наибольшим содержанием нуклеиновых кислот: ДНК + РНК (G. Durand et al., Ann. Biol. Anim. Biosh. Biophys. 1966, 6, 389); таким образом, он обладает наибольшей потенциальной способностью к синтезу белка.

Исследование гистологических срезов кишечника указывает на то, что применение PANSTIMASE^R способствует лучшему проявлению данной потенциальной способности и, следовательно, большей продукции нескольких физиологически активных веществ: пищеварительных ферментов, гормонов (воздействующих на поджелудочную железу, печень, головной мозг), иммуноглобулинов, цитокинов, нейротрансмиттеров (например, VIP = вазоактивного пептида кишечника), факторов клеточного роста (или выживаемости). Таким образом, это объясняет, почему PANSTIMASE^R, который непосредственно воздействует на кишечник, способен косвенно воздействовать на органы и физиологические состояния, на которые оказывают влияние указанные выше соединения; так, это объясняет, в частности, его очевидное воздействие на поджелудочную железу (A. Estival et al., Communication at the Metabolism Conference of Nancy, 25-26 января 1979 года - University of Nancy I).

Кишечник также представляет собой орган с наибольшим содержанием иммунокомпетентных клеток, которые циркулируют в кровеносных сосудах и лимфатических сосудах или которые скапливаются и пролиферируют в пейеровых бляшках. Данные иммунокомпетентные клетки представляют собой компонент MALT (лимфоидной ткани, ассоциированной со слизистой), которая подразделяется на GALT, локализованную в кишечнике, и на BALT, локализованную в бронхах, и которая имеет аналогию с SALT, локализованную в коже. GALT и BALT являются взаимозависимыми и действуют в синергизме для обеспечения иммунной защиты слизистой и способствования защите организма в целом.

Исследование гистологических срезов кишечника указывает на то, что применение PANSTIMASE^R непосредственно стимулирует GALT; таким образом, он способен косвенно стимулировать общий иммунитет. Так, это объясняет тот факт, что применение PANSTIMASE^R повышает сопротивляемость животных инфекционным заболеваниям.

2 - Микроворсинки.

Исследования на крысах, как молодых, так и пожилых, под электронным микроскопом показывают, что микроворсинки у контрольных крыс покрыты чрезвычайно вязкой слизью и следами пищевых остатков; с другой стороны, у крыс, обрабатываемых PANSTIMASE^R, микроворсинки оказываются более чистые, высокие и многочисленные. Таким образом, применение PANSTIMASE^R способно увеличить общую развитую поверхность микроворсинок, т.е. их всасывающую способность.

Путем обработки фрагментов кишечника, взятого у контрольных крыс, PANSTIMASE^R in vitro было обнаружено, что можно было без нанесения повреждения микроворсинкам устранить покрывающую их чрезвычайно вязкую слизь; данное умеренное детергирующее действие может быть осуществлено за несколько минут.

In vivo данная очистка слизистой оболочки кишечника способствует более близкому контакту между возбудителями инфекционных заболеваний и данной слизистой, что может индуцировать профилерацию в кишечнике иммунокомпетентных клеток, способных бороться с данными микроорганизмами.

3 - Секреторные клетки и экзокринные микрожелезы.

Различные секреторные клетки (продуцирующие слизь, лизоцим, ...) и многочисленные экзокринные микрожелезы распространены по всему кишечнику, в просвет которого они выделяют значительные количества секретов (у человека приблизительно 2000 мл в сутки). Выделение этих секретов может быть ограничено или даже остановлено в результате образования слизистых микропробок.

Исследование гистологических срезов кишечника указывает на то, что применение PANSTIMASE^R дробит данные микропробки, восстанавливает нормальное отделение этих секретов и вызывает реактивное увеличение их продукции.

Известно, что слюна содержит фактор клеточного роста: эпителиальный ростовой фактор (EGF); кроме того, кишечные секреты могут содержать факторы роста, которые способны воздействовать на энтероциты, лимфоциты... Увеличение продукции таких факторов под действием PANSTIMASE^R может объяснить лучшее развитие ворсинок и GALT, обнаруженные на гистологических срезах кишечника обрабатываемых крыс.

4 - Пейеровы бляшки
Пейеровы бляшки, которые представляют собой скопления иммунокомпетентных клеток, распространенные по всей длине кишечника, более многочисленны у обрабатываемых крыс: у данных крыс их наличие определяется начиная с двенадцатиперстной кишки, а у контрольных крыс лишь начиная с тощей кишки; они также являются более плотными: лимфоциты, входящие в их состав, мельче, более компактны и производят впечатление более активных (они более интенсивно окрашиваются реагентами, применяемыми в гистологических исследованиях).

5 - Продолжительное отсутствие адгезии возбудителей инфекционных заболеваний
Применение PANSTIMASE^R противодействует длительной адгезии возбудителей инфекционных заболеваний на слизистую оболочку и, в частности, на слизистую оболочку кишечника.

Длительная адгезия является результатом образования химических связей между адгезинами, связанными с данными возбудителями инфекционных заболеваний, и их рецепторами, связанными со слизистой оболочкой: адгезины и рецепторы представляют собой (глико-липо) протеиновые комплексы.

Исследования in vitro показали, что PANSTIMASE^R, который обладает определенным сродством к протеиновым комплексам, способен разрезать спайки или отсоединять рецепторы от слизистой оболочки, с которой они связаны; зачастую возникает разрыв связи, что происходит за несколько десятков минут.

В дополнение к этому, PANSTIMASE^R способен стимулировать регенерацию кишечных ворсинок, т.е. элиминацию старых клеток, которые проявляют аномальные черты или подверглись адгезии возбудителей инфекционных заболеваний; данной элиминации способствует интенсификация отделения кишечных секретов, продукция которых усиливается под действием PANSTIMASE^R.

Можно заметить, что хотя первоначально PANSTIMASE^R может способствовать более тесному контакту между возбудителями инфекционных заболеваний и слизистой оболочкой кишечника (и индуцировать пролиферацию в кишечнике иммунокомпетентных клеток, способных бороться с данными микроорганизмами), он также способен далее препятствовать длительной адгезии данных микроорганизмов со слизистой оболочкой и их проникновению в нижележащие ткани.

6 - Разрушение белковых энтеротоксинов
При концентрации между 10 и 100 Е.А./мл и при нагревании до 37^oС в течение нескольких десятков минут PANSTIMASE^R разрушает некоторые белковые токсины и может, таким образом, способствовать профилактике и/или лечению диарей. Среди токсинов, подвергающихся разрушению PANSTIMASE^R, могут быть указаны ботулинический токсин, холерный энтеротоксин, ЛТ-токсин, продуцируемый патогенными штаммами кишечной палочки, некротизирующий цитотоксический фактор, также продуцируемый данными штаммами кишечной палочки.

В этих же условиях эндогенные протеиназы (трипсин, химотрипсин, ...) не разрушают данные токсины и, таким образом, не могут способствовать профилактике и/или лечению данных диарей.

В случае ЛТ-токсина PANSTIMASE^R разрушает субъединицу А, которая является агрессивной, без разрушения субъединицы В, которая является иммуногенной.

7 - Заключение
PANSTIMASE^R оказывает фундаментальное воздействие на весь кишечник, что стимулирует полное функционирование данного ключевого органа и, следовательно, всего организма; отсюда и широкое разнообразие примеров терапевтических применений.

Терапевтические применения фармацевтических композиций по данному изобретению
Фундаментальное воздействие PANSTIMASE^R на кишечник позволяет применять его или действующие начала, из которых он состоит, т.е. преобладающую внеклеточную протеиназу или смесь данной преобладающей внеклеточной протеиназы, по крайней мере, с одной из двух других внеклеточных протеиназ, для способствования профилактике и/или лечению заболеваний, которые будут рассмотрены далее.

1 - Муковисцидоз и респираторные заболевания
Муковисцидоз (cystic fibrosis) характеризуется избыточной секрецией слишком вязкой слизи в кишечнике и в бронхах. Все виды слизи относятся к одному и тому же типу биохимической структуры; следовательно, применение PANSTIMASE^R способно оптимизировать вязкость кишечной слизи, бронхиальной слизи или генитальной слизи.

Внеклеточная протеиназа или протеиназы по данному изобретению, либо протеиназа или протеиназы, аминокислотные последовательности которых обладают, по меньшей мере, 60% гомологией с таковыми внеклеточной протеиназы или протеиназ по данному изобретению, могут быть применены для приготовления лекарственного препарата, предназначенного для оптимизации вязкости кишечной, бронхиальной и/или генитальной слизи.

Внеклеточная протеиназа или протеиназы по данному изобретению, либо протеиназа или протеиназы, аминокислотные последовательности которых обладают, по крайней мере, 60% гомологией с таковыми внеклеточной протеиназы или протеиназ по данному изобретению, могут быть применены для приготовления лекарственного препарата, предназначенного для лечения муковисцидоза и заболевания, связанного с избыточной продукцией кишечной, бронхиальной и/или генитальной слизи, и, в частности, при условии, что она является чересчур вязкой.

2 - Улучшение всасывания и кровообращения
По причине своего умеренного детергирующего воздействия на стенку кишечника, PANSTIMASE^R способствует улучшению всасывания.

Данное улучшение всасывания может быть подтверждено с помощью анализа содержания лекарственных препаратов, вводимых перорально, в крови животных. Например, цыплятам через желудочный зонд вводили 50 мг тетрациклина без PANSTIMASE^R (контрольная группа) или в сочетании с 3 мг PANSTIMASE^R, имеющего титр 400 Е.А./мг, (обрабатываемая группа); через 2 часа после введения отбирали 2,5 мл крови, и было обнаружено, что средняя концентрация тетрациклина в сыворотке составляет 1,35 мкг/мл в контрольной группе и 1,90 мкг/мл в обрабатываемой группе.

Данное улучшение всасывания может быть более тщательно проанализировано с помощью определения содержания лекарственных препаратов в различных органах. Например, форели в течение 2 суток давали включающую в себя лекарственное соединение пищу, содержащую 4 г/кг окситетрациклина без добавления PANSTIMASE^R (контрольная группа) или с добавлением 300 мг/кг PANSTIMASE^R, имеющего титр 400 Е.А./мг, (обрабатываемая группа). Данных рыб затем забивали и анализировали содержание антибиотика в печени, мышцах и почках. Было обнаружено, что применение PANSTIMASE^R позволяет достичь значительного увеличения тканевой концентрации получаемого антибиотика, причем она варьирует в широких пределах в зависимости от интересующего органа:
+100% в печени, т.е. 5,75 мкг/г в обрабатываемой группе по сравнению с 2,5 мкг/г в контрольной группе,
+400% в мышцах, т.е. 1,75 мкг/г в обрабатываемой группе по сравнению с 0,3 мкг/г в контрольной группе,
+1000% в почках, т.е. 5,75 мкг/г в обрабатываемой группе по сравнению с 0,5 мкг/г в контрольной группе.

Создается впечатление, что PANSTIMASE^R вызывает лучшее всасывание окситетрациклина и лучшее распределение данного антибиотика во всем организме, что, видимо, подразумевает улучшение кровообращения.

Внеклеточная протеиназа или протеиназы по данному изобретению либо протеиназа или протеиназы, аминокислотные последовательности которых обладают, по крайней мере, 60% гомологией с таковыми внеклеточной протеиназы или протеиназ по данному изобретению, могут быть применены для приготовления лекарственного препарата, предназначенного для лечения мальабсорбции лекарственных препаратов или питательных веществ и для лечения расстройств кровообращения; в частности, лекарственный препарат предназначен для лечения истощения, встречающегося среди пожилых индивидуумов или пациентов, которые принимали лекарственные препараты, которые обладают вторичными эффектами, которые влияют на нормальное функционирование кишечника.

3 - Язвенная болезнь пищеварительной системы и энатеротоксемии
Язвенная болезнь пищеварительной системы возникает при адгезии на стенку желудка бактерии (Helicobacter pylori), a некоторые энтеротоксемии возникают при адгезии различных возбудителей инфекционных заболеваний на стенку кишечника.

PANSTIMASE^R препятствует длительной адгезии возбудителей инфекционных заболеваний на слизистую оболочку и разрушает многие энтеротоксины; таким образом, он может способствовать стимулированию регенерации кишечника и способен предотвращать и/или излечивать язвенную болезнь пищеварительной системы и энатеротоксемии.

Действительно, в промышленном животноводстве было установлено, что PANSTIMASE^R способен снижать количество свиней, страдающих язвенной болезнью пищеварительной системы, и смертность от энатеротоксемии.

Внеклеточная протеиназа или протеиназы по данному изобретению либо протеиназа или протеиназы, аминокислотные последовательности которых обладают, по крайней мере, 60% гомологией с таковыми внеклеточной протеиназы или протеиназ по данному изобретению, могут быть применены для приготовления лекарственного препарата, предназначенного для профилактики и/или лечения длительной адгезии возбудителей инфекционных заболеваний на слизистую оболочку, облегчения регенерации атрофированных или разрушенных ворсинок слизистой оболочки кишечника и профилактики и/или лечения язвенной болезни пищеварительной системы и энатеротоксемий.

4 - Сахарный диабет, состояния печеночной недостаточности и расстройства прохождения масс по кишечнику
В предшествующем патенте уже было сказано, что PANSTIMASE^R стимулировал экзокринную функцию поджелудочной железы; действительно, было обнаружено значительное увеличение концентрации всех проанализированных ферментов и проферментов в поджелудочной железе: +50% для амилазы, +70% для трипсиногена и химотрипсиногена, +80% для липазы (A.Estival et al., Communication at the Metabolism Conference of Nancy 25-26 января 1979 года - University of Nancy I).

Затем исследование гистологических срезов поджелудочной железы показало, что островки Лангерганса более многочисленны и чаще встречаются у обработанных крыс. Результаты данных исследований предполагают, что PANSTIMASE^R прежде всего стимулирует эндокринную функцию поджелудочной железы, следствием чего является общее улучшение белкового анаболизма, приводящее к последующему стимулированию ее экзокринной функции.

Данное стимулирующее воздействие, оказанное на поджелудочную железу, также оказывается и на печень, следствием чего является улучшение прохождения масс по кишечнику. В интенсивном животноводстве запоры часто наблюдаются у беременных свиноматок, содержащихся в стесненных условиях; было обнаружено, что добавление в их рацион PANSTIMASE^R позволяет избежать данных вредных нарушений прохождения масс по кишечнику.

Внеклеточная протеиназа или протеиназы по данному изобретению либо протеиназа или протеиназы, аминокислотные последовательности которых обладают, по крайней мере, 60% гомологией с таковыми внеклеточной протеиназы или протеиназ по данному изобретению, могут быть применены для приготовления лекарственного препарата, предназначенного для профилактики и/или лечения сахарного диабета, состояний печеночной недостаточности и расстройств прохождения масс по кишечнику.

5 - Инфекционные заболевания, дисфункции иммунной системы и вакцинация
Ранее уже было указано, что PANSTIMASE^R оказывает благоприятное действие на GALT и, следовательно, на иммунную систему в целом. Результатом этого являются улучшения в 3 различных областях.

А - Инфекционные заболевания
Некоторые наблюдения, сделанные в интенсивном животноводстве, показали, что применение PANSTIMASE^R зачастую улучшало состояние здоровья животных, что первоначально приписывали тому факту, что он облегчал всасывание антибиотиков, которые добавляются в большинство коммерческих кормов. Однако далее было обнаружено, что данное улучшение являлось особенно значительным в случаях инфекционных заболеваний, вызванных различными вирусами, тогда как они в основном нечувствительны к действию антибиотиков. Данные находки относятся к гриппу и ложному бешенству у свиней, болезни Gumboro у цыплят и эктиме у коз.

В данном последнем случае вирусная инфекция, обнаруженная в ходе эксперимента на экспериментальной станции, являлась предметом тщательного исследования на 120 козах в общей сложности; поражены были 34% контрольной группы и 70% обрабатываемой группы; процент тяжело пораженных животных составлял 28% контрольной группы, тогда как в обрабатываемой группе тяжело пораженные животные отсутствовали.

Данное противовирусное действие может быть объяснено тем фактом, что применение PANSTIMASE^R способствовало увеличению числа и плотности пейеровых бляшек, которые представляют собой скопления иммунокомпетентных клеток, распределенных по всей длине кишечника.

Б - Дисфункции иммунной системы
Другие наблюдения, сделанные на поросятах в интенсивном животноводстве, показали, что применение PANSTIMASE^R снижало длительность артрита, который представляет собой воспалительную реакцию, являющуюся следствием повреждений суставов, которым подвержены животные, выращиваемые на металлических решетках. После заживления повреждений данные воспалительные реакции могут прогрессивно ослабляться под действием так называемых супрессирующих иммунокомпетентных клеток, которые являются многочисленными в кишечнике и которые способны мигрировать в зоны воспаления. Возможно PANSTIMASE^R стимулирует размножение данных клеток в кишечнике и, таким образом, облегчает их миграцию, что может объяснить тот факт, что его применение снижает продолжительность артрита приблизительно на 50%.

В - Вакцинации
Улучшение состояния здоровья, наблюдаемое в интенсивном животноводстве, может быть объяснено более выраженным ответом на вакцинации у животных, получающих пищу с добавлением PANSTIMASE^R. Предварительные лабораторные исследования на мышах эффективно подтвердили, что применение PANSTIMASE^R способно увеличить эффективность вакцинаций, в частности, если их проводят перорально.

Внеклеточная протеиназа или протеиназы по данному изобретению либо протеиназа или протеиназы, аминокислотные последовательности которых обладают, по крайней мере, 60% гомологией с таковыми внеклеточной протеиназы или протеиназ по данному изобретению, могут быть применены для приготовления лекарственного препарата, предназначенного для профилактики и/или лечения инфекционных заболеваний и дисфункций иммунной системы и для увеличения эффективности вакцинаций.

6 - Состояния гормональной недостаточности и дегенеративные заболевания, связанные со старением
Было обнаружено, что у пожилых репродуктивных свиней применение PANSTIMASE^R вызывает сокращение периода течки (lining interval) между прекращением молочного вскармливания и оплодотворением (который стремится к увеличению у свиноматок) и стимуляцию полового влечения (которое стремится к снижению у боровов). Таким образом, очевидно, применение PANSTIMASE^R позволяет излечивать состояния гормональной недостаточности и, возможно, другие нежелательные эффекты, возникающие в результате старения.

Было обнаружено, что применение PANSTIMASE^R вызывает "омоложение" пожилых репродуктивных самок крыс и сокращение нежелательных эффектов старения у пожилых репродуктивных свиноматок и кур.

А. Первый период течки самки крысы обычно наступает в возрасте приблизительно 70 суток; когда это происходит в возрасте приблизительно 140 суток, репродуктивные способности контрольной группы являются скудными и лучшими в обрабатываемой группе (получающей ту же пищу с добавлением 300 мг/кг PANSTIMASE^R, имеющего титр 400 Е.А./мг) - см. таблицу 1.

Было обнаружено, что контрольные самки крыс, у которых период течки наблюдался в возрасте 140 сут, показывают неудовлетворительные результаты, а обрабатываемые самки крыс в том же возрасте показывают результаты, стремящиеся к нормальным результатам, показанным контрольными самками крыс в возрасте 70 сут. , и даже сравниваются с ними в случае уровня перинатальной смертности. Таким образом, можно заявить, что PANSTIMASE^R вызывал "омоложение" самок крыс в возрасте 140 сут.

Б. Репродуктивных свиноматок выводят из репродуктивного цикла, когда они находятся в "плохом состоянии", например, когда животновод считает, что они не могут больше устойчиво стоять, равно как и аккуратно ложиться (вместо того, чтобы резко падать, рискуя при этом раздавить новорожденных поросят). В стаде в 80 свиноматок до применения PANSTIMASE^R свиноматок выводили из репродуктивного цикла в среднем после 4,4 репродуктивных циклов; через шесть месяцев его применения было установлено, что свиноматок можно выводить из репродуктивного цикла в среднем после 5,8 репродуктивных циклов.

Таким образом, можно считать, что применение PANSTIMASE^R позволило продлить продуктивную жизнь свиноматок на 30% без каких-либо неприемлемых изменений их "хорошего состояния" и их производительности.

Во время старения у куриц-наседок имеется тенденция к откладыванию яиц, которые обладают более хрупкой скорлупой, так что процент битых яиц в конце насиживания может превысить 10%. Применение PANSTIMASE^R позволило сократить данное процентное соотношение наполовину, что означает стимулирование фосфорно-кальциевого метаболизма.

Внеклеточная протеиназа или протеиназы по данному изобретению либо протеиназа или протеиназы, аминокислотные последовательности которых обладают, по крайней мере, 60% гомологией с таковыми внеклеточной протеиназы или протеиназ по данному изобретению, могут быть применены для приготовления лекарственного препарата, предназначенного для профилактики и/или лечения состояний гормональной недостаточности и дегенеративных заболеваний, связанных со старением, например, артрита, артроза и остеопороза.

Предварительная оценка переносимости фармацевтических композиций по данному изобретению
Токсикологические исследования показали, что PANSTIMASE^R оказался не токсичен по отношению к поросятам при введении в течение 1 месяца в дозе в 20 раз превышающей рекомендуемую для применения текущую дозу, которая составляет 40000 Е.А. на кг пищи, и не токсичен по отношению к крысам при введении в течение 3 месяцев в дозе, в 200 раз превышающей данную дозу.

Следовательно, было возможно провести предварительное исследование на переносимость человеком в дозе, которая относительно выше по отношению к рассмотренной в настоящей заявке дозе; действительно, применяли желатиновые капсулы, содержащие 750000 Е.А. очищенного PANSTIMASE^R (т.е. порции в 50 мг, имеющей титр 15000 Е.А./мг), причем их вводили пациентам в количестве от 2 до 3 капсул в сутки в течение от 2 до 3 недель.

Были выбраны 24 пациента (12 мужчин - 12 женщин) в среднем возрасте 44 лет, причем крайние возраста составляли 25 и 70 лет; 17 из данных пациентов страдали диспепсией в самом широком смысле данного термина без каких-либо определяемых параклиническими исследованиями (лабораторными исследованиями, рентгеноскопией, в некоторых случаях эндоскопией) органических повреждений; у 7 пациентов имелись органические повреждения; 3 - повреждения поджелудочной железы, 2 - гастрэктомия (у одного по причине язвенной болезни, у другого по причине новообразования), 2 - колонэктомия (у одного по причине язвенного геморрагического ректоколита, у другого по причине новообразования). Ход изменения симптомов и массы тела при ее недостаточности, с наличием или в отсутствие истощения, присутствующего в начале лечения, изучали на всех данных 24 пациентах. Несколько субъектов сообщили об улучшении, связанном с улучшением прохождения масс по кишечнику в случаях запора или, с другой стороны, диареи, и с увеличением массы тела в случаях истощения.

Предварительное исследование также проводили при муковисцидозе у пациентов в возрасте 18 лет, которые получали 2 желатиновые капсулы, причем каждая содержала 10000 Е.А. PANSTIMASE^R, ежедневно в течение 3 недель; улучшение симптоматики было обнаружено в области кишечника (кал менее обильный и менее вязкий) и в области бронхов (отхаркивание более легкое и менее частое).

В заключение можно сказать, что PANSTIMASE^R переносился удовлетворительно, и что он, очевидно, особенно эффективен в случаях истощения.

Внеклеточная протеиназа или протеиназы по данному изобретению либо протеиназа или протеиназы, аминокислотные последовательности которых обладают, по крайней мере, 60% гомологией с таковыми внеклеточной протеиназы или протеиназ по данному изобретению, могут быть применены для приготовления диетической композиции для питания ослабленных или истощенных индивидуумов.

Изобретение может быть использовано в медицине и более конкретно в области клинической биохимии и касается фармацевтических композиций, содержащих в качестве активного ингредиента фермент или ферментный комплекс, содержащий указанный фермент, полученный с помощью культивирования Streptomyces fradiae в виде смеси или в сочетании с инертным нетоксичным фармацевтически приемлемым носителем или вектором. Указанные фармацевтические композиции являются применимыми для профилактики или лечения дегенеративных заболеваний, особенно связанных с нарушением функции кишечника. 5 с.п. ф-лы, 1 табл.

1. Применение внеклеточных протеиназ, содержащих в качестве активного ингредиента преобладающую внеклеточную протеиназу типа II, продуцируемую Streptomyces fradiae, или смесь названной протеиназы с по меньшей мере одной из двух других внеклеточных протеиназ, продуцируемых Streptomyces fradiae, или одну, или несколько протеиназ, аминокислотная последовательность которых по меньшей мере на 60% совпадает с аминокислотной последовательностью преобладающей внеклеточной протеиназы или с аминокислотной последовательностью смеси внеклеточных протеиназ, в смеси или в сочетании с инертным, нетоксичным, физиологически приемлемым носителем или экципиентом, для получения медикамента, предназначенного для предупреждения и/или лечения нарушений транзита через кишечник, длительной связи инфекционных микроорганизмов со слизистой, для облегчения регенерации ворсинок слизи кишечника, а также для предупреждения и/или лечения язвенных болезней пищеварительного тракта и энтеротоксемий, при одновременном обеспечении регуляции секреции интестинальной, бронхиальной или генитальной слизи. 2. Применение внеклеточных протеиназ, содержащих в качестве активного ингредиента преобладающую внеклеточную протеиназу типа II, продуцируемую Streptomyces fradiae, или смесь названной протеиназы с по меньшей мере одной из двух других внеклеточных протеиназ, продуцируемых Streptomyces fradiae, или одну, или несколько протеиназ, аминокислотная последовательность которых по меньшей мере на 60% совпадает с аминокислотной последовательностью преобладающей внеклеточной протеиназы или с аминокислотной последовательностью смеси внеклеточных протеиназ, в смеси или в сочетании с инертным, нетоксичным, физиологически приемлемым носителем или экципиентом, для получения медикамента, предназначенного для предупреждения и/или лечения нарушений деятельности поджелудочной железы и печеночной недостаточности. 3. Применение внеклеточных протеиназ, содержащих в качестве активного ингредиента преобладающую внеклеточную протеиназу типа II, продуцируемую Streptomyces fradiae, или смесь названной протеиназы с по меньшей мере одной из двух других внеклеточных протеиназ, продуцируемых Streptomyces fradiae, или одну, или несколько протеиназ, аминокислотная последовательность которых по меньшей мере на 60% совпадает с аминокислотной последовательностью преобладающей внеклеточной протеиназы или с аминокислотной последовательностью смеси внеклеточных протеиназ, в смеси или в сочетании с инертным, нетоксичным, физиологически приемлемым носителем или экципиентом, для получения медикамента, предназначенного для предупреждения и/или лечения инфекционных заболеваний, дисфункций иммунной системы, а также для повышения эффективности вакцинаций. 4. Применение внеклеточных протеиназ, содержащих в качестве активного ингредиента преобладающую внеклеточную протеиназу типа II, продуцируемую Streptomyces fradiae, или смесь названной протеиназы с по меньшей мере одной из двух других внеклеточных протеиназ, продуцируемых Streptomyces fradiae, или одну, или несколько протеиназ, аминокислотная последовательность которых по меньшей мере на 60% совпадает с аминокислотной последовательностью преобладающей внеклеточной протеиназы или с аминокислотной последовательностью смеси внеклеточных протеиназ, в смеси или в сочетании с инертным, нетоксичным, физиологически приемлемым носителем или экципиентом, для получения медикамента, предназначенного для предупреждения и/или лечения гормональной недостаточности и дегенеративных заболеваний, связанных со старением. 5. Применение внеклеточных протеиназ, содержащих в качестве активного ингредиента преобладающую внеклеточную протеиназу типа II, продуцируемую Streptomyces fradiae, или смесь названной протеиназы с по меньшей мере одной из двух других внеклеточных протеиназ, продуцируемых Streptomyces fradiae, или одну, или несколько протеиназ, аминокислотная последовательность которых по меньшей мере на 60% совпадает с аминокислотной последовательностью преобладающей внеклеточной протеиназы или с аминокислотной последовательностью смеси внеклеточных протеиназ, в смеси или в сочетании с инертным, нетоксичным, физиологически приемлемым носителем или экципиентом, для получения диетической композиции для питания ослабленных или истощенных пациентов.