Штамм бактерий АсетовастеR асетI SUвSр.oRLea NeNSIS - продуцент уксуса и способ производства уксуса Советский патент 1992 года по МПК C12N1/20 C12J1/04 C12N1/20 C12R1/02 

Изобретение относится к биотехнологии и касается получения нового штамма бактерий - продуцента уксуса и способа производства уксуса.

Известен штамм уксусно-кислых бактерий Acetobacter aceti. обычно применяемый для производства уксуса 1,

Недостатками этого штамма являются неспособность окислять этиловый спирт при содержании его в питательной среде в концентрации выше 6% и получение уксуса низкой концентрации.

Известен способ производства уксуса, предусматривающий предварительное

сбраживание сырья и окисление его уксус- но-кислыми бактериями 2.

Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому является способ производства уксуса, предусматривающий окисление спирта, содержащегося в исходном сырье, уксусно-кислыми бактериями 9 две стадии с отбором уксуса в качестве готового продукта 3.

Однако в известном способе окисление осуществляется малоэффективным штаммом уксусно-кислых бактерий и на производство уксуса подают уже предварительно сброженный сок, содержащий определенное количество спирта, который дополниVI

О

VI о VI

ю

тельно доспиртовывают для окисления у к сус но-кисл ыми бактериями. Этот предварительно сброженный сок при транспортировке и хранении теряет спирт и биологически активные компоненты, образованные в процессе жизнедеятельности дрожжей. Кроме того, происходит инфици- рование сока, что требует перед использованием в производстве предварительной технологической обработки: обработка бентонитом, осветление, фильтрация, пастеризация.

Целью изобретения является получение штамма бактерий Acetobacter acetl subsp. orleanensls ВКПМ В-4576, способного окислять высокие концентрации этилового спирта до уксусной кислоты, и повышение эффективности процесса за счет упрощения его технологии и увеличения концентрации уксусной кислоты.

Штамм селекционирован из производственного штамма Acetobacter acetl ВКПМ В-3406 путем последовательной адаптации к росту на высоких концентрациях этилового спирта.

Производственный штамм Acetobacter acetl выделен из окислителей уксусного цеха. Для этого суспензию культуры, содержащей 1,0 х1012 клеток в 1 мл, рассеивают на твердую питательную среду, содержащую 4 об.% спирта. После инкубирования в течение суток при 30°С выросшие колонии в риде суспензии высевают на сусло-огар с 5 c5.°k спирта. После инкубации в течение 2 сут выросшие колонии рассевают на ту же средусбоб.% спи рта. Та кие последователь- ,- ые операции повторяют до тех пор, пока не получены колонии, способные расти на твердой среде с концентрацией спирта 10 об.%.

Для определения кислотообразующей активности селекционированной культуры, адаптированной к высокому содержанию спирта, проводят выращивание ее в жидкой среде следующего состава:

Сброженный яблочный сок с содержанием спирта 10 об.%

(NH4)2HPCMO,2%

Выращивание осуществляют при 30°С. Кислотообразующую активность бактерий в отношении накопления уксусной кислоты определяют методом титрования 0.1 н. NaOH. Через 95 ч культивирования получают уксус с концентрацией 9.5%. Выход продукта 95% от использованного субстрата.

Таким образом, путем последовательной адаптации к высокому содержанию этилового спирта в среде селекционирована культура, обладающая признаком стабильной устойчивости к высоким концентрациям спирта.

Штамм хранят в ампулах в лиофилизи- рованном состоянии и на агаризованном яблочном соке.

Штамм имеет следующую характеристику.

Культурально-морфологмческие признаки. Трехдневная культура на жидком и ризованном сусле представлена палочко- видными, слегка округленными клетками размером (1.0 - 3,0X0.2 -0.6) мкм. Молодые клетки грамотрицательные, старые - грам- ваоиабельные. Среда № 1: пивное сусло

5 7°Б; агар-агар 2%; рН-4,5. Среда N 2; дрожжевая вода (0,5% сухих веществ); агар-агар 2%; рН 4,5. Из всех указанных средах (выращивание в течение 3 сут при 30°С) рост поверхностный, колонии округлой формы,

0 поверхность их гладкая, маслянистая, профиль выпуклым, края ровные, консистенция слизистая, кремоватого цвета, не флуоресцируют, пигмент не выделяют. Размеры колоний в пределах 0,3 - 0,5 мм.

5 Физиолого-биохимические признаки.

Отношение к источникам углерода; использует этиловый, пропиловый спирты, уксусную, пропионовую и молочную кислоты, глицерин. При кислом рН (4,5) способен

0 окислять глюкозу. Фруктозу и сахарозу. При окислении глицерина образует дигидроск,- сиацегон. Отношение к источникам азота: испс/.ьс/ет иммснийный азот; на нитратах не растет. Молоко не коагулирует. Желатину

5 не разжижает. R витаминах не нуждается. Строгий аэроб. Растет в диапазоне от 5 до 40°С. оптимум 30°С. Диапазон рН для роста 2 - Р.З, оптимум 4,0.

Способ осуществляют следующим обра0 зом.

На первой стадии осуществляют сбра- живачие сырья спиртовыми дрожжами до накопления спирта 11,0 - 11,5%, затем снижают рН подкислением среды до 3,0 - 3,5 и

5 вводят штамм уксусно-кислых бактерий, осуществляя на этой стадии окисление спирта. В качестве питательной среды можно использовать фильтрат молочной сыворотки с содержанием лактозы 15% и

0 коцентрированный виноградный сок, содержащий 40% сахара.

Впервые в предлагаемом способе процессы образования спирта и его окисление ведут в едином потоке, в одном ферментере

5 при определенном значении рН, регулятором которого являются спиртовые дрожжи и высокоэффективный штамм уксусно-кислых бактерий. Это исключает все дополнительные операции, а главное - совмещение этих процессов позволяет обогатить питательную среду продуктами жизнедеятельности дрожжей (растворимый белок, амино- киЈлоты, витамины и так далее). Снижение рН среды приводит к ингибированию метаболизма дрожжей, быстрейшему их автолизу и поступлению содержимого клеток в среду (цитоплазматические и митохондриальные ферменты, липиды, белковые структуры, ДНК, РНК и так далее), откуда они используются уксусно-кислыми бактериями.

Таким образом, в едином процессе получается полноценная питательная среда для развития уксусно-кислых бактерий при регулировании рН среды самими микроорганизмами. В предлагаемом способе спиртовые дрожжи и уксусно-кислые бактерии выступают как регуляторы рН с одновременным обобщением среды биологически ценными веществами и накоплением целевого продукта.

При сбрэживзнии сырья до концентрации спирта 11 - 11,5 об.% рН возрастает до 6,0 - 6,5, при котором штамм уксусно-кислых бактерий Acetobacter acetl subsp.orleanensis ВКПМ В-4576 развиваться не может, однако такая концентрация спирта является оптимальной для окисления в уксусную кислоту. Оптимальным рН для развития штамма и его активной кислотообразующей деятельности является 3.0 - 3,5, поэтому и проводят снижение рН сброжен- ных дрожжами растворов.

Если сбрзжипание вести до меньшей концентрации спирта (10 - 10 5%). то в среду надо добавлять этиловый спир для окисления его в уксус.

В табл. 1 приведены данные зависимости выхода продукта и его концентрации от значений рН при концентрации спирта в сбрсженном сырье 11 - 11,5 об.%.

Таким образом, при значениях рН среды ниже 40 наблюдается повышенный выход уксусной кислоты,

В табл. 2 приведены сравнительные данные предлагаемого и известного способов.

Пример 1. Концентрированный виноградный сок, содержащий 40% сахара, разводят стерильной водопроводной водой до концентрации сахара 15% и заполняют ферментер объемом 10 л, коэффициент заполнения 0,75. Исходное значение рН среды 4.0.

В среду вводят культуру спиртовых дрожжей Saccharomyces cerevlsiae раса 12 и при 30°С осуществляют брожение в анаэробных условиях при перемешивании среды (500 об/мин) в течение 3 сут до накопления 11,5 об.% этилового спирта,

при этом рН сброженного еокл повышается до 6,5. Добавлением серной кислоты снижают рН до 3.5 и вводят штамм уксусно-кислых бактерий Acetobacter acetl subsp.orleanensis ВК.ПМ В-4576. После четырех суток культивирования в условиях постоянного перемешивания (1000 оС/мин) и аэрирования (0,3 об/об среды, мин) среды получают уксус концентрацией 10,8%. Выход продукта составляет 93,9% от использованного источника углерода.

Пример 2, Аналогично примеру 1 ведут процесс ображивания Сахаров до спирта, проводя процесс до накопления 11

об.% спирта. Затем величину рН сброжен- ного сока серной кислотой до 3,2. После культивирования уксусно-кислых бактерий получают уксус концентрацией 10,9%. Выход продукта 94.8%.

ПримерЗ. В качестве сырья для получения спирта используют фильтрат молочной сыворотки с содержанием лактозы 15% и исходным рН 4,8. Процесс сбражива- ния лактозы проводят по примеру 1. По мере

накопления спирта до 11,5 об.% рН сбро- женной сыворотки возрастает до 6,0. После снижений рН до 3.0 вносят культуру уксус- но-хислых бактерий Acetobacter aceil subsp.orleanensis ВКПМ Б-4576 и проводи

окисление спирта в аэрируемых услогиях до получения уксуса концентрацией 10,6%. Выход продукта составляет 92,2%.. Формула изобретен и я

1. Штамм бактерий Acetobacter aceti subsp.orleanensis БКПМ В-4575 - продуцент уксуса.

2. Способ производства уксуса, предусматривающий окисление этилового спирта, содержащегося з исходном сырье, в две стэдни с использованием уксусно-кислых бактерий Acetobacter aceti с последующим отбором на второй стадии конечного продукта, отличающийся тем, что, с целью повышения эффективности процесса за счет

упрощения его технологии и увеличения концентрации уксусной кислоты, на первой стадии осуществляют сбраживание сырья спиртовыми дрожжами Saccharomyces cerevisiae расэ-12 до накопление в среде 11,0

- 11,5 об.% этилового спирта, снижают рН среды до 3,0 - 3,5, а на второй стадии для окисления этилового спирта используют штамм бактерий Acetobacter acetl subsp.orleanensis ВКПМ В-4576.

3. Способ по п. 2. отличающийся тем, что в качестве сырья используют виноградный сок или фильтрат молочной сыворотки с содержанием сахара не менее 15%.

Т а б л и ц а 1

Изобретение относится к биотехнологии и касается получения нового штамма бактерий - продуцента уксуса и способа производства уксуса. Целью изобретения является получение штамма бактерий Acetobacter aceti subsp.orleanensis ВКПМ- В-4576, способного окислять высокие концентрации этилового спирта до уксусной кислоты, и повышение эффективности процесса за счет упрощения его технологии и увеличение концентрации уксусной кислоты. Штамм способен окислять до 11 - 11,5% спирта в среде, при этом выход продукта от потребленного субстрата составляет до 95%. Способ заключается в следующем. На первой стадии осуществляют сбраживание сырья спиртовыми дрожжами SaccharcMyces cerevisiae раса 12 до накопления спирта 11,0- 11.5 об.% Затем рН снижают до 3,0- 3,5. вводят штамм бактерий A.aceti ВКПМ В-4576 и осуществляют окисление спирта. Конечная концентрация уксусной кислоты в среде до 10 - 11%. Выход продукта 92 - 95%. 2 с. и 1 з.п.ф-лы. 2 табл. 00 с

Рост бактерий и кислотообразования отсутствуют.

Показатели

Известный способ

8,0-8.2 88,8-91,1

Перед использованием в производстве уксуса сбро- женный сок обрабатывают 0,2% бентонита, пастеризуют при 85°С, фильтруют и до- спиртовывают до крепости 9об.%

Таблица 2

Предлагаемый способ

10.6-10.9 92,2-94,8