Способ получения меченных @ Т @ моноклональных антител Советский патент 1992 года по МПК A61K43/00 

Изобретение относится к медицине, а именно к радиоиммунологии, и каса-г ется способа получения меченных WwТс моноклональных антител.

Целью изобретения является повы-- шение качества введения метки.

. . ч П р и м е р 1. 20 г направленного против карцино-эмбрионального анти- гена (СЕА) моноклонального антитела BW431/31, которое находит применение для диагностического 9бнаружения колоректальных карцином, при комнатной температуре путем диализа освобождают от добавок (таких как сахароза) и переводят в изотонический раствор хлорида натрия.

Имеющееся затем в концентрации примерно 5 мг/мл антитело вводят во взаимодействие с 20 мг 2-меркапто- этанола при комнатной температуре (30 мин) и после этого путем гель- фильтрации на биогеле Р-2, полиакрил-; амидном геле фирмы БИО РАД, отделяют от избыточного восстановителя. ; Растворенное 8 0,02 М фосфатном буфере (рН 7,2) антитело сразу отделяют и лиофилизируют. Высушенные путем вымораживания пробы содержат на дозировку 2 мг антитела и примерно 1,4мг динатрийгидрофосфата.

Для мечения технецием-99ш пробы вводят во взаимодействие с 7,5 мл раствора пертехнетата (примерно

HI

о сд

ч

сц

30 DO MBq). В качестве олово-11-компо- ненты используется лиофилизированная метящая единица, состоящая из 5 мг натриевой соли 3 3 дифосфонопропио- новой кислоты, 0,1 мг катионов оло- ва-II и 0,5 мг Ы-(«-аминобензоил)-1- глутаминовой кислоты. Эту смесь растворяют в 5 мл физиологического раствора хлорида натрия и затем добавляют (спустя 1 мин) 0,5 мл этого раствора к раствору антитела до общего объема 8 мл. После 10-минутной реакции путем тонкослойной хроматографии, гель-фильтрации на биогеле Р-10 и жидкостной хроматографии высокого давления на Zorbax GF-250 фирмы Дюпон опоеделяют выход меченного тТс антитела ,в которой свыше 95% технеД

но мкг Snz1) этого раствора бавляют к антителу, которое пред тельно растворено примерно в 8 м раствора пертехнетата (примерно 2000 MBq). После 10-минутной реа ции 0,1 мл раствора следующего с тава, мкг: mab 25, 2,25, во-11 0,175, буфер , ввод Ю внутривенно здоровым крысам. Рас деление по органам спустя 2k ч п инъекции показано в табл.2.

Из данных табл.2 следует, что 15 накопления в костях, щитовидной лезе и желудке очень незначитель а в остальных -органах меченные и 131 антитела сравнимы. Для иммун реактивности (см.табл.1) в случа

ция-99м связывается с протеином,пример-го меченного технецием-99т антитела

BW494/32 измерено более высокое чение, чем в случае мечения иодо 131 или индием-III.

но 1 % находится в виде связанных с фосфонатом частей и менее 1% пертехнетата. Доля пертех:;етзта снова возрастает лишь при более продолжительном периоде выдерживания, спустя 6 ч приблизительно составляет 2%, в то время как связанная с фосфонатом часть остается неизменной (1-%).

Определение иммунореактивной доли в различных меченных технецием 99м антителах путем измерения связывания с клетками опухолей даст хорош совпадающие значения для иммунореактив- ности с соответствующими меченными, иодом-131 и индием-Ill СЕА-антитёяа- ми,

данные приведены в табл.1. П р и м е р 2. Для мечения

Тс

направленного против ассоциированного с карциномой поджелудочной железы Mucus-антигена, моноклонального антитела BW494/32, 20мг этого вещества, растворённые в 2мл изотонического раствора хлорида натрия, инкубируют с 0,5 мл 1%-ного водного раствора цис- теамингидрохлориде а течение 20 мин при комнатной температуре. Очищенное с помощью колоночной хроматографии модифицированное антитело, растворенД

1657

но мкг Snz1) этого раствора добавляют к антителу, которое предварительно растворено примерно в 8 мл раствора пертехнетата (примерно 2000 MBq). После 10-минутной реакции 0,1 мл раствора следующего состава, мкг: mab 25, 2,25, оло- во-11 0,175, буфер , вводят Ю внутривенно здоровым крысам. Распределение по органам спустя 2k ч после инъекции показано в табл.2.

Из данных табл.2 следует, что накопления в костях, щитовидной железе и желудке очень незначительные, а в остальных -органах меченные иодом- 131 антитела сравнимы. Для иммуно- реактивности (см.табл.1) в случае

го меченного технецием-99т антитела

25

30

35

40

45

BW494/32 измерено более высокое значение, чем в случае мечения иодом- 131 или индием-III.

П-р и м е р 3. 50 мг также направ-- ленного против СЕА моноклонального антитела BW431/26 частично восстанавливают путем обработки 2-меркапто- этанолом, очищают и лиофилизируют в дозах по 2 мг в присутствии фосфатного буфера (рН ).

Мечение Тс осуществляют с помощью используемой обычно для сцин- тиграфии печени метящей единицы, состоящей из 13,5 мг тетранатриевой соли 1 ,1,3,3 пРРпантетрафосфоновой кислоты.-и 0,6 мг хлорида олова-И 2 НгО.

Содержимое метящей единицы раст-. воряют в 10.мл изотонического раствора NaCl и 0,5 мл (15 мкг Sri2-) добавляют к лиофилизированному антителу. Затем раствор пертехнетата (3300 MB q) добавляют к прозрачному раствору антитело - соло олова-1Г и меченное технецием-99т антитело вводят внутривенно безврлосым мышам с имплантированной человеческой карциномой толстой кишки. Сцинтиграфичес- ки опухоль определяют спустя ч

Изобретение относится к радиоиммунологии и касается способа получения меченных Тс моноклональных антител. Целью изобретения является повышение качества введения метки. Смешивают 9тТс пертехнетат и раствор предварительно обработанного моноклонального антитела или их F(ab -фрагмента в присутствии солей олова-11.В качестве солей оло- -ва-П используют соли олова-11 Метанди- фосфоновой кислоты или 3 3-ДифоСфонопро пионовой кислоты, или 3,3-Дифосфоно1- 1,2-пропандикарбоновой кислоты или пропан-1,1,3,3-тетрафосфоновой или пирофосфоновой кислоты. На 1 мг белка антитела добавляют 5-Ю мкг соли олова-II. Использование предлагаемого способа позволит повысить прочность мечения 9|ЯТс моноклональных антител или их F(ab )2-Фрагментов. 3 табл.

ное в 0,02 М буферном растворе NaЈHP04,j0 после инъекции. В табл.3 приведены

лиофилиэируют порциями по 2 мг. В качестве олово-II-компоненты для ,мечения технецием антитела используют метящий набор с пирофосфатом, который сожержит 7,2 мг Na4P407 и 1,03 мг хлорида олова-II на набор. Содержимое дозировки (упаковки) растворяют в 10 мл физиологического раствора хлорида натрия и 0,25 мл (пример55

данные о накоплении .в опухоли и распределении по органам 1-131, In-III и Tc-99m - mab 431/26 в безволосых мышах () с человеческой карциномой толстой кишки в зависимости от времени.

П р и м- е р Ч. 0 мг F( мента моноклонального антитела

данные о накоплении .в опухоли и распределении по органам 1-131, In-III и Tc-99m - mab 431/26 в безволосых мышах () с человеческой карциномой толстой кишки в зависимости от времени.

П р и м- е р Ч. 0 мг F(ab -фрагмента моноклонального антитела

31/31 инкубируют при в течение 15 мин с 1 мл 1%-ного раствора цис- теамингидрохлорида. Освобожденный от избыточного восстановителя фраг- мент антитела лйофилизируют вместе с фосфатным буфером. Для мечения технецием используют метящую единицу, состоящую из 13,0 мг тетранатриевой соли 3,3-Дифосфоно-1,2-пропандикар- боновой кислоты, 0,23 мг оксида олова-II и 1,0 ,мг мононатриевой соли Н-(4-аминобензоил)-L-глутаминовой кислоты, из которой 1/20 применяют в 0,5 мл физиологического раствора хлорида натрия. Меченный с удельной активностью 1000 MB q/мг фрагмент антитела не содержит практически никакого падтехнетата, однако содержит примерно 3% Тс-99т-дйфосфоната. Йм- мунореактивность 60%.

П р. и м е р 5. Тс-ЭЭю-мечение протеина.

250мг IgG концентрации 10 мг/мп растворяют в изотоническом растворе хлорида натрия. Этот раствор после добавки 0,5-1 мл 2-меркаптоэтанола инкубируют примерно 30 мин при 4--.-;.. . Затем восстановленный иммуноглобулин очищают путем гель-фильтра- ции через колонку с гелем полиакрил- амида (биогель Р-2 фирмы БИО рАД)у: причем элюируют с помощью 0,02 К раствора динатрийгидрофосфата ( В отделенной чистой фракции IgG riy- тем разбавления таким жефосфатным буфером устанавливают концентрацию 4 мг IgG/мл (примерно 3 хмг дозируют, по 0,5 мл этого раствора и лйофилизируют.

Для мечения технецием-99го пробы (2 мг IgG) лиофилйзат растворяют.в t мл раствора метандифосфоната оло

5

0 5 0

0

5

ва-II (рН 7J, который получается путем растворения метящей единицы, состоящей из .,6 мг натриевой соли метандифосфоновой кислоты и 0.04 мг хлорида олова-11 в 5 мл изотонического раствора хлорида натрия. Затем добавляют 4-9 мл раствора Тс-99т- пертехнетата (примерно 1000 MBq). После 5 мин реакции получают меченный технецием-99т IgG, в котором имеется более 95% Связанного с протеином технеция, менее 1% связанной с фосфонатом части и менее 1% свободного пертехнетата. Меченный IgG стабилен вплоть до 3 ч после приготовления. Лишь при более длительном времени хранения в растворе обнаруживается снова свободный пертехнетат.

Использование предлагаемого способа позволяет повысить прочность мечения w TC моноклональных антител или их F(ab Ј-фрагментов. .

Форму л-а изобрет

Способ получения меченных °тТс моноклональных антител путем смешения Тс пертехнетата и раствора предварительно обработз-нного моноклонального антитела или его F(ab )2-фрагмента в присутствии солей олова-11, о т л и- чающийся тем, что, с целью i повышения качества введения метки, ;. используют соль олова-II, выбранную из группы: соль олова-II метандифосфоновой кислоты, З-З-ДИФОСФОНОПРОПИ- оновой кислоты, З-З-ДИфосфоно-1,2-прб пандикарбоновой кислоты, пропан-1,1- 3,3-тетрафосфоновой или пирофосфор- ной кислота в количестве, в расчете на олово-11, 5-10.мкг соли на 1 мг белка антитела.

е н и я

Т а б л и ц а 1

8,8 9,8 13,0

3,0 8,5 8,4 1,9 12,. 16,4

Мускулы,

/г . 1,3 0,84 1,4 1,2

Кровь,

/мп14,6 13,0 20,5 9,2

17Н657

Т а б л и ц а 2

Т а б л и ц а 3

14,9 ;

5J4 I

7,7 .:.

.) J1.

1,0 15,0