КОМПЛЕКС ТЕХНЕЦИЯ-99М С РЕКОМБИНАНТНЫМИ АДРЕСНЫМИ МОЛЕКУЛАМИ БЕЛКОВОЙ ПРИРОДЫ С АНКИРИНОВЫМИ ПОВТОРАМИ ДЛЯ РАДИОНУКЛИДНОЙ ДИАГНОСТИКИ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ ОБРАЗОВАНИЙ С ГИПЕРЭКСПРЕССИЕЙ HER2/NEU И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ Российский патент 2024 года по МПК A61K51/08 A61K103/10 C07K14/435 

Изобретение относится к медицине, онкологии, фармацевтической химии и фармакологии, в частности к радиофармацевтическим лекарственным препаратам на основе рекомбинантных молекул белковой природы с анкириновыми повторами (DARPin) для радионуклидной диагностики злокачественных образований с гиперэкспрессией HER2/neu, содержащих ^99mTc и способам их получения.

Известен способ получения комплекса технеция-99м с рекомбинантными адресными молекулами белковой природы для радионуклидной диагностики онкологических заболеваний с гиперэкспрессией HER-2/neu [RU 2684289 C1, МПК A61K 51/04 (2006.01), опубл. 05.04.2019], который заключается в том, что на первой стадии получают аквакарбонильный технеций-99м [^99mTc(ОН)₃(СО)₃]⁺, используя лиофилизат натрия тетрабората декагидрата, натрия карбоната, динатрия боранокарбоната, который также может содержать калия натрия тартрата тетрагидрат или натрия цитрата моногидрат, далее к лиофилизату добавляют 1-3 мл раствора натрия пертехнетата, ^99mTc с активностью 0,74-3,7 ГБк и нагревают на кипящей водяной бане 20-30 мин, охлаждают до комнатной температуры и добавляют 1М HCl до рН 7,4 или 300-900 мкл 1М раствора натрия фосфата с рН 7,4, далее проводят присоединение хелатирующего агента сукцинимид-1-ил 6-(бис(пиридин-2-илметил)амино)гексаноат (DPAH) к DARPin в фосфатном буфере рН 8,3-8,5 с получением DPAH-DARPin, затем проводят связывание аквакарбонильного технеция-99м [^99mTc(ОН)₃(СО)₃]⁺ с DARPin или DPAH-DARPin, для чего к DARpin или DPAH-DARPin в количестве 100 мкг в фосфатно-буферном растворе при рН 7,4 добавляют 1 мл раствора аквакарбонильного технеция-99м [^99mTc(ОН)₃(СО)₃]⁺, далее инкубируют при 40 °С в течение 30-60 мин, очистку проводят гель-фильтрацией на колонке.

Известен способ получения комплекса технеция-99м с модифицированными специфичными мини-антителами для диагностики онкологических заболеваний с гиперэкспрессией HER2/neu [RU 2655965 C2, МПК G01N33/534 (2006.01), опубл. 30.05.2018], включающий связывание технеция-99м с мини-антителами DARPin, отличающийся тем, что на первом этапе проводят модификацию мини-антител DARPin сукцинимид-1-ил 6-(бис(пиридин-2-илметил)амино)гексаноатом в Tris-буферном растворе, в растворе ДМСО или ДФМА, при этом, используют растворы мини-антител DARPin в Tris-буфере или фосфатном буфере с pH 8,3-8,5, синтез проводят при перемешивании 4 часа при комнатной температуре, далее выдерживают 24 часа при температуре 5-10°С, далее модификацию проводят при соотношении мини-антител к сукцинимид-1-ил 6-(бис(пиридин-2-илметил)амино)гексаноату - 1:5 - 20, очистку модифицированных мини-антител проводят гель-фильтрацией на колонке с Superdex-75, на втором этапе способа проводят связывание технеция-99м с модифицированными мини-антителам DARPin, для чего к модифицированным мини-антителам DARpin в количестве 50 мкг в буферном растворе при pH 8,3-8,5 последовательно добавляют 1 мл раствора технеция-99м 300-1200 МБк и 40 мкл свежеприготовленного раствора цитрата натрия с концентрацией 100 мг/мл и 30 мкл свежеприготовленного раствора олова (II) хлорида дигидрата с концентрацией 7 мг/мл и инкубируют при комнатной температуре в течение 30 мин.

Недостатками этих способов являются предварительная конъюгация с коммерчески недоступным хелатирующим агентом, многостадийность, длительный по времени процесс, и требуется очистка гель-фильтрацией, что существенно усложняет способы получения.

Известен способ получения инъекционной формы радиофармпрепарата на основе меченных технецием-99m рекомбинантных адресных молекул DARPin9_29 [RU 2702294 C1, МПК (2006.01) A61B 6/03, A61K 51/00, A61K 103/10, A61P 43/00, опубл. 07.10.2019], который изготавливают непосредственно перед введением пациенту, для чего в асептических условиях 1 мл элюата ^99mTcO^4- 7 ГБк с помощью шприца добавляют в набор для приготовления трикарбонильного технеция и инкубируют при температуре 100 °С в течение 30 минут. После инкубации 1000 мкл трикарбонила технеция добавляют к 334 мкл DARPin9_29 при концентрации раствора основного вещества 3,6 мг/мл и инкубируют при температуре 40 °С в течение 60 минут. Далее выполняют очистку полученного соединения от белковых примесей и несвязавшихся с технецием молекул DARPin9_29 с помощью очистительных колонок. Полученный после очищения препарат в дозе 500 МБк разбавляют в 10 мл физиологического раствора и фильтруют через стерилизующий фильтр.

К недостаткам описанного способа можно отнести несколько стадий, использование двух флаконного набора, использование коммерчески малодоступного кита для приготовления трикарбонильного технеция-99м, в совокупности длительный по времени процесс получения препарата, требующей очистки, что является ограничением для изготовления в медицинской организации.

Техническим результатом заявляемого изобретения является расширение арсенала комплексов технеция-99м с рекомбинантными адресными молекулами белковой природы с анкириновыми повторами и способов их получения для диагностики злокачественных образований с гиперэкспрессией HER2/neu.

Предложен комплекс технеция-99м с рекомбинантными адресными молекулами белковой природы с анкириновыми повторами для радионуклидной диагностики злокачественных образований с гиперэкспрессией HER2/neu, обозначенный формулы [^99mTc]Tc-G3-(G₃S)₃C и представляющий собой аминокислотную последовательность

DLGKKLLEAARAGQDDEVRILMANGADVNAKDEYGLPLYLATAHGHLEIVEVLLN

GADVNAVDAIGFTPLHLAAFIGHLEIAEVLLKHGADVNAQDKFGKTAFDISIGNGNED

LAEILQKLNGGGSGGGSG-Х,

где Х -, где Тс представляет собой ^99mTc.

Способ получения комплекса технеция-99м с рекомбинантными адресными молекулами белковой природы с анкириновыми повторами для радионуклидной диагностики злокачественных образований с гиперэкспрессией HER2/neu, обозначенный формулой[^99mTc]Tc-G3-(G₃S)₃C и представляющий собой аминокислотную последовательность

DLGKKLLEAARAGQDDEVRILMANGADVNAKDEYGLPLYLATAHGHLEIVEVLLN

GADVNAVDAIGFTPLHLAAFIGHLEIAEVLLKHGADVNAQDKFGKTAFDISIGNGNED

LAEILQKLNGGGSGGGSG-Х,

где X - , где Тс представляет собой ^99mTc,

заключается в том, что к лиофилизированной смеси олова (II) хлорида дигидрата, натриевой соли глюконовой кислоты и натриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты в массовом соотношении (0,5÷1,25):67:1,3 соответственно, добавляют раствор натрия пертехнетата, ^99mТс с активностью 300÷1000 МБк и перемешивают, затем смешивают с 500-4000 мкг раствора белка G3-(G₃S)₃C, инкубируют при 40÷60°С в течение 20-40 мин, добавляют стерильный 0,9% раствор натрия хлорида и фильтруют через стерилизующий фильтр. (0,

Повышение селективности предложенного способа достигается за счет сайт-специфического связывания технеция-99м (в виде [^99mTc(O)]³⁺) с аминокислотной последовательностью глицил-глицил-глицил-серил-цистеин ((G₃S)₃C), расположенной на С-конце DARPin G3, что обеспечивает образование стабильного комплекса оксотехнеция пятивалентного с DARPin G3.

Радиохимический выход получения комплекса [^99mTc]Tc-G3-(G₃S)₃C составляет 95,8 – 98,8%. Достигаемый высокий выход не требует трудоемкой очистки, что существенно упрощает способ получения и снижает потери белка при очистке.

На фиг. 1 представлены результаты определения специфичности связывания комплекса [^99mTc]Tc-G3-(G₃S)₃C in vitro. Концентрация была 2 нМ. Данные представлены как среднее значение ± стандартное отклонение (n=3).

На фиг. 2 показаны результаты определения константы диссоциации (K_D) комплекса [^99mTc]Tc-G3-(G₃S)₃C с помощью HER2-экспрессирующих клеток SKOV-3 in vitro.

На фиг. 3 показано накопление комплекса [^99mTc]Tc-G3-(G₃S)₃C в ксенотрансплантатах SKOV-3 (высокая экспрессия HER2) и PC-3 (низкая экспрессия HER2) у мышей Nu/j, 4 часа после введения, 10 мкг белка/на мышь. Данные представлены как среднее значение%ID/g ± стандартное отклонение для четырех мышей.

В таблице 1 представлены условия и результаты получения комплекса технеция-99м с рекомбинантными адресными молекулами белковой природы с анкириновыми повторами.

Для осуществления способа использовали белок DARPin G3, содержащий аминокислотную последовательность глицил-глицил-глицил-серил-цистеин ((G₃S)₃C) на C-конце белка, полученный в несколько этапов с использованием Escherichia coli и последующей очисткой [Vorobyeva A. Comparison of tumor-targeting properties of directly and indirectly radioiodinated designed ankyrin repeat protein (DARPin) G3 variants for molecular imaging of HER2 // International journal of oncology. – 2019. – Vol. 54, №. 4. – P. 1209-1220].

Нуклеотидная последовательность гена DARPin G3 была выведена из аминокислотной последовательности DARPin G3, депонированной в PDB (номер доступа PDB: 2JAB) с учетом использования кодонов в высокоэкспрессируемых генах Escherichia coli с помощью свободно распространяемой программы DNABuilder (http://www.innovationsinmedicine.org/software/DNABuilder/). Геном был собран методом ПЦР из химически синтезированных олигонуклеотидов длиной 50 п.н., имеющих частично комплементарные последовательности.

Белок DARPin G3 с (G₃S)₃C-хелатором был получен в Escherichia coli BL21(DE3) (Novagen-EMD Millipore, Madison, WI 53719, USA) как С-концевые расширения малого модификатора SUMO, связанного с убиквитином [Malakhov M. P. SUMO fusions and SUMO-specific protease for efficient expression and purification of proteins // Journal of structural and functional genomics. – 2004. – Vol. 5, №. 1-2. – P. 75.].

Во флакон, содержащий лиофилизированную смесь 75 мкг олова (II) хлорида дигидрата, 5 мг натриевой соли глюконовой кислоты и 100 мкг натриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭDTA), добавляли 0,5 мл раствора натрия пертехнетата, ^99mТс с активностью 700 МБк и перемешивали. Содержимое флакона переносили во флакон с 3500 мкг раствора белка G3-(G₃S)₃C, перемешивали и инкубировали при 60 °С в течение 30 мин. Далее во флакон добавляли стерильный раствор 0,9% натрия хлорида до общего объема 10 мл. После перемешивания полученный раствор пропускали через стерилизующий фильтр с диаметром пор 0,22 мкм с помощью шприца в стерильный флакон.

Эффективность способа получения комплекса [^99mTc]Tc-G3-(G₃S)₃C оценивали по величине радиохимического выхода, который определяли методом тонкослойной радиохроматографии с использованием полоски из стекловолокна со слоем силикагеля iTLC (Aglient Technologies, Inc. Folsom, США) и системы фосфатно-буферного раствора (PBS) в качестве подвижной фазы. Распределение радиоактивности по полоске iTLC измеряли с помощью сканера miniGITA Single (Elysia Raytest, Германия).

На линию старта полоски iTLC-бумаги (Agilent, США) наносили 2 мкл полученного соединения. Полоску с нанесенной пробой сушили на воздухе, помещали в камеру с 0,01 М фосфатным буферным раствором с рН 7,4 и хроматографировали восходящим методом. Когда фронт подвижной фазы прошел около 90% длины полоски бумаги от линии старта, ее вынимали из камеры, сушили на воздухе и распределение активности ^99mТс на радиохроматограмме регистрировали радиометрическим методом.

Комплекс [^99mTc]Tc-G3-(G₃S)₃C остался на линии старта (R_f = 0,0-0,2), а примеси свободные пертехнетат-ионы ^99mTcO₄^- и другие формы технеция-99м продвинулись с фронтом растворителя (R_f = 0,9-1,0).

Радиохимический выход (РХВ) полученного комплекса [^99mTc]Tc-G3-(G₃S)₃C составил 98,2%.

Другие примеры получения комплекса [^99mTc]Tc-G3-(G₃S)₃C представлены в таблице 1. Из приведённых в таблице 1 экспериментальных данных следует, что во всех примерах достигается заявленный технический результат.

Эффективность комплекса [^99mTc]Tc-G3-(G₃S)₃C и способа его получения для радионуклидной диагностики злокачественных образований с гиперэкспрессией HER2/neu подтверждается исследованиями in vitro и in vivo с использованием клеточных культур с экспрессией HER2/neu.

Оценку специфичности связывания комплекса [^99mTc]Tc-G3-(G₃S)₃C с мишенью HER2/neu, проводили на клеточных линиях с различным уровнем экспрессии HER2/neu: SK-BR-3 (клетки рака молочной железы) > SKOV-3 (клетки рака яичника человека) > PC-3 (клетки рака предстательной железы) по методике, описанной [Wållberg, H.; Orlova, A., Slow internalization of anti-HER2 synthetic affibody monomer ¹¹¹In-DOTA-ZHER2:342-pep2: implications for development of labeled tracers. Cancer biotherapy & radiopharmaceuticals 2008, 23, (4), 435-42. http://DOI:10.1089/cbr.2008.0464.]. Эксперимент проводили с блокированием рецепторов немеченым DARPin G3. Изучение специфичности [^99mTc]Tc-G3-(G₃S)₃C продемонстрировало, что связывание с SKOV-3, SK-BR-3 и PC-3 является насыщаемым (специфичным) на высоком уровне и пропорционально уровню экспрессии HER2/neu в клетках, при этом при блокировании рецепторов избытком немеченого белка отмечается значительное снижение связывания во всех группах клеток (фиг. 1).

Оценку аффинности связывания с HER2/neu комплекса [^99mTc]Tc-G3-(G₃S)₃C проводили методом насыщения [Velikyan I, Sundberg AL, Lindhe O, Höglund AU, Eriksson O, Werner E, Carlsson J, Bergström M, Långström B, Tolmachev V. Preparation and evaluation of (68)Ga-DOTA-hEGF for visualization of EGFR expression in malignant tumors. J Nucl Med. 2005 Nov;46(11):1881-8. PMID: 16269603.] в диапазоне концентраций от 0,2 до 40 нМ. Установлено, что комплекс [^99mTc]Tc-G3-(G₃S)₃C, полученный по заявляемому способу, связывается с рецепторами HER2/neu на поверхности клеток SKOV-3 с K_D в наномолярном значении (4,1±0,6 нмоль) (фиг. 2).

Для оценки таргетных свойств комплекса [^99mTc]Tc-G3-(G₃S)₃C in vivo использовали мышей Nu/j, несущих ксенотрансплантаты SKOV-3 с высокой экспрессией HER2/neu. Чтобы оценить, зависит ли поглощение опухоли от уровня экспрессии HER2/neu, поглощение [^99mTc]Tc-G3-(G₃S)₃C также измеряли в ксенотрансплантатах PC-3 с низкой экспрессией HER2. Самкам мышей Nu/j подкожно имплантировали 10⁷ клеток SKOV-3 или такое же количество клеток PC-3 в 100 мкл среды.

Результаты исследования [^99mTc]Tc-G3-(G₃S)₃C in vivo в ксенотрансплантатах SKOV-3 с высокой экспрессией HER2/neu и PC-3 с низкой экспрессией HER2/neu представлены на фиг. 3. Поглощение в ксенотрансплантатах SKOV-3 было значительно (p <0,005, однофакторный дисперсионный анализ) выше, чем в ксенотрансплантатах PC-3. Это показывает, что уровень поглощения коррелирует с уровнем экспрессии HER2/neu, комплекс функционально пригоден для диагностики опухолей с экспрессией HER2/neu.

Таким образом, предложенный комплекс технеция-99м с рекомбинантными адресными молекулами белковой природы с анкириновыми повторами DARPin G3 позволяет расшить арсенал таргетных соединений для диагностики злокачественных образований с гиперэкспрессией HER2/neu, поскольку специфически и с высокой аффинностью связывается с раковыми клетками с экспрессией HER2/neu и может различать опухоли с высоким и низким уровнем экспрессии рецепторов. Предложенный способ получения комплкса технеция-99м с рекомбинантными молекулами белковой природы с анкириновыми повторами DARPin G3-(G₃S)₃C проводится в одну стадию в течении короткого промежутка времени, обеспечивает высокий выход до 98,8%, что не требует очистки, аффинность к рецепторам HER2/neu находится в наномолярном диапазоне (4,1±0,6 нмоль).

Таблица 1 № Количество белка
DARPin
G3-(G₃S)₃C,
мкг Содержание
олова (II) хлорида дигидрата,
мкг Активность ^99mTc,
МБк Время, в течение которого ведут инкубирование,
t, мин Температура, при которой ведут инкубирование,
T, °C Радиохи-
мический выход,
% 1 500 75 700 30 60 97,0 2 1000 75 700 30 60 98,5 3 2000 75 700 30 60 98,2 4 3500 75 700 30 60 98,8 5 4000 75 700 30 60 98,7 6 3500 75 300 30 60 97,5 7 3500 75 1000 30 60 98,8 8 3500 50 700 30 60 98,2 9 3500 100 700 30 60 98,1 10 3500 75 700 20 60 96,8 11 3500 75 700 40 60 98,6 12 3500 75 700 30 40 95,8 13 3500 75 700 30 50 98,3

Изобретения относятся к медицине, онкологии, фармацевтической химии и фармакологии, в частности к радиофармацевтическим лекарственным препаратам. Предложен комплекс технеция-99м с рекомбинантными адресными молекулами белковой природы с анкириновыми повторами для радионуклидной диагностики злокачественных образований с гиперэкспрессией HER2/neu, обозначенный формулой [^99mTc]Tc-G3-(G₃S)₃C и представляющий собой аминокислотную последовательность

DLGKKLLEAARAGQDDEVRILMANGADV

NAKDEYGLPLYLATAHGHLEIVEVLLNGA

DVNAVDAIGFTPLHLAAFIGHLEIAEVLLK

HGADVNAQDKFGKTAFDISIGNGNEDLAE

ILQKLNGGGSGGGSG-Х,

где Х - ,

где Тс представляет собой ^99mTc. Также предложен способ получения указанного комплекса, в котором к лиофилизированной смеси олова (II) хлорида дигидрата, натриевой соли глюконовой кислоты и натриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты в массовом соотношении (0,5-1,25):67:1,3 соответственно добавляют раствор натрия пертехнетата, ^99mТс с активностью 300-1000 МБк и перемешивают, затем смешивают с 500-4000 мкг раствора белка G3-(G₃S)₃C, инкубируют при 40-60°С в течение 20-40 мин, добавляют стерильный 0,9% раствор натрия хлорида и фильтруют через стерилизующий фильтр. Технический результат: расширение арсенала средств для диагностики злокачественных образований с гиперэкспрессией HER2/neu. 2 н.п. ф-лы, 3 ил., 1 табл.

1. Комплекс технеция-99м с рекомбинантными адресными молекулами белковой природы с анкириновыми повторами для радионуклидной диагностики злокачественных образований с гиперэкспрессией HER2/neu, обозначенный формулой [^99mTc]Tc-G3-(G₃S)₃C и представляющий собой аминокислотную последовательность

DLGKKLLEAARAGQDDEVRILMANGADVNAKDEYGLPLYLATAHGHLEI

VEVLLNGADVNAVDAIGFTPLHLAAFIGHLEIAEVLLKHGADVNAQDKFGK

TAFDISIGNGNEDLAEILQKLNGGGSGGGSG-Х,

где Х - , где Тс представляет собой ^99mTc.

2. Способ получения комплекса технеция-99м с рекомбинантными адресными молекулами белковой природы с анкириновыми повторами для радионуклидной диагностики злокачественных образований с гиперэкспрессией HER2/neu по п. 1, отличающийся тем, что к лиофилизированной смеси олова (II) хлорида дигидрата, натриевой соли глюконовой кислоты и натриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты в массовом соотношении (0,5-1,25):67:1,3 соответственно добавляют раствор натрия пертехнетата, ^99mТс с активностью 300-1000 МБк и перемешивают, затем смешивают с 500-4000 мкг раствора белка G3-(G₃S)₃C, инкубируют при 40-60°С в течение 20-40 мин, добавляют стерильный 0,9% раствор натрия хлорида и фильтруют через стерилизующий фильтр.