Способ биотестирования наличия химических соединений в водной среде Советский патент 1992 года по МПК G01N33/18 

Изобретение относится к санитарной, медицинской и сельскохозяйственной микробиологии, альгологии, токсикологии и может быть использовано при биомониторинге и контроле водных сред.

Известен способ биотестирования наличия химических соединений (в частности, гибереловой кислоты) на основе регистрации потери подвижности и отмирания клеток зеленых водорослей Dunaliella salina.

Данный способ, основанный на визуальном наблюдении движения клеток, довольно трудоемок, неточен, так как связан с необходимостью регистрации живых и неживых клеток посредством микроскопа.

Наиболее близким к предлагаемому является способ, основанный на оценке энергозатрат, скорости движения и

числа подвижных клеток с помощью метода корреляционно-доплеровской спектроскопии, КОТОРЫЙ содержит следующие операции. Вносят исследуемое химическое вещество определенной концентрации в суспензию тесг-объектов (водоросли Dunaliella salina, Dunaliella viridis). Через 30-100 мин облучают когерентным светом в красном диапазоне кювету с суспензией водорослей и химическим веществом и измеряют флуктуации рассеянного на движущихся клетках света и определяют корреляционную функцию амплитуды рассеянного излучения. Оценивают скорость, число подвижных клеток и относительную величину энергозатрат на движение клеток водорослей и судят о токсическом эффекте, производимым химическим веществом, по концентрации этого вещества, при которой имеет ме

со со to

00

оо

сто увеличение энергозатрат на движение клеток водорослей.

Недостатками известного способа я вляются длительность процесса определения действия химических веществ (более 30-100 мин); необходимость поддержания точной температуры (2б± ±0,5°С). Отклонение от этого значения влияет на точность измерений. Ограниченность способа проявляется в том, что не все химические вещества действуют непосредственно на скорость движения клеток, число подвижных клеток и относительную величину энергозатрат. Например, азид натрия (NaN) ингибирует способность клеток ориентироваться относительно направления распространения света (фототопотаксис), оставляя без изменения указанные параметры движения.

Цель изобретения - сокращение времени и повышение точности определения химических веществ, а также расширение возможностей способа,

Поставленная цель достигается путем измерения параметров фотодвижени водорослей - скорости поступательного движения, стимулируемой белым светом, направленным через конденсор микроскопа на предметное стекло с суспензией водорослей и способности клеток ориентироваться относительно направления распространения белого света, направленного под углом к поверхности предметного стекла с суспензией клеток водорослей.

На чертеже дана схема для иллюстрации предлагаемого способа.

На схеме показаны источники 1 и 2 света, объект 3 (предметное стекло с углублением, в котором располагают суспензию водооослей) , микроскоп , видеокамера 5, телевизор 6.

При определении скорости v поступательного движения излучение источн ка 1 пропускают через объект 3 и регистрируют скорость движения клеток через микроскоп k с помощью видеокамеры 5 на экране телевизора 6 путем фиксации времени прохождения клетками определенного расстояния.

Способность клеток водорослей проявлять ориентацию относительно направления распространения бокового света (от источника 2), направленного под углом к поверхности предметного стекла 3 с суспензией водорослей, характеризуется параметром Р фототопотаксиса, который определяетс

5

), где гц.и nk- количество клеток, двигающихся к источнику бокового света и от него соответственно. Освещенность суспензии при определении v и составляет 500 лк.

Оценку наличия химического вещества в водной среде производят следующим образом. Размещают тест-объекты (водоросли) в опытную, с химическим веществом, и контрольную, без хими- ческого вещества, среды: обе среды вносят в экспериментальные ячейки

5 оптической системы, т.е . в углубления предметного стекла,-которое размещают на предметном столике микроскопа, закрыв покровным стеклом. Располагают ячейки последовательно в фокусе

микроскопа , сопряженного с видеокамерой 5, и освещают объекты светом источников 1 и 2. На экране монитора 6 регистрируют скорости v и VK поступательного движения клеток в опытном и контрольном образцах соответственно при освещении их светом источника 1, а также параметры фототопотаксиса $ и РК характеризующие способность клеток водорослей ориентироваться относительно бокового света от источника 2 в опытном и контрольном образцах соответственно.

О наличии химического вещества в водной среде судят по показателю R, который рассчитывается по формуле

R(v/vK)/(),

0

5

5

0

Ф Р - t гк

где v, v - скорости поступательного движения клеток в опытной и контрольных средах; величины, характеризующие ориентацию направления движения клеток в опытной и контрольной средах относительно бокового света.

Наличие химических соединений в опытной среде регистрируют в случае статистически достоверного отклонения показателя R от единицы. Так, 0 при отсутствии химического вещества в водной среде и ф -Qk, т.е. . В присутствии химического вещества или 9 ЈФ„, т.е. R 1 или . Кроме того, возможны количест- 5 венные оценки присутствующего в водной среде химического вещества с помощью параметра R, -J(v/vk)2 + ()2, который при отсутствии химического

вещества равен при наличии химического вещества в водной среде величина R, отличается от -J1P в зависимости от концентрации химического вещества.

Таким образом, предлагаемый способ содержит следующие операции. Размещают тест-объекты (водоросли) в опытную, с химическим веществом, и в контрольную, без химического вещества, среды, вносят опытную и контрольную среды в экспериментальные ячейки оптической системы, располагают ячейки последовательно в фокусе микроскопа, сопряженного с системой видеорегистрации, освещают ячейки через конденсор микроскопа и боковым светом. Регистрируют на экране видеомонитора скорости v и VK движения клеток в опытном и контрольном образцах соответственно, а также параметры Р и т , характеризующие способность клеток ориентироваться от- носительноч бокового света в опытном и контрольном образцах соответственно и оценивают показатель R(v/vk)/ /(/9)0 Регистрируют наличие химического вещества в водной среде в случае статистически достоверного отклонения показателя R от 1, т.е. .

В качестве примера реализации предлагаемого способа приведены зависимость скорости v поступательного движения и фототопотаксиса Ф клеток зеленой водоросли Dunaliella salina и Dunaliella viridis от концентрации некоторых химических веществ.

Результаты биотестирования азида натрия с помощью клеток Dunaliella salina приведены в табл. 1.

Результаты биотестирования поверхностно-активных веществ (анионных) с помощью Dunaliella viridis приведены в табл. 2,

1

1 /3 3288

Результаты биотестирования пестицидов с norощью Dunaliella viridis приведены в табл. 3.

Формула изобретения

Способ биотестирования наличия химических соединений в водной среде,

предусматривающий помещение водорослей в опытную и контрольную среды, внесение обеих сред в экспериментальные ячейки оптической системы, освещение ячеек боковым светом, определение параметров фотодвижения водорослей в обеих средах, расчет показателя, учитывающего эти параметры, и регистрацию наличия химических соединений в опытной среде по его величине, отличающийся тем,

что, с целью сокращения времени и повышения точности тестирования, а также расширения функциональных возможностей способа, в качестве параметров

фотодвижения водорослей используют скорость их поступательного движения и величину, характеризующую ориентацию направления движения клеток водорослей относительно бокового света, расчет показателя проводят по формуле

5

0

R- -& ,

где R - показатель;

v, VK - скорость поступательного движения клеток соответственно в опытной и контрольной средах; Р Рк величина, характеризующая

ориентацию направления движения клеток в опыте и контроле относительно бокового света, а наличие химических соединений в опытной среде регистрируют в случае статистически достоверного отклонения от единицы.

1739288

Таблица

Использование: биотестирование наличия химических соединений в водной среде. Сущность изобретения: учитывают скорость поступательного движения клеток микроводорослей и величину, характеризующую ориентацию направления движения клеток относительно бокового света. Эту величину оценивают по формуле R(V/V )/( ), где R - показатель; V, VK, - скорость поступательного движения клеток в опытной и контрольной средах; ft, РК- величина, характеризующая ориентацию направления движения клеток в опыте и контроле относительно бокового света. Наличие химических соединений в опытной среде регистрируют в случае достоверного отклонения величины R от единицы. 3 табл., 1 ил. Ј (Л с

Таблица 3