СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ОДНОКЛЕТОЧНОЙ ЗЕЛЕНОЙ МИКРОВОДОРОСЛИ DUNALIELLA SALINA ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ БИОМАССЫ Российский патент 2015 года по МПК A01G33/00 C12N1/12 

Изобретение относится к биотехнологии микроводорослей и может быть использовано при промышленном получении биомассы микроводоросли Dunaliella salina.

Зеленая одноклеточная водоросль Dunaliella salina - объект массового промышленного культивирования для получения витаминов, липидов, спиртов (в частности, этанола) и антибиотиков. Биомасса активно растущей микроводоросли D. salina, по данным многих авторов, имеет сбалансированный биохимический состав (содержание белка до 60%, углеводов - 8,40 - 12,70%, липидов - 7,70 -10,80%). Содержание ценного пигмента хлорофилла а может достигать свыше 5% на абсолютно сухую массу. Кроме того, биомасса зеленой микроводоросли D. salina является источником биоактивных веществ, обладающих антиоксидантными свойствами, таких как липиды (полиненасыщенные жирные кислоты), каротиноиды (β-каротин, лютеин, зеаксантин и др.), витамины (токоферол) и др. В отличие от других водорослей, клетки D. salina лишены целлюлозной или пектиновой оболочки и окружены лишь тонкой эластичной протоплазматической мембраной (плазмалеммой), что существенно облегчает усвоение биомассы водоросли. Благодаря этим ценным качествам биомасса D. salina широко применяется в мировой практике в качестве кормовой добавки.

Промышленные технологии, использующиеся в настоящее время, ориентированы на получение биомассы D. salina, обогащённой β-каротином путем использования обеднённых сред, так как именно в таких условиях происходит накопление вторичных каротиноидов. Состав среды Тренкеншу позволяет получать плотную культуру дуналиеллы, характеризующуюся высокими продукционными характеристиками.

На практике применяются следующие методы культивирования D. salina: накопительный, непрерывный, непропорционально-проточный, квазинепрерывный. Однако чаще всего для выращивания D. salina используют накопительный режим культивирования, который является наиболее разработанным и изученным. Возможности квазинепрерывной культуры (особенно плотной) реализованы слабо.

Известен способ квазинепрерывного культивирования D. salina, при котором выращивание микроводоросли происходит в открытых резервуарах [см. Garcia-Gonzalez M., Moreno J., Canavate J.P., Anguis V., Prieto Α., Manzano С, Florencio F.G., Guerrero M.G. Conditions for open-air outdoor culture of Dunaliella salina in southern Spain // J Appl. Phycol. - 2003. - 15. - P. 177-184]. Культивирование осуществляют при естественной освещённости и температуре. В способе водоросль выращивают методом квазинепрерывной культуры на питательной среде с содержанием 5 мМ NaNO₃ и 2 M NaCl при естественном освещении, добавление свежей среды проводят каждые 2 суток до первоначальной плотности культуры 0,7 - 0,9·10⁶кл·мл^-1. Водоросли выращивают в овальных пластиковых бассейнах с площадью поверхности 3 м² и глубиной 0,3 м при естественном уровне освещённости и температуре. При таком режиме культивирования средняя продуктивность составляет 1,65 г сухого вещества (СВ), а β-каротина - 0,1 г с 1 м² в сутки.

Указанная работа имеет принципиальное значение, так как подтверждает возможность получения биомассы D. salina при выращивании в квазинепрерывном режиме. Однако предложенный режим культивирования имеет некоторые ограничения для использования в промышленных масштабах. Наиболее важными из них являются:

а) сложность в регулировке степени разбавления до первоначальной плотности культуры;

б) более низкая продуктивность с единицы объёма по сравнению с предлагаемым способом;

В основу изобретения Способ культивирования одноклеточной зеленой микроводоросли Dunaliella salina поставлена задача повышения эффективности способа путем увеличения продуктивности культуры при использовании концентрированной питательной среды и квазинепрерывного режима выращивания.

Способ культивирования одноклеточной зеленой микроводоросли Dunaliella salina для получения биомассы основан на использовании квазинепрерывного режима, а подбор условий культивирования, способствующих накоплению в клетках пигментов и белка, были выполнены авторами в лабораторных экспериментах.

Поставленная задача достигается тем, что культуру, выращенную на модифицированной питательной среде Тренкеншу (Тренкеншу Р.П., Белянин В.Н. Влияние элементов минерального питания на продуктивность водоросли Platymonas viridis Rouch. // Биология моря. - 1979. - № 51. - С. 41 - 46.) методом накопительных культур до плотности 1,5 - 3 г ОВ·л^-1 (грамм органического вещества на 1 литр) переводят на квазинепрерывный режим культивирования. Квазинепрерывную культуру получают путем периодической (с интервалом в 24 ч) замены части суспензии микроводоросли равноценным объемом свежеприготовленной среды. Каждые 24 часа из культиваторов отбирают 12, 14, 32 и 42% объема культуры (ω = 0,12-0,42 сут^-1) и заменяют его равноценным объемом свежей среды. Выращивание D. salina осуществляют с удельной скоростью протока около 0,1 - 0,4 сут^-1, при круглосуточном освещении люминесцентными лампами дневного света, обеспечивающими поверхностную освещённость 80 Вт·м^-2, непрерывной продувке газовоздушной смесью: на 1 литр культуры микроводоросли - 1 литр газовоздушной смеси в 1 минуту (1 л·мин^-1·л^-1 культуры), содержащей 3% СO₂ (по объёму) и температуре 26-28°С.

Общим для прототипа и заявляемого способа является применение квазинепрерывного режима культивирования. Основное отличие от прототипа заключается в том, что в заявляемом способе при культивировании используется метод квазинепрерывной культуры со скоростью протока около 0,3 сут^-1.

Изобретение поясняется иллюстрациями. Фиг. 1 - Динамика плотности накопительной и квазинепрерывной культуры Dunaliella salina при различной скорости протока среды (пунктирная линия - граница накопительного и квазинепрерывного культивирования). Фиг. 2 - Зависимость относительного содержания пигментов в клетках Dunaliella salina от удельной скорости протока среды в квазинепрерывной культуре. Фиг. 3 - Зависимость относительного содержания белка в клетках Dunaliella salina от удельной скорости протока среды в квазинепрерывной культуре.

Способ культивирования одноклеточной зеленой водоросли Dunaliella salina реализуется следующим образом:

Для культивирования может быть использован любой штамм Dunaliella salina, например IBSS-1, IBSS-2, IBSS-3, их коллекционное хранение осуществляют на питательной среде Ben-Amotz, и температуре 15-18°С с пересевом каждые 1,5-2 месяца.

Получение инокулята. Для получения инокулята культуру водоросли из музея 5-7 дней выращивают методом накопительной культуры на модифицированной среде Тренкеншу разбавленной водой 1:1 при освещении 6 кЛк. Затем культуру переносят в неразбавленную модифицированную среду Тренкеншу и продолжают культивировать при искусственном освещении люминесцентными лампами дневного света 80 Вт·м^-2 в накопительном режиме при непрерывном барботаже газовоздушной смесью (1 л·мин^-1·л^-1 культуры), содержащей 3% СO₂ (по объёму). Для засева культиваторов используют активно делящуюся культуру, взятую на линейной стадии роста, когда её продуктивность максимальна. Суспензию клеток вносят в культиваторы из такого расчета, чтобы начальная плотность культур составляла не менее 0,1-0,2 г·л^-1 сухого вещества. Процесс культивирования. Питательной средой для предлагаемого способа культивирования служит модифицированная среда Тренкеншу. Модификация заключается в увеличении солености среды за счет добавления хлорида натрия или морской соли до концентрации 120 г/л. Выращивание водоросли осуществляют при поверхностной освещенности культиваторов около 80 Вт·м^-2, скорости продувки газовоздушной смесью 1 л·мин^-1·л^-1 культуры, содержащей 3% СO₂ и температуре питательной среды 26-28°С. Первоначально D. salina культивируют в накопительном режиме на модифицированной среде Тренкеншу до плотности культуры 1,5 - 3 г ОВ·л^-1. Далее культуру переводят на квазинепрерывный режим, т.е. с интервалом в 24 часа из культиваторов отбирают 10-40% объема культуры, заменяя его равноценным объемом свежей среды.

Для установления условий культивирования, способствующих накоплению в клетках пигментов и белка, культивирование D. salina проводили в четырёх вариантах квазинепрерывного режима в 6-литровых культиваторах на модифицированной питательной среде Тренкеншу при круглосуточной поверхностной освещенности 80 Вт·м², со скоростью продувки газовоздушной смесью 1 л смеси·мин^-1·л^-1 культуры, содержащей 3% СO₂ и температуре 26-28°С. Объем культуры в культиваторах составлял 5л, начальная плотность культуры -0,12 г ОВ·л^-1. Каждые 24 часа из культиваторов отбирали 12, 14, 32 и 42% объема культуры (ω=0,12-0,42 сут^-1) и заменяли его равноценным объемом свежей среды.

При квазинепрерывном режиме происходит систематическое внесение биогенов в культуру, и с увеличением удельной скорости протока количество азота и фосфора, вносимого в культуру, пропорционально увеличивается. При этом плотность культуры изменяется и достигает стационарного динамического равновесия (фиг. 1, табл. 2).

Кроме того, наблюдается изменение и стабилизация относительного содержания фотосинтетических пигментов и белка в связи с изменившимися условиями по минеральному обеспечению и освещённости (на фоне изменения плотности культуры) (фиг. 2, фиг. 3, табл. 2).

Общий выход биомассы D. salina при квазинепрерывном культивировании складывается из ежедневных 10-40% отборов биомассы и биомассы, собираемой из культиваторов по окончании технологического цикла. Данные, характеризующие продуктивность культуры D. salina по биомассе, пигментам и белку при квазинепрерывном режиме культивирования представлены в табл. 3.

Ежедневное внесение нитратов и фосфатов обеспечивает поддержание клеток в культуре в вегетативном состоянии. В предлагаемом способе культивирования величина скорости протока находится в диапазоне 0,1-0,4 сут^-1, но по результатам проведённых экспериментов наибольшая продуктивность по пигментам и белку зарегистрирована при удельной скорости протока среды около 0,3 сут ^-1 (ежедневный 30% обмен среды). В этом случае продуктивность культуры D. salina по биомассе составляет 0,45 г ОВ·л^-1, по хлорофиллу а - 12, каротиноидам - 4, белку - 250 мг·л ^-1 сут ^-1.

Пример.

Для культивирования использовали штамм IBSS-2, который характеризуется более высоким содержанием каротиноидов, по сравнению со штаммами IBSS-1 и IBSS-3.

Для получения инокулята штамм в течение 7 суток выращивали методом накопительной культуры в культиваторах плоскопараллельного типа объёмом 6 л с рабочей толщиной слоя 5 см при поверхностном освещении 80 Вт·м^-2 на модифицированной питательной среде Тренкеншу. Полученную культуру использовали в качестве инокулята. Культуру переносили в аналогичные культиваторы, содержащие свежую модифицированную питательную среду Тренкеншу и продолжали выращивать в течение 10 суток при тех же условиях, при непрерывном барботаже газовоздушной смесью со скоростью 1 л мин ^-1·л ^-1 культуры, содержащей 3% СO₂ и температуре 26-28°С до плотности культуры 1,5-3 г ОВ·л^-1.

Далее культивирование D. salina проводили в квазинепрерывном режиме в 6-литровых культиваторах на модифицированной питательной среде Тренкеншу при круглосуточной поверхностной освещенности 80 Вт·м^-2, скорости продувки газовоздушной смесью 1 л·мин ^-1·л ^-1 культуры, содержащей 3% СO₂ и температуре 26-28°С. Объем культуры в культиваторах составлял 5 л, начальная плотность культуры - около 0,12 г ОВ·л^-1. Каждые 24 часа из культиваторов отбирали около 30% объема культуры (ω = 0,30 сут^-1) и заменяли его равноценным объемом свежей среды. Полученная биомасса составляла около 0,5 г ОВ с 1 л культуры в сутки при относительном содержании каротиноидов в биомассе не менее 0,9 % ОВ, хлорофилла a - 2,8% ОВ и белка - 55 % ОВ.

В предлагаемом способе продуктивность по биомассе в 25 раз выше, чем в известном. Способ эффективный и может быть положен в основу промышленного культивирования одноклеточной зеленой водоросли Dunaliella salina и получения сырья для производства БАД с повышенной биодоступностью каротиноидов и хлорофиллов как биологически активных соединений.

Способ культивирования одноклеточной зеленой микроводоросли Dunaliella salina для получения биомассы с использованием квазинепрерывного режима культивирования. Культуру, выращенную на модифицированной питательной среде Тренкеншу методом накопительных культур до плотности 1,5-3 г ОР·л^-1 переводят в квазинепрерывный режим культивирования. Дальнейшее выращивание осуществляют при удельной скорости протока среды около 0,3 сут^-1, при круглосуточном освещении с поверхностной освещенностью 80 Вт·м^-2, непрерывной продувке газовоздушной смесью со скоростью 1 л смеси·мин^-1·л^-1 культуры, которая содержит 3 % СО₂, и температуре 26-28°С, на модифицированной питательной среде Тренкеншу. Полученная биомасса составляла около 0,5 г ОВ с 1 л культуры в сутки при относительном содержании каротиноидов в биомассе не менее 0,9 % ОВ, хлорофилла а - 2,8% ОВ и белка - 55% ОВ.

Способ культивирования одноклеточной зеленой микроводоросли Dunaliella salina для получения биомассы, в котором используют квазинепрерывный режим культивирования, отличающийся тем, что культуру, выращенную на модифицированной питательной среде Тренкеншу методом накопительных культур до плотности 1,5-3 г ОВ·л^-1, переводят в квазинепрерывный режим культивирования и осуществляют дальнейшее выращивание при удельной скорости протока среды около 0,3 сут^-1 при круглосуточном освещении с поверхностной освещённостью 80 Вт·м^-2, непрерывной продувке газовоздушной смесью со скоростью 1 л смеси·мин^-1·л^-1 культуры, содержащей 3% СО₂ и температуре 26-28°С, на модифицированной питательной среде Тренкеншу, имеющей состав, г·л^-1:
Морская соль 120 NaNO₃ 2,139 NaH₂PO4 × 2H2O 0,30 Na₂EDTA 0,037 FeC₆H₅O₇ × 7H₂O 0,042 MnCl₂ × 4H₂O 0,0040 СоСl₂ × 6Н₂О 0,0031 (NH₄)₆Mo₇О₂₄ × 4H₂O 0,0009 K₂Cr₂(SO₄)₄ × 24H₂O 0,0017