Способ получения ферментного препарата нигедазы Советский патент 1992 года по МПК C12N9/18 

сл

с

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способу получения ферментного препарата нигедазы. Цель изобретения - повышение липолитической активности и выхода целевого продукта, снижение его себестоимости. Способ заключается в том, что семена активируют водой, измельчают, обрабатывают ацетоном, экстрагируют, экстракт подвергают концентрированию ультрафильтрацией при 5 - 9°С и одновременно фракционированию на фракции, содержащие целевой продукт с мол.м. 15 - 100 тыс. дальтон и пермеат, который используют в качестве экстрагента в соотношении 2:1 с водно-аммиачным раствором. 2 табл.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способу получения ферментного препарата нигедазы.

Известен способ получения ферментного препарата нигедазы из семян чернушки дамасской (Nigella damascene L), предусматривающий измельчение сырья, обработку его ацетоном и экстракцию фермента из полученного ацетонового порошка водным раствором аммиака с последующей лиофи- лизацией целевого продукта.

Наиболее близким к предлагаемому является способ получения ферментного препарата нигедазы из семян растений вида Nigella damascene L., предусматривающий активацию семян водой, измельчение их, обработку ацетоном, экстракцию фермента водно-аммиачным раствором и сублимационную сушку.

Однако по известному способу получают нигедазу с недостаточно высокой липо- литической активностью, поскольку в

экстракте содержится много балластных сухих веществ, которые снижают активность целевого продукта, а также имеет место загрязнение окружающей среды продуктами продувки водно-аммиачного экстракта, содержащими активную субстанцию фермента нигедазы.

Цель изобретения - повышение липолитической активности и выхода целевого продукта, а также снижение его себестоимости.

Для достижения указанной цели концентрирование водно-аммиачного экстракта фермента осуществляют путем ультрафильтрации при 5 - 9°С с одновременным разделением экстракта на фракции, одна из которых содержит целевой продукт с мол.м. 15 - 100 тыс.дальтон, а другая - пермеат, который рециркулируют на стадию экстракции в качестве экстрагента в смеси с водно-аммиачным раствором в соотношении 2:1.

4

О

4

Способ заключается в следующем.

Семена Nigella damascene L. взвешивают и загружают в аппарат, имеющий термо- статирующее устройство. Слой семян заливают водой и выдерживают при 37 ±2°С в течение 24 ч, проводят активацию семян. После этого воду сливают, влаж- ные семена выгружают и подают на измельчение до частиц размером 0,3 - 0,4 мм. Измельченные семена загружают в аппарат и заливают ацетоном для их обезжиривания в течение 30 мин при 7±2°С. После этого ацетон сливают, семена вакуу- мируют для удаления следов ацетона, Обезжиренные семена загружают в аппарат с мешалкой, в который подают десятикратный объем дистиллированной воды с добавкой водного раствора аммиака (экстрагент имеет рН 10,5). Процесс экстракции ведут при 5 - 9°С в течение 35 ±5 мин. После этого содержимое аппарата подают на фильтрацию для отделения отработанных измельченных семян и получают слабый водно-аммиачный экстракт с содержанием сухого вещества около 1 %. Полученный экстракт поступает на УФ-установку, где его подвергают концентрированию до содержания сухих веществ 8 - 8,5% при температуре экстракции 5 - 9°С с одновременным фракционированием и получением двух продуктов; целевого с липолитической активностью 750 ЛЕ/мг и мол.м. 15 - 100 тыс.дальтон и фильтрата, содержащего балластные вещества, не обладающие липолитической активностью, который возвращают на стадию экстракции семян в смеси с водно-аммиачным раствором в соотношении 2:1.

П р и м е р 1. Семена в количестве 500 г экстрагируют смесью водно-аммиачного раствора в количестве 630 см и фильтрата в количестве 1260 см3. Получают 1780 см3 экстракта с содержанием сухого вещества 0,96%. Данный экстракт направляют на фракционирование и коцентрирование в УФ-установку полуволоконного типа с мембранами, ВПУ-15 на основе фенилона. Эти мембраны задерживают растворение вещества с минимальной мол.м. 15 тыс.дальтон при селективности 98%. Процесс фракционирования и концентрирования осуществляют при 5°С и 0,015 МПа до содержания сухих веществ в концентрате 8,1 % с переходом в фильтрат растворенных веществ с мол.м. 10 тыс.дальтон, не обладающих липолитической активностью и являющихся балластом. Полученный фильтрат в количестве 1580 см3 возвращают на стадию экстракции, целевой продукт в количестве 200

см с содержанием сухих веществ 8,1% и активностью 750 ЛЕ/мг направляют на сублимационную сушку, которую проводят ступенчато при температуре от минус 45 до

плюс 30°С. Из 700 см3 исходного экстракта получают 6,7 г готового препарата с активностью 121 ЛЕ/мг. Из 200 см3 концентрированного экстракта получают 16,5 г готового препарата с активностью 750 ЛЕ/мг. В

фильтрат перешло 0,5 г растворенных сухих веществ, не обладающих липолитической активностью. Таким образом, при повышении липолитической активности препарата в 6 раз удельный выход его с единицы высушиваемого сублимацией экстракта увеличился с 6,7:0,7 9,57 г/дм3 до 16,5:0,2 82,5 г/дм3, т.е. в 8,62 раза. Соответственно в 8,62 раза сократятся энергозатраты на сублимационную сушку.

П р и м е р 2. Процесс экстракции и сушки ведут по примеру 1, а фракционирование и концентрирование осуществляют на УФ-установке с мембранами ВПУ-50 на основе фенилона при 9°С до содержания

сухого вещества 8,0%. Эти мембраны задерживают растворенные вещества с минимальной мол.м. 50 тыс.дальтон. Целевой продукт имеет активность 520 ЛЕ/мг, а фильтрат - 240 ЛЕ/мг. Из 700 см3 исходного

экстракта получают 6,8 г готового продукта с активностью 124 ЛЕ/мг, из 140 см концентрированного экстракта получают 11,5 г готового препарата с активностью 520 ЛЕ/мг. В фильтрат перешло 5,5 г растворенных сухих веществ и его липолитическая ак- тивность составила 240 ЛЕ/мг, что недопустимо.

П р и м е р 3. Процесс экстракции и сушки ведут по примеру 1, а фракционирование и концентрирование осуществляют при 7°С до содержания сухих веществ 8,0% на УФ-установке с мембранами ВПУ-100 из фенилона. Эти мембраны задерживают растворенные вещества с минимальной мол.м.

100 тыс.дальтон.

Из 700 см3 исходного экстракта получают г готового препарата с активностью 126 ЛЕ/мг. Из 30 см3 концентрированного экстракта получают 2,5 г готового препарата с

активностью 12 ЛЕ/мг. В фильтрат перешло 14,5 г растворенных сухих веществ и его липолитическая активность составила 124 ЛЕ/мг, т.е. практически все растворенные вещества, определяющие активность препарата, перешли в фильтрат. Таким образом, верхний предел молекулярных масс растворенных веществ, определяющих активность препарата, составляет 100 тыс.дальтон.

Указанные параметры являются оптимальными, так как, если вести процесс фракционирования и концентрирования до содержания сухого вещества, с мол.м. менее 15 тыс. и более 100 тыс.дальтон, то в целевом продукте накапливаются балластные вещества, что снижает активность препарата. Балластные вещества с мол.м. свыше 100 тыс.дальтон при концентрировании свыше 1 % сухих веществ слипаются и образуют коллоидную фазу, которая отделяется на стадии предварительного фильтрования. Температура 5 - 9°С является также оптимальной, так как при температуре меньше 5°С резко снижается скорость ультрафильтрации, а при температуре выше 9°С снижается стабильность нигедазы-суб- станции вследствие ее закисания.

В табл. 1 и 2 приведены показатели процесса.

Таким образом, предлагаемый способ обеспечивает высокий выход продукта с высокой липолитической активностью.

0

5

0

Формула изобретения Способ получения ферментного препарата нигедазы из семян растений вида Nigella damascene L, предусматривающий активацию семян водой, измельчение их, обработку ацетоном, экстракцию фермента водно-аммиачным раствором, фильтрование, концентрирование и сублимационную сушку экстракта, отличающийся тем, что, с целью повышения липолитической активности и выхода целевого продукта, а также снижения его себестоимости, концентрирование водно-аммиачного экстракта фермента осуществляют путем ультрафильтрации при 5 - 9°С с одновременным разделением экстракта на фракции, одна из которых содержит целевой продукт с мол.м. 15 - 100 тыс.дальтон, а другая - пермеат, который рециркулируют на стадию экстракции в качестве экстрагента в смеси с водно-аммиачным раствором в соотношении 2:1.

Таблица 1

Показатели процесса

Удельный выход из экстракта, высушиваемого сублимацией, г/дм

Липолитическая активность ЛЕ/мг при степени концентрирования 8,1 %

Себестоимость. руб/кг

Таблица 2

Прототип

Предлагаемый способ

82,5

750 500