СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГИАЛУРОНИДАЗЫ Российский патент 1995 года по МПК C12N9/26 

Изобретение относится к энзимологии, в частности к способам получения ферментов, которые могут быть использованы в качестве субстанций для лекарственных препаратов.

Известен способ получения гиалуронидазы путем измельчения семенников убойных животных, экстракции из них фермента физиологическим раствором, содержащим 0,25% хлороформа, центрифугирования, высушивания экстракта в сублимационном аппарате при 60-70^оС, обработки порошка ацетоном [1].

Однако известный способ не обеспечивает высокого выхода целевого продукта, полученный препарат обладает низкой удельной активностью и содержит много балластных белков, что нежелательно при его использовании в медицине. Кроме того, применение ацетона в производстве взрыво- и пожароопасно.

Известен способ получения гиалуронидазы из семенников крупного рогатого скота [2] , по которому исходные замороженные сухим льдом ткани тестикул гомогенизируют в равном количестве воды. К полученной суспензии добавляют ледяную уксусную кислоту до рН 4,0 и оставляют при 4-5^оС на 15 ч. Осадок отделяют центрифугированием и экстрагируют дополнительной водой. Надосадочные фракции объединяют, доводят рН до 4,5, добавляют сульфат аммония до 10-12% -ного насыщения и осадок части балластных белков отделяют центрифугированием. К супернатанту добавляют сульфат аммония до 30-40%-ного насыщения, осадок, содержащий ферментативную активность, отделяют центрифугированием, растворяют, диализуют против холодной проточной воды в течение 24 ч и лиофилизуют. Все операции проводят при 0-5^оС.

Выход составляет 2,5 г (0,25%) из 1 кг исходного сырья. Активность 54.4 усл.ед. в 1 мг.

Основным недостатком этого способа получения гиалуронидазы являются многостадийность процесса, использование нескольких стадий, включающих центрифугирование, и невысокая удельная активность препарата. Кроме того, применение сульфата аммония, обладающего пирогенными свойствами, создает дополнительные трудности при получении препарата медицинского назначения. Полное удаление сульфата аммония из субстанции активного вещества требует длительного диализа, что является нетехнологичным процессом. При использовании этого способа получения гиалуронидазы в промышленности возникают экологические проблемы из-за большого расхода сульфата аммония.

Наиболее близким к предлагаемому является способ получения, согласно которому семенники крупного рогатого скота измельчают, экстрагируют фермент водным раствором уксусной кислоты, отделяют экстракт от осадка центрифугированием, очищают его сорбцией фермента на белой глине и десорбируют при рН 4,5-4,7 [3].

Преимущество предлагаемого способа по сравнению с известным способом-прототипом заключается в повышении удельной активности целевого продукта - 140 усл.ед. в мг против 10-20 усл.ед./мг.

Предлагаемый способ получения гиалуронидазы заключается в следующем.

Замороженные семенники убойных животных измельчают в гомогенизаторе, гиалуронидазу экстрагируют из них разбавленной уксусной кислотой, полученный экстракт концентрируют ультрафильтрацией в тангенциальном потоке, часть балластных белков удаляют осаждением из раствора 15% полиэтиленгликоля со средней молекулярной массой 1-20 тыс. Да и последующей катинообменной хроматографией на СМ-целлюлозе.

Определяющими отличиями предлагаемого способа получения гиалуронидазы от способа-прототипа являются:
концентрирование экстракта осуществляют ультрафильтрацией в экспериментально подобранном оптимальном режиме, что позволяет повысить удельную активность целевого продукта при практически полном сохранении его суммарной активности;
очистку целевого продукта от балластных белков проводят добавляя к концентрату полиэтиленгликоль (ПЭГ) и осаждая балластные белки. Дополнительную очистку проводят с помощью катионообменной хроматографии.

Ультрафильтрационный процесс концентрирования и разделения белков характеризуется высокой экономичностью, эффективностью и в последнее время находит все более широкое применение в лабораторной практике и промышленной биотехнологии. Ультрафильтрационные установки с тангенциальным потоком жидкости на основе полых волокон имеют развитую площадь фильтрации и считаются наиболее эффективными и надежными в эксплуатации. Вместе с тем использование ультрафильтрации для концентрирования растворов грубых экстрактов биологически активных веществ не является очевидной, традиционной процедурой, так как в каждом случае требует специального исследования для тщательного подбора условий ведения процесса и типа используемых мембран или волокон. Это обусловлено тем, что целевые белки и, в частности, ферменты могут значительно инактивироваться при концентрировании за счет явлений концентрационной поляризации на поверхности волокон, их денатурирующего воздействия, а также разрушаться протеазами, присутствующими в исходных смесях белковых компонентов.

В результате проведенных исследований были найдены оптимальный для эффективной экстракции и концентрирования ультрафильтрацией состав буферного раствора и тип полых волокон.

Для концентрирования экстракта был использован разделительный аппарат АР-0,1 с полыми волокнами из фенилона С-типа 15ПА. Однако в процессе ультрафильтрации наблюдалось значительное снижение активности гиалуронидазы. Применение для концентрирования аналогичного разделительного аппарата АР-0,1 с волокнами типа 50 ПА с диаметром пор, близким к размерам гиалуронидазы, позволило устранить эту потерю активности. Различие в эффективности двух типов волокон, вероятно, обусловлено тем, что узкопористые волокна одновременно с целевой гиалуронидазой концентрируют примесные протеазы, которые при этом расщепляют часть целевого продукта. Широкопористые волокна удаляют большее количество балластных белков, включая протеазы, и кроме того позволяют увеличить скорость концентрирования.

При ультрафильтрации на разделительном аппарате с этим типом полых волокон происходит не только концентрирование, но и дополнительная очистка фермента за счет удаления с фильтратом половины балластных белков с молекулярной массой менее 50 КДа при практически полном сохранении исходной активности гиалуронидазы.

Для осаждения части балластных белков применяли ПЭГ. Использование для этой цели 5-25% ПЭГ показало, что оптимальной является концентрация 15%, при которой наблюдается максимальное удаление балластных белков при сохранении собственно целевого продукта в растворе. Применение ПЭГа со средними молекулярными массами 1000, 1500, 6000 или 20000 дает примерно одинаковые результаты и удаляет 70% балластных белков из используемого концентрата.

На заключительной стадии очистки гиалуронидазы использовали катионообменную хроматографию, что позволяет дополнительно повысить удельную активность фермента. Преимущественно проводили хроматографию на карбок- симетилцеллюлозе фирмы "Whatman". Этот сорбент входит в перечень хроматографических носителей, разрешенных для производства медицинских иммунобиоло- гических препаратов.

Полученная на предыдущей стадии очистки надосадочную жидкость наносили на катинообменную колонку, промывали буфером и элюировали фермент буфером, содержащим 0,6 М NaCl.

Полученный препарат в 100 мл содержал 780 мг белка (0,078% от массы исходного сырья) и имел удельную активность 140 усл.ед. в 1 мл, т.е. превышал удельную активность фермента, полученного по известному способу-прототипу, в 27 раз.

Предлагаемый способ получения гиалуронидазы позволяет получить препарат, практически свободный от бычьего сывороточного альбумина (БСА) - одного из белков, вызывающих аллергические реакции организма. Способ экономичен, он требует меньшего расхода реактивов на единицу целевого продукта, экологически чище, взрыво- и пожаробезопаснее.

В связи с тем, что в известных научно-технических и патентных источниках сведений об аналогичном способе получения гиалуронидазы не обнаружено, можно сделать вывод о том, что заявляемое техническое решение отвечает критериям "новизна и изобретательский уровень".

П р и м е р 1. 1 кг замороженных семенников убойных животных измельчают в гомогенизаторе, добавляют 2,5 л воды, 18 мл ледяной уксусной кислоты, перемешивают и оставляют при 4-5^оС на 2-12 ч. Далее все операции проводят при 0-5^оС. Экстракт отделяют от осадка центрифугированием при 5.000g 10 мин и концентрируют до 0,1 л на установке УПЛ-0,6 с полыми волокнами 50ПА. Концентрат диафильтруют на этой же установке, используя 0,2 л буфера, содержащего 0,05 М NaAc и 0,15 М NaCl рН 4,7. К концентрату добавляют ПЭГа с молекулярной массой 1500 до 15% (вес/объем), перемешивают и оставляют на 2-12 ч. Осадок центрифугируют и отбрасывают. Супернатант в объеме 110 мл наносят на катионообменную колонку с СМ-целлюлозой "Whatman" (3х7 см), уравновешенную 0,05 М NaCl, рН 4,7. Колонку промывают 0,2 М NaCl, растворенного в этом же буфере, и фермент элюируют 0,1 л 0,6 М NaCl в 0,05 М NaAc рН 4,7.

Выход гиалуронидазы составил 780 мг (0,078% к массе исходного сырья) с удельной активностью 140 усл.ед. в 1 мг.

П р и м е р 2. Все операции проводят как описано в примере 1, используя для ультрафильтрации половолоконный разделительный аппарат АР-15ПА.

Выход гиалуронидазы при этом составил 840 мг (0,084% к массе исходного сырья) с удельной активностью 40 усл.ед. в 1 мг.

П р и м е р 3. Все операции проводят как описано в примере 1, используя 13% ПЭГ.

Выход составил 840 мг с удельной активностью 105 усл.ед. в 1 мг.

П р и м е р 4. Все операции проводят как описано в примере 1, используя 18% ПЭГ.

Выход фермента составил 540 мг (0,054% к массе исходного сырья) с удельной активностью 130 усл.ед. в 1 мг.

П р и м е р 5. Способ проводят по примеру 1. При этом катионообменную хроматографию проводят на смоле КБ-2Э-7, проводя сорбцию гиалуронидазы при рН 4,7, а десорбцию при этом же рН 0,6 М NaCl. Выход фермента при этом составил 360 мг (0,036% к массе исходного сырья) с удельной активностью 80 усл.ед./мг.

Использование: биотехнология и может быть использован в качестве субстанций для лекарственных препаратов. Сущность изобретения: замороженные семенники убойных животных гомогенизируют, экстрагируют из них гиалуронидазу разбавленной уксусной кислотой, отделяют экстракт центрифугированием, полученный экстракт концентрируют ультрафильтрацией в тангенциальном потоке, удаляют часть балластных белков осаждением полиэтиленгликолем в концентрации 5 - 25 мас.% с последующей катионообменной хроматографией. Технический результат: повышение удельной активности целевого продукта, очистка препарата от бычьего сывороточного альбумина. 1 з.п.ф-лы.

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГИАЛУРОНИДАЗЫ, предусматривающий экстракцию фермента из измельченных семенников крупного рогатого скота водным раствором уксусной кислоты, отделение экстракта центрифугированием, очистку целевого продукта на сорбенте и сушку, отличающийся тем, что полученный после центрифугирования экстракт концентрируют ультрафильтрацией в тангенциальном потоке с пределом задержания по молекулярной массе до 50 КДа и проводят осаждение балластных белков полиэтиленгликолем, очистку ведут катионообменной хроматографией с сорбцией фермента при pH 4,5 - 4,9 и элюцией при этом же pH 0,6 MNaCl. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что концентрацию полиэтиленгликоля устанавливают 5 - 25 мас.%.