Способ определения спонтанной агрегации тромбощитов Советский патент 1992 года по МПК G01N33/483 

Изобретение относится к медицине, а именно к способам диагностики и контроля заболеваний, связанных с нарушением функций форменных элементов крови и их исследования, и может быть использовано для диагностики и контроля тромбофилических состояний в гематологической, кардиологической, хирургической практике и других областях медицины.

Цель изобретения - повышение точности исследования.

Поставленная цель достигается путем определения количества единичных тромбоцитов в трех пробах крови с 4 - 5%-ным буферированным раствором ЭДТА - Na, 4 - 5%-ным буферированным раствором ЭДТА - Na с 1%-ным формалином и 0,9%-ным

буферированным раствором хлорида натрия с 1%-ным формалином с помощью автоматического счетчика клеток Лаберскель с последующим сопоставлением полученных результатов и расчетом индексов обратимой спонтанной агрегации тромбоцитов, активации тромбоцитов суммарной спонтанной агрегации тромбоцитов.

Способ осуществляют следующим образом.

По 0,2 мл крови, полученной самотеком в сухую пластиковую пробирку при венопун- кции, немедленно переносят автоматической пипеткой с пластиковым наконечником в три пластиковые пробирки, содержащие соответственно по 1.8мл. 4-5% буфериро2 со

о

Ч

ванного раствора ЭДТА - Na, 4 - 5% буферированного раствора ЭДТА - Na с 1 %-ным формалином и 0,9% буферированного раствора хлорида натрия с 1 %-ным формалином (в качестве буфера используется буфер Михаэлиса-веренал-ацетэтный, рН готовых растворов 7,4). Пробирки закрывают пластиковыми пробками, пробы аккуратно перемешивают (без встряхивания) и центрифугируют 60 с (при условии, что вре- мя разгона и торможения ротора центрифуги не превышает 60 с) при 95 - ЮОд (около 1000 об/мин). Из среднего слоя полученных супернатантов берут автоматической пипеткой с пластиковым наконечником 0,02 мл и переносят в силиконированный стеклянный стаканчик с 12,5 мл 0,9% раствора хлорида натрия. Из приготовленного разведения (1:6300) после перемешивания считают тромбоциты из трех проб последовательно на автоматической системе Лаборскель при следующих параметрах: диаметр измерительного капилляра 70 мк., режимы: ID, 70, 1ц, М. Устанавливаются пороги дискриминации: верхний ШВ.,ниж- ний 0,4 В (подсчет тромбоцитов может производиться также любым из известных традиционных методов).

Производят вычисление следующих показателей. Индекс обратимой спонтанной агрегации тромбоцитов (ИОСАТ): ИОСАТ

д U

хЮО%, где а - количество единича,,

ных тромбоцитов из 1 пробы /(4-5-ный буферированный раствор ЭДТА - Na), в - количество единичных тромбоцитов из 2 пробы (4 - 5%-ный буферированный рас- гвор ЭДТА - Na с 1 %-ным формалином).

В норме этот показатель 0 - 15%. Индекс активации тромбоцитов (ИАТ): ИАТ

---- хЮО%, b - количество единичных

3

тромбоцитов из 2 пробы, с - количество единичных тромбоцидов из 3 пробы (0.9%-ный буферированный раствор хлорида натрия с 1 %-ным формалином), В норме этот показатель 0-5%.

Суммарный индекс спонтг иной агрегации тромбоцитов (СИСАТ): СИСАТ а С

а

В норме

этот

х100% ИОСАТ + ИАТ показатель 0 - 20%.

П р и м g р 1. Больная У.. 35 лет, история болезни 3567, поступила в реанимационное отделение РКГИОВ 29.10 1988 г. с диагнозом токсикс-аллергический васкулит, осложнившийся ДВС-син/,ромсм. Из вены больной была взята кровь по 0,2 мл в 7 пластиковых пробирок, содержащих по 1,8 мл буферированного рзствора с онцентра510 152025

30

35

40

45

50

цией ЭДТА -- Na соответственно: 0,5, 1;0, 2,0, 3,0, 4,0, 6,0, 5,0% в 7 пластиковых пробирок, содержащих по 1,8 мл буферированного раствора ЭДТА - Na в вышеуказанных концентрациях с 1 %-ным формалином и в пластиковую пробирку с 1,8 мл 0,9%-ного буферированного раствора хлорида натрия с 1 %-ным формалином. Пробы были отцен- трифугированы 60с при ЮОд. Затем на автоматической системе Лаборсколь были подсчитаны единичные тромбоциты из среднего слоя полученных супернатантов. Наибольшее количество единичных тромбоцитов определено в пробах с концентрацией ЭДТА - Na 4 и 5% (210 ± 5х10Э/мкл), что свидетельствует о наиболее выраженном анти- и дезагрегационном эффекте препарата в данных концентрациях. В пробах с концентрацией ЭДТА-Na меньше4% количество единичных тромбоцитов было меньше 210 ± 5x10 /мкл и снижалось по мере снижения концентрации ЭДТА - Na в растворе, что свидетельствует о недостаточном анти- и дезарегационном эффектах препарата в исследованных концентрациях. При увеличении концентрации ЭДТА - Na в растворе до 6% количество единичных тромбоцитов снизилось до 180 ± Зх103/мкл, что связано с повреждающим действием высоких концентраций ЭДТА - Na в растворе на тромбоциты. Аналогичная динамика содержания единичных тромбоцитов наблюдалась и во второй серии проб крови, стабилизированных указанными концентрациями ЭДТА - Na с добавлением 1 % формалина, т.е. самое высокое их содержание определялось в пробах второй серии (ЭДТА - Na с 1 %-ным формалином) с концентрацией ЭДТА - Na 4 и 5% и было достоверно ниже, чем в пробах первой серии (ЭДТА - Na) с соответствующими концентрациями ЭДТА - Na без формалина - 110 ± ЗхЮ3/мкл. Количество единичных тромбоцитов в пробе, стабилизированной в 0,9%- ном буферированном растворе хлорида натрия с 1 %-ным формалином, составило 95 ±4x10 /мкл. Был произведен расчет индексов.

Индекс обратимой спонтанной агрегации тромбоцитов (ИОСАТ) по формуле: а-Ь

55

ИОСАТ

х 100 % -% х 100 %.

а 210

47,6%, что более чем в три раза больше нормы (0- 15%).

Индекс активации тромбоцитов (ИАТ)

по формуле: ИАТ -- с х100%

-11jj1Q95 x100% 7,1%, что превышает

норму почти в 1,5 раза (0 - 5%).

Суммарный индекс спонтанной агрегации тромбоцитов (СИ CAT) по формуле: СИ- 5

CAT

х100% ИОСАТ + ИАТ

47,6 + 7,1 54,7%, что более чем в 2 раза превышает норму (0 - 20%).

В приведенных формулах а - количест- во единичных тромбоцитов в супернатанте 1 пробы, в - количество единичных тромбоцитов в супернатанте 2 пробы, с - количество единичных тромбоцитов в супернатанте 3 пробы.

Таким образом, у больной был диагнос- цирован гиперагрегационный синдром с высоким риском тромботических осложнений, что послужило основанием для назначения антиагрегантов. При последующем контроле на фоне проводимой антиагрега- ционной терапии ИОСАТ снизился до 25,3%, ИАТ-до 5,3%, СИСАТ - до 30,6%.

При исследовании контрольной группы доноров из 110 человек от 20 до 45 лет были проведены описанные исследования и установлено, что наибольшее количество единичных тромбоцитов определяется в буферированных растворах с 4 - 5%-ной концентрацией ЭДТА - Na в растворах с той же концентрацией ЭДТА - Na с 1 %-ным формалином количество единичныхтромбо- цитов достоверно меньше, в 0,9%-ном буферированном растворе хлорида натрия с 1 %-ным формалином - еще меньше. При проведении сравнительных расчетов были установлены три описанных индекса и определены границы их нормальных показателей: ИОСАТ от 0 до 15%, ИАТ -от 0 до 5%, СИСАТ-от 0 до 20%.

П р и м е р 2. Больной А., 17 лет, история болезни 2987, поступил в гематологическое отделение РКГИОВ 03.09.1988 г. с диагнозом геморрагический васкулит, кожно-сус- тавная форма. Из вены больного была взята кровь по 0,2 мл в 3 пластиковые пробирки с 1,8 мл растворов соотве-.ственно: 1 - с 5%- ным буферированным раствором ЭДТА-Na 2-е 5%-ным буферированным раствором ЭДТА - Na с 1 %-ным формалином и 3 - с 0,9%-ным буферировнным раствором хлорида натрия с 1 %-ным формалином. Пробы

были отцентрифугированы 60 с при ЮОд. Затем на автоматической системе Лабор- скель было подсчитано количество единич- ных тромбоцитов из среднего слоя полученных супренатантов. Определено: в 1 пробе 325x10 /мкл тромбоцитов, во 2 пробе 310х103/мкл тромбоцитов, в 3 пробе

260x103/мкл тромбоцитов. Были рассчитаоос Tin ны индексы: ИОСАТ 325 х100%

4,6%, ИАТ -°з5 хЮО% - 15,4% и

СИСАТ хЮО% 20%. Таким

образом, ИОСАТ и СИСАТ находились в пределах нормы, а ИАТ, свидетельствующий о высокой потенциальной гиперагрега- ционной способности тромбоцитов, более чем в три раза превышал норму. Полученные результаты послужили основанием для назначения больному антиагрегационной терапии. При последующем контроле описанным способом на фоне антиагрегационной терапии ИОСАТ и СИСАТ оставались в пределах нормы: 4,5% и 11,4% соответственно, а ИАТ снизился до 6,9%. Формула изобретения Способ определения спонтанной агрегации тромбоцитов, включающий взятие пробы кроаи, внесение ее в две пробирки, добавление в первую пробирку стабилизатора ЭДТА - Na, во вторую - ЭДТА - Na и 1 %-ный раствор формалина, центрифугирование с последующим подсчетом в супернатанте количества единичных тромбоцитов, отличающийся тем, что, с целью повышения точности способа за счет расширения его информативности, дополнительно пробу крови вносят в третью пробирку, куда добавляют 0,9%-ный раствор NaCI и формалин, в каждую пробирку добавляют буферный раствор для создания рН 7,4, при этом стабилизатор добавляют в виде 4 - 5%-ного раствора, затем подсчитывают количество единичных тромбоцитов в каждой пробирке с последующим расчетом индексов обратимой спонтанной агрегации, активации и суммарной спонтанной агрегации тромбоцитов и по полученным результатам определяют спонтанную агрегацию тромбоцитов.

Использование: в медицине, а именно для диагностики и контроля заболеваний, связанных с нарушением функций ферменных элементов крови и их исследования, Цель - повышение точности исследования. Сущность изобретения: по 0,2 мл крови, полученной самотеком в сухую пластиковую пробирку при венепункции, немедленно переносят в три пластиковые пробирки, содержащие соответственно по 1,8 мл 4 -5%-ного буферированного раствора ЭДТА - Na, 4 - 5%-ного буферированного раствора ЭДТА 7. 1 .-, r Nac 1 %-ным формалином и 0,9%-ного буферированного раствора хлорида натрия с 1 %- ным формалином. Пробы перемешивают и центрифугируют 60 сек. при 95 - ЮОд. В полученных супернатантах определяют количество единичных тромбоцитов, рассчитывают индекс обратимой спонтанной агрегации тромбоцитов (ИОСАТ) по форму- а-Ь ле ИОСАТ х 100%, где а - количество тромбоцитов в супернатанте 1-ой пробы; b - количество тромбоцитов в супернатанте 2-ой пробы и при увеличении его свыше 15% определяют внутрисосудистую гиперагрегацию тромбоцитов, индекс активации тромбоцитов (ИАТ) по формуле х100%, где с - количество тромбоци3 тов в супернатанте 3-ей пробы и полученным результатам определяют спонтанную агрегацию тромбоцитов. СП С