Способ определения фактора Виллебранда в плазме крови Советский патент 1993 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к медицине, а именно к способам диагностики заболеваний, связанных с нарушением функции форменных элементов крови и плазменных факторов свертывания и их исследования, и может быть использовано для диагностики болезни Виллебранда и гиперагрегацион- ных синдромов.

Цель изобретения - повышение точности исследования.

Способ иллюстрируется чертежом.

Способ осуществляется следующим образом.

Приготовление суспензии отмытых фор- малинизированных донорских тромбоцитов. Венозную кровь доноров стабилизируют 1 % раствором ЭДТА-Na с 1% формалином на буфере Михаэлиса (рН 7,4) в соотношении 9:1. Кровь центрифугируют в течение 7 мин при 1500 об/мин. Полученную богатую тромбоцитами плазму центрифугируют 20 мин при 4000 об/мин. Бестромбоцитарную плазму разводят буфером Михаэлиса от 1:2 до 1:128 и используют в качестве стандарта для построения калибровочной кривой. Тромбоцитарный осадок ресуспендируют в 1 % растворе ЭДТА-Na без формалина на буфере Михаэлиса и дважды отмывают с последующим центрифугированием в течение 15 мин при 4000 об/мин. Затем надосадочную жидкость удаляют, а осадок ресуспендируют в буфере Михаэлиса таким образом,чтобы в полученной взвеси содержалась 4-8 х 1012/л тромбоцитов. Полученная взвесь в пластикатном контейнере хранится при+4°С в течение 2-3 месяцев.

0,3 мл полученной из пальца крови смешивают в пластиковой пробирке с 0,05 мл 3,8% раствора цитрата натрия. Пробирку закрывают пластиковой пробкой, перемешивают без встряхивания и центрифугируя 20 мин при 3000 об/мин (200д). В две пластиковые пробирки наливают по 1,8мл 0,1 % раствора ристомицина и 0,1 мл взвеси отмытых формалинизированных донорских

СП

с

00

ю VI

Os

hO J

тромбоцитов. Затем в опытную пробирку вносят 0,1 мл плазмы обследуемого, в контрольную - 0,1 мл буфера Михаэлиса. Пробирки закрывают пластиковыми пробками, перемешивают путем переворачивания, инкубируют 10 мин при комнатной температуре и центрифугируют в течение 2 мин при 1500 об/мин (150д) для осаждения тромбо- цитарных агрегатов. Из среднего слоя полученных супернатантов подсчитывают количество единичных тромбоцитов на автоматической системе Лаборскель при следующих параметрах: диаметр измерительного капилляра - 70 мк, режимы ID, 70,Ц, М. Устанавливаются пороги дискриминации: нижний - 0,4 В, верхний - 10 В.

Вычисление индекса ристомициновой агрегации отмытых формалинизированных донорских тромбоцитов (ИРАТ): а - в

ИРАТ

, где а - количество единичных тромбоцитов в супернатанте контрольной пробы, в - количество единичных тромбоцитов в супренатантной опытной пробы.

Построение калибровочной кривой. Используя полученные бестромбоцитарные плазмы доноров и приготовленные из их смеси стандартные разведения, определяют в каждом из них ИРАТ по описанной выше методике. Полученные данные наносятся на билогарифмическую систему координат, в которой кривая имеет вид прямой линии, отражающей зависимость ИРАТ от концентрации фактора Виллебранда в плазме. Полученная кривая может быть описана формулой: ФВ % е5 53 ,у 459 х 100%, где у - индекс ристомициновой агрегации тромбоцитов (ИРАТ). По данной формуле может быть построена таблица, использование которой, на наш взгляд, удобнее, чем нахождение нужных значений фактора Виллебранда на ее графическом аналоге - калибровочной кривой.

Пример 1. Больная В., 19 лет, история болезни № 113, поступила в гематологическое отделение Республиканской клинической больницы 12.01.90 г с диагнозом: Коагулопатия неясного генеза. На коже предплечий, голеней единичные подкожные кровоизлияния. Менструации по 6-7 дней обильные. У родной сестры также отмечаются длительные и обильные менструальные кровотечения, синяки на коже. При исследовании системы гемостаза: длительность кровотечения по Шитиковой - свыше 8 мин, легкая гипокоагуляция по внутреннему механизму (АПТВ - 48 сек при норме - 40 сек). После прокола мягких тканей пальца у больной получено 0,3 мл крови, которая немедленно была смешана с 0,05 мл 3,8% раствора цитрата натрия в пластиковой пробирке. Проба была отцентрифугирована 20 мин при 3000 об/мин (200д). По описанному методу был определен ИРАТ - 0,44. По формуле определено содержание факторе Виллебранда - 11,8%. У больной была диагностирована болезнь Виллебранда средней степени тяжести.

Пример 2. Больной С., 29 лет, история

болезни Ns 242, поступил в гематологическое отделение Республиканской клинической больницы 29.01.90 г. с диагнозом: Геморрагический васкулит, кожно-сустав5 ная форма 2. На коже голеней у больного была обильная, сливная, симметричная геморрагическая сыпь, беспокоили сильные боли в голеностопных суставах. При исследовании системы гемостаза выявлены ги0 перкоагуляция, тромбинемия, депрессия фибринолиза. По описанному методу был определен ИРАТ-0,915, что соответствовало содержанию фактора Виллебранда в плазме - 150%. У больного был диагности5 рован выраженный гиперагрегационный синдром, связанный с распространенным поражением эндотелия мелких сосудов и повышенным выбросом в кровоток фактора Виллебранда, что приводило к сильной и

0 необратимой агрегации тромбоцитов и ухудшению микроциркуляции.

Таким образом, в результате проведенных экспериментальных и клинических исследований установлено, что эф5 фект, достигаемый при использовании заявляемого способа определения фактора Виллебранда в плазме крови, заключается в повышении точности исследования в связи с уменьшением ошибки метода, повышении

0 его чувствительности и воспроизводимости, а также в уменьшении объема крови, необходимой для исследования, что может быть использовано для повышения качества диагностики болезни Виллебранда и гипераг5 регационных синдромов при различных заболеваниях, протекающих с поражением сосудистого эндотелия.

Формула изобретения Способ определения фактора Виллеб0 ранда в плазме крови, включающий приготовлениевзвесиотмытыхформалинизированных донорских тромбоцитов, получение бестромбоцитарной цит- ратной плазмы и инкубацию в течение 10

5 мин при комнатной температуре с 0,1 %-ным раствором ристомицина, отличающий- с я тем, что, с целью повышения точности способа, в 1,9 мл инкубационной смеси, содержащей 2-4-1011/л донорских тромбоцитов в 0,1%-ном растворе ристомицина,

добавляют 0,1 мл бестромбоцитарной плазмы, пробу центрифугируют при 4000 об/мин в течение 15 мин с последующим определением в супернатанте количества

единичных тромбоцитов и расчетном относительной разности их содержания в опыте и контроле, при этом в качестве контроля используют буфер Михаэлиса.

Использование: в медицине, в клинико- лабораторной практике. Цель: повышение точности способа. Сущность изобретения: приготовление взвеси отмытых формалинизированных донорских тромбоцитов 2-4 х 10 л, которые добавляют в инкубируемую смесь, содержащую 1,9 мл 0,1%-ного раствора ристомицина и 0,1 мл бестромбоци- тарной цитратной плазмы, пробу центрифугируют при 4000 об/мин в течение 15 мин с последующим определением в су- пернатанте количества единичных тромбоцитов и расчетом относительной разности их содержания в опыте и контроле, при этом в качестве контроля используют буфер Ми- хаэлиса. Положительный эффект: при использовании способа точность определения фактора Виллебранда повышается на 15-20 %. 1 ил.

1.56

3,125

6,25

25,0

50,0

100,0

200,0 «В. 2