СПОСОБ ИССЛЕДОВАНИЯ ВНУТРИСОСУДИСТОЙ АГРЕГАЦИИ ТРОМБОЦИТОВ IN VITRO Российский патент 1998 года по МПК G01N33/48 A61B5/14 G01N33/49 

Изобретение относится к медицине, к области гематологии, а именно к гемостазу, и может быть использовано для диагностики заболеваний с повышенной тромбогенной опасностью.

Известен способ определения микроагрегатов тромбоцитов, основанный на определении микроагрегатов крови по электропроводности ее, при этом микроагрегаты рассматриваются как дисперсная фаза, а кровь как гетерогенная среда, состоящая с одной стороны из плазмы и форменных элементов, с другой - из микроагрегатов (авт. св. СССР N 899039, кл. A 61 B 5/14. А.С.Осьмак, В.В. Петраш и др.). Данное изобретение использует чувствительный кондуктометрический способ измерения, позволяющий независимо от исходных свойств крови получать достоверные данные об объеме микроагрегатов. Однако описанный способ вместе с заявляемым устройством не позволяет получать достоверные данные об объеме микроагрегатов диаметром ниже 20 25 мкм. Если учесть, что размер тромбоцита составляет в среднем 1,5 4 мкм (Справочник по клиническим лабораторным методам исследования. М. 1968, с. 86), то более мелкие скопления тромбоцитов данным способом выявить невозможно.

Известен также турбидиметрический способ исследования агрегации тромбоцитов, предложенный в 1962 г. Born G.V.R. (Born G.V.R. Nature, 1962. - Vol 194, р. 927). Метод Борна широко используется как инструмент исследования, однако светопропускание суспензии тромбоцитов зависит от большого числа недостаточно учитываемых параметров формы тромбоцитов, поглощения света плазмой крови, распределения агрегатов по размерам и т.д. (Born G.V.R. Hume M. Nature, 1967. Vol 215. P 1027; Latimer P. Born G.V.R. Michal F.Arch. biochem. biophys. 1977. Vol 180, p 151: O'Brien Y.R. Acta med. scand. - 1967. Vol 525. Suppl. P 43). При этом возможны случаи, когда два образца различаются количеством вошедших в агрегаты тромбоцитов и размером образующихся агрегатов и в то же время обладают одинаковой оптической плотностью, т.е. светопропускание неоднозначно характеризует размер образующихся агрегатов. (Nichols A.R. Bosmann H.B. Thrombos. Heamostas. Stuttq. 1979. 42. S 679).

Для изучения внутрисосудистой агрегации тромбоцитов in vitro использован метод, позволяющий получать информацию о процессе агрегации тромбоцитов, который в корне отличается от данных стандартного турбидиметрического метода (Габбасов З. А. Попов Е.Г. и др. Новый методический подход к исследованию агрегации тромбоцитов in vitro. БЭБМ, 1989, N10, с. 437 439). Однако данный способ недостаточно информативен, поскольку не учитывает внутрисосудистую агрегацию тромбоцитов.

Известен также способ исследования спонтанной агрегации тромбоцитов (З. Т. Сабиржанова. Воздействие сезонного колебания метеофакторов на агрегацию тромбоцитов у больных гипертонической болезнью в условиях жаркого климата с учетом параметров центральной и периферической гемодинамики. Автореф. канд. дисс. Ташкент, 1993). Автор изучает спонтанную агрегацию тромбоцитов, не зависящую от какого-либо из механизмов запуска агрегационного процесса. Однако недостатком этого способа является отсутствие информации об агрегации тромбоцитов, которая уже имеется в сосудистом русле пациента.

Наиболее близким к предлагаемому способу является способ исследования спонтанной агрегации тромбоцитов по Wu K.K. Hoak J.C. (Lancet, 1974, v. 2, p. 924) в модификации Н.И. Тарасовой (В кн. В.П.Балуда, З.С.Баркаган и др. Лабораторные методы исследования системы гемостаза. Томск, 1980). По данному способу, механизм которого сходен с заявляемым, о степени внутрисосудистой агрегации тромбоцитов судят по степени дезагрегации. Осуществляют забор крови в две пробирки: в 1 в формалин ЭДТА-раствор, который немедленно фиксирует как имевшиеся в циркуляции агрегаты, так и отдельно лежащие тромбоциты, во 2
с дезагрегантом ЭДТА, далее в камере Горяева проводят подсчет тромбоцитов из 1 и 2 пробирок, по разнице тромбоцитов судят о спонтанной внутрисосудистой агрегации. Недостатком способа является субъективизм анализа, вызванный погрешностью счета в камере Горяева под микроскопом, трудоемкость способа, поскольку для каждого пациента необходимо просчитать количество тромбоцитов в двух пробах: с дезагрегатом и с фиксатором, неравномерность заполнения камеры Горяева тромбоцитами. Сами авторы отмечают, что причиной ошибок может быть позднее смешивание крови с растворами-стабилизаторами, что приводит к свертыванию крови, которая исследованию не подлежит, неправильный подсчет тромбоцитов, неточности отмеривания и т.д.

Целью изобретения является упрощение способа при повышении точности с получением документальных данных.

Сущность заявляемого способа заключается в том, что в способе исследования внутрисосудистой агрегации тромбоцитов in vitro, включающем забор крови, стабилизацию ее, разделение крови на плазму и эритроциты с получением богатой тромбоцитами плазмы, дезагрегацию ее, анализ полученных данных, по которому судят о степени агрегации, стабилизацию крови после забора осуществляют цитратом натрия 3,8% в соотношении 9:1, разделение крови с получением богатой тромбоцитами плазмы (БТП), проводят центрифугирование до введения дезагреганта, из части БТП получают обедненную тромбоцитами плазму (ОТП), для проб каждого пациента определяют экстремальные значения светопропускания: по ОТП 100% светопропускания, по БТП 0% после введения дезагреганта снимают кривую дезагрегации, на которой фиксируют величину максимального значения радиуса дезагрегации, по которой судят о степени внутрисосудистой агрегации.

Кроме того, модификацией способа является обеспечение точности исследования за счет проведения способа в условиях, максимально приближенных к тем, которые соответствуют живому организму, а именно: до введения дезагреганта обеспечивают температуру пробы 36,5 37,5^oC.

Способ отличается еще и тем, что исследование идет при постоянном перемешивании, кривую дезагрегации снимают графопростроением, непрерывно, в динамике.

Заявляемый способ осуществляется следующим образом. Кровь забирают с цитратом натрия 3,8% в соотношении 9:1, центрифугируют 10 мин при 1000 об/мин для получения БТП. 0,35 мл БТП центрифугируют 20 мин при 5000 об/мин для получения ОТП. Для каждого образца крови пациента определяют экстремальные значения светопропускания: по 0,3 мл ОТП 100% светопропускания, по 0,3 мл БТП 0% причем к 0,3 мл БТП добавляют 0,01 мл физиологического раствора хлорида натрия для уравнивания сравниваемых объемов. Затем 0,3 мл БТП помещают в кювету прибора, 3 мин прогревают при 37^oC, опускают мешалку, включают перемешивание, через 30 с добавляют 0,01 мл 0,1 М раствора динатриевой соли ЭДТА и получают графически зарегистрированную в течение 6 мин кривую дезагрегации, по максимальной величине радиуса дезагрегации судят о величине внутрисосудистой агрегации тромбоцитов.

Пример 1. Больная К. 59 лет, поступила в клинику НИИ кардиологии в первые сутки острого трансмурального переднебокового инфаркта миокарда в тяжелом состоянии с гемодинамическими нарушениями. Сразу при поступлении у больной взята кровь для исследования. Цель исследования: в соответствии с описанием заявляемого способа определить внутрисосудистую агрегацию тромбоцитов у больной К. Забор крови в количестве 5 мл проводили из локтевой вены с цитратом натрия 3,8% в соотношении 9:1, сразу же однократно перемешивали опрокидыванием пробирки, центрифугировали 10 мин при 1000 об/мин для получения БТП. 0,35 мл БТП отбирали и вновь центрифугировали 20 мин при 5000 об/мин (на центрифуге ОПН-8) для получения ОТП. Далее по 0,3 мл ОТП устанавливали 100% светопропускания, к 0,3 мл БТП добавляли 0,01 мл 0,9% раствора хлорида натрия и устанавливали 0% светопропускания. Затем вновь отбирали 0,3 мл БТП в кювету, помещали ее в прибор, 3 мин прогревали плазму при 37^oC, опускали мешалку в кювету, включали перемешивание. На 30-й секунде добавляли 0,01 мл 0,1 М раствора динатриевой соли ЭДТА, в течение 6 мин проводили графическую регистрацию процесса дезагрегации. Находили максимальную величину радиуса дезагрегации на двухканальном лазерном анализаторе тромбоцитов, модель 230LA НПФ БИОЛА. У больной К. он составил 3,38.

На фиг. 1 представлена кривая дезагрегации больной К. На фиг. 2 представлена кривая дезагрегации здорового донора А. 20 лет, радиус дезагрегации у данного исследуемого составил 0,13.

Примеры 2 20. По вышеизложенной технологии исследования проверена внутрисосудистая агрегация тромбоцитов у 10 здоровых доноров и у 20 больных ишемической болезнью сердца (ИБС) в возрасте 48 70 лет.

Внутрисосудистая агрегация тромбоцитов изучена у 10 здоровых лиц в возрасте 19 21 года и у 20 больных ИБС в возрасте 48 70 лет. Результаты полученных исследований представлены в табл. 1.

По радиусу дезагрегации судят о внутрисосудистой агрегации тромбоцитов. При контрольной проверке другими методами получено совпадение результатов, что свидетельствует о пригодности предлагаемого способа в лечебной практике.

Использование: в медицине, в области гематологии, а именно для диагностики заболеваний с повышенной тромбогенной опасностью. Технический результат: упрощение способа при повышении точности с получением документальных данных. Сущность: производят забор крови, стабилизацию ее, разделение на плазму и эритроциты с получением богатой тромбоцитами плазмы, дезагрегацию тромбоцитов, анализ полученных данных, по которым судят о степени агрегации, стабилизацию крови после забора осуществляют цитратом натрия 3,8% в соотношении 9:1, разделение крови с получением богатой тромбоцитами плазмы проводят центрифугированием, до введения дезагреганта из части богатой тромбоцитами плазмы получают обедненную, для пробы каждого пациента определяют экстремальные значения светопропускания, по обедненной тромбоцитами плазме - 100% светопропускания, по богатой тромбоцитами плазме - 0%, после введения дезагрегации снимают кривую дезагрегации, на которой фиксируют величину максимального значения радиуса дезагрегации, по которой судят о степени внутрисосудистой агрегации тромбоцитов. Кроме того, точность способа повышается при обеспечении температуры пробы 36,5 - 37,5^oC с последующим перемешиванием. Способ может быть осуществлен с помощью графопостроения. 2 з.п. ф-лы, 2 ил., 1 табл.

1. Способ исследования внутрисосудистой агрегации тромбоцитов in vitro, включающий забор крови, стабилизацию ее, разделение на плазму и эритроциты с получением богатой тромбоцитами плазмы, дезагрегацию тромбоцитов, анализ полученных данных, по которым судят о степени агрегации, отличающийся тем, что стабилизацию крови после забора осуществляют цитратом натрия 3,8%-ным в соотношении 9 1, разделение крови с получением богатой тромбоцитами плазмы проводят центрифугированием, до введения дезагреганта из части богатой тромбоцитами плазмы получают обедненную, для пробы каждого пациента определяют экстремальные значения светопропускания, по обедненной тромбоцитами плазме 100% светопропускания, по богатой тромбоцитами плазме 0% после введения дезагреганта снимают кривую дезагрегации, на которой фиксируют величину максимального значения радиуса дезагрегации, по которой судят о степени внутрисосудистой агрегации тромбоцитов. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что до введения дезагреганта обеспечивают температуру пробы 36,5 37,5^oС с последующим перемешиванием. 3. Способ по п.1 или пп.1 и 2, отличающийся тем, что кривую дезагрегации снимают графопостроением, непрерывно, в динамике.