Способ фиксации первичных гепатоцитов для экстракорпорального контура искусственной печени Советский патент 1992 года по МПК C12N5/00 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к носителям для культивирования клеток человека и животных, и может найти применение в медицине для создания устройств искусственной печени.

Проблема носителей для культивирования субстрат-зависимых клеток является одной из актуальных в клеточной биологии и биотехнологии, при этом, наряду с биоафин- ностью и нетоксичностью, в ряде случаев важнейшей характеристикой является развитость поверхности субстрата, позволяющая создавать высокое отношение поверхности культивирования к его объему. Так, известен носитель, состоящий из физиологически приемлемой сетки волокон, имеющих пористость 40-95% и поры размером 10-100 мкм или открытопористую пенистую структуру.

Получение и поддержание краткосрочной первичной культуры печени in vitro является трудной и не до конца решенной задачей, так как гепатоциты обладают повышенной требовательностью к условиям культивирования и, особенно, к носителю, к которому они прикрепляются. Адгезия первичных гепатоцитов на негоризонтальных поверхностях особенно затруднена вследствие их высокой склонности к седиментации и неустойчивости к механическим воз-, действиям. Существует способ присоединения гепатоцитов к коммерческому микроносителю на декстрановой основе (Цитодекс), покрытому коллагеном, с использованием в модельном устройстве искусственной печени.

Однако в такой системе гепатоциты располагаются на наружной стороне сферической поверхности и легко подвергаются механическому разрушению трущимися друг О друга частицами микроносителей, а также могут смываться током окружающей жидкости. Сами частицы создают значительное гидродинамическое сопротивление току жидкости и тем самым сильно ограничивают скорость протока жидкой среды через колонку с микроносителем.

Цель изобретения - уменьшение трав- матизации клеток и поддержание полноценного массообмена гепатоцитов с омывающей средой.

Цель достигается тем, что согласно способу фиксации первичных гепатоцитов, включающему посадку гепатоцитов на поверхность носителя, в качестве носителя используют открытопористый гидрофильный

ftполиуретан, непосредственно на поверх ность которого фиксируют гепатоциты.

Сущность заключается в применении в качестве нового субстрата-носителя для первичных гепатоцитов биосовместимого, нетоксичного, технически простого, функционально эффективного, доступного и дешевого пол иэфирно-полимочеви иного препарата с открытопористой пенистой структурой. Структура данного матрикса представляет собой нерегулярную систему пор, разделенных тонкими пленочными перегородками, с отверстиями между ними 100-500 мкм. Гепатоциты, проникая через отверстия в перегородках, задерживаются внутри пор и прикрепляются к стенкам енут- ри. Таким образом достигается защитный эффект от внешних механических воздействий на клетки и в то же время сохраняется свободный массообмен их с окружающей жидкой средой. Существенным преимуществом является и простота технологии получения такой системы культивирования гепатоцитов.

До настоящего времени использование гидрофильного Тюлиэфирно-полимочевин- ного открытопористого пенополиуретана в качестве носителя для культивирования эукариотических клеток, в том числе первичных гепатоцитов, не было известно.

Способ осуществляют следующим образом.

Гидрофильный открытопористый пенополиуретан механически измельчают в водной среде в измельчителе ткани с получением кусочков неправильной формы поперечным размером З-б мм. Суспензию пенополиуретана тщательно отмывают раствором детергента, водой, спиртом, стерилизуют автоклавированием в водной среде и отмывают питательной средой для культуры клеток, затем выдерживают 12 ч в питательной среде, содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки.

Из суспензии формируют колонку с соотношением высоты к ее диаметру не менее

3,0-3,5 и удаляют избыток питательной среды, На колонку наносят сверху суспензию свежевыделенных первичных гепатоцитов (1,5x10 клеток в 1 мл) крысы и медленно

профильтровывают ее через колонку {2- 3 мл/мин), собирая элюат снизу, Данную операцию повторяют дважды. В результате не менее 50-60% клеток задерживается на колонке.

Жизнеспособность клеток, оставшихся в среде после колонки, подтверждалась визуально под микроскопом, подсчетом клеток в суспензии до и после фильтрования через колонку определяли количество задержавшихся клеток. В отработанных условиях в 100 мл скомпанованного матрикса-носителя задерживалось 30- 40x106клеток.

Колонку промывают питательной средои, содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки и оставляют в С02-инкубаторе на 18 ч для закрепления клеток на носителе.

Контроль адгезии гепатоцитов на носителе осуществлялся с помощью сканирующей электронной микроскопии образцов,

Таким образом, применением данного пенополиуретана достигается высокое соотношение площади культивирования первичных гепатоцитов к его объему,

эффективная защита заключенных внутри пор клеток от внешних воздействий, а также эффективность массообмена клеток с омывающей жидкой средой.

35

Формула изобретения

Способ фиксации первичных гепатоцитов для экстракорпорального контура мскус- ственной печени, включающий посадку

гепатоцитов на поверхность носителя, о т- личающийся тем, что, с целью уменьшения травматизации клеток и поддержания полноценного массообмена гепатоцитов и среды, в качестве носителя

используют пенистый открытопористый гидрофильный полиуретан.

Использование: биотехнология. Сущность изобретения: первичные гепатоциты фиксируют непосредственно на поверхности носителя - пенистого отжрытопористого гидрофильного полиуретана.