ТРАНСПЛАНТАТ ДЛЯ ВОССТАНОВЛЕНИЯ ДЕФЕКТОВ СОЕДИНИТЕЛЬНОЙ ТКАНИ И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ Российский патент 2008 года по МПК A61K35/32 A61K35/12 A61K35/28 C12N5/08 A61P43/00 

Изобретение относится к области приготовления генетически немодифицированных клеточных культур фибробластов, мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток, мононуклеаров костного мозга и получения комбинированного трансплантата с матрицей-носителем.

Изучение механизмов регенерации тканей и органов, поиск новых технологий, которые могли бы восстановить утраченную функцию органа или системы, привели к появлению новых направлений, возникших на стыке биотехнологии и медицины - тканевой инженерии, регенеративной медицины и органогенеза. Эти науки изучают создание органов и тканей de novo. В их основе лежит принцип трансплантации клеток на матрицах-носителях.

Матрица-носитель или матрикс представляет собой синтетический или биологический комплекс для обеспечения механической прочности конструкции с заданными свойствами, трехмерного ориентирования нанесенной на него клеточной культуры. Основными критериями биологически совместимой матрицы для создания тканеинженерной конструкции должны быть: отсутствие цитотоксичности, поддержание адгезии, фиксации, пролиферации и дифференцировки помещенных на ее поверхность клеток, отсутствие воспалительной реакции на материал и иммунного ответа, достаточная механическая прочность в соответствии с назначением, биорезорбируемость обычными метаболическими путями [1,4-10, 15-18, 20, 22, 25-27].

Одними из первых материалов для тканевой инженерии стали биодеградируемые синтетические биоматериалы на основе полимеров органических кислот. Биодеградируемые полиэстеры - семейство биодеградируемых материалов, состоящих из цепи повторяющихся остатков короткоцепочных органических кислот, таких как молочная и гликолиевая. В состав полимера может входить как один тип кислотного остатка - PGA (Poly Glycolic Acid), PLA (Poly Lactic Acid), так и их сочетание в различных пропорциях PGLA (Poly Glycolic Lactic Acid) 30/70. В медицинской практике эти полимеры нашли широкое применение в виде шовного материала, армирующих конструкций, сеток для герминопластики. Первым коммерческим продуктом был шовный материал Vicryl компании Ethicon Inc.

PGA - твердый термопластичный материал, температура плавления 225 градусов. Благодаря высокой кристаличности (40-50%) он не растворим в большинстве органических растворителей. Достаточная прочность и пластичность позволяют создавать различные конструкции с заданной механической прочностью - от нетканых, губчатых материалов до пластин и винтов для фиксации костных отломков. Биодеградация полимера происходит путем гидролиза до углекислого газа и воды с некоторым повышением pH окружающих тканей [11], остатки выводятся в виде мономера с мочой. Механическая прочность сохраняется максимум до 21-29 дня с потерей массы до 40% к этому периоду. Материал не обладает цитотоксическими свойствами, обеспечивает адгезию и поддерживает пролиферацию клеток, а также обладает в некоторой степени остеоиндуктивными свойствами.

PLA - полимер из остатков молочной кислоты. По своим химическим, физическим и биологическим свойствам близок к PGA, однако более близок организму, так как находится в нем в виде мономера и участвует в физиологических процессах. Однако наилучшими показателями обладает сополимер PGA и PLA - PGLA. В зависимости от процентного соотношения молочной и гликолиевой кислот можно менять свойства продукта, например пластичность, прочность, срок биодеградации и др.

В течение длительного времени производилось тестирование этих полимеров с различными типами клеток. Было установлено, что данные материалы могут служить матрицей для создания тканеинженерных конструкций мышечной, хрящевой, костной и эпителиальной ткани. Особое место полимеры на основе молочной и гликолиевой кислот заняли в реконструктивной хирургии и регенративной медицине. В настоящее время они используются для восстановления дефектов костной и хрящевой ткани в клинической практике [1,6-10, 15, 19, 25-27], и были одобрены FDA (Агентством по контролю за лекарствами и продуктами питания США) как "первые" безопасные биоматериалы для тканевой инженерии [28].

Полилактон - еще один представитель семейства полиэстеров. Полупрозрачный полимер с температурой плавления менее 60 градусов. Срок биодеградации около 3 лет. Эти свойства позволяют получать достаточно пластичные конструкции, обеспечивающие длительную механическую прочность и поддержку. Коммерческий препарат, применяемый в здравоохранении, Monocryl (Ethicon Inc.).

Полипропелен фумарат - достаточно прочный пластичный полимер, предназначенный также для длительной поддержки механической прочности конструкции в течение как минимум 200 дней. Биодеградация также происходит ферментативным гидролизным путем, но в отличии от предыдущих материалов не влияет на pH окружающих тканей. К существенным недостаткам можно отнести образование фиброзной капсулы как ответ на инородное тело, что неблагоприятно в ряде ситуаций [12, 14].

Моноангидриды (poly-[trimellitylimidoglycine-co-bis(carbox-yphenoxy)-hexane], poly-[pyromellitylimidoalanine-co-1,6-bis(carboph-enoxy)-hexane]) - одни из наиболее изучаемых в настоящее время полимеров. Они биологически резорбируемы поверхностной эрозией в течение 28 недель. Отличительной особенностью этих полимеров является высокая механическая прочность (до 60 МПа), что позволяет использовать их для реконструктивной хирургии кости и сухожилий. Это позволяет создать прочные конструкции на относительно длительный срок [4, 13].

Полиортоэстеры - полимеры, относящиеся к биорезорбируемым материалам, с достаточно высокой прочностью. Резорбция осуществляется посредством поверхностной эрозии в течение 150 дней. Отличительной особенностью является более выраженные остеоиндуктивные свойства, что позволяет их использовать в реконструктивной ортопедии.

Для создания объемных трехмерных тканевых эквивалентов используют тканеинженерные конструкции, создающиеся in vitro. Комбинированные клеточные трансплантаты, используемые в регенеративной медицине, представляют собой трехмерные конструкции в виде твердых структур или гелеобразных форм, в зависимости от цели и задачи их применения. Для локальной стимуляции регенеративных процессов в поврежденных тканях, создания локальных трехмерных объемных образований (артифициальных тканей) с помощью малоинвазивных методик наиболее предпочтительным является использование трехмерных гелевых тканеинженерных конструкций [7], инъекционное введение которых в заданную анатомическую локализацию позволяет избежать дополнительной нежелательной травматизации окружающих тканей, возникающей при трансплантации твердых конструкций, особенно в местах со сложной анатомической структурой органов или тканей, повреждение которых нежелательно.

Особенное значение имеет структура, физико-химические, механические и биологические свойства носителей, такие как биологическая инертность, механическая прочность, эластичность, отсутствие цитотоксичности и хорошие адгезивные свойства матрицы-носителя. Носитель, включаемый в инъекционную форму комбинированного клеточного трансплантата, должен обладать одновременно и свойствами жидкости и твердого тела, одновременно и нести на своей поверхности клетки и проходить свободно через достаточно узкий просвет иглы шприца или катетера для обеспечения принципа малоинвазивности. Эластичность носителя позволяла бы, меняя его форму, не повреждать, а защищать от повреждения о стенки иглы адгезированные на его поверхности клетки. Попадая в ткани, носитель некоторое время должен фиксировать клетки в принципиальном месте, обладать хорошими адгезивными свойствами, стимулировать синтез внеклеточного матрикса или синтез биологически активных веществ.

Задачей настоящего изобретения является получение комбинированного трансплантата для наиболее эффективного лечения дефектов соединительной ткани.

Для решения поставленной задачи предложена группа изобретений, объединенная общим изобретательским замыслом.

Предложена тканеинженерная конструкция для восстановления дефектов соединительной ткани, содержащая мононуклеары костного мозга. Источником получения мононуклеаров костного мозга человека является взвесь костного мозга (КМВ), полученная путем пункции заднего или переднего гребня подвздошной кости или грудины, в том числе при оперативных вмешательствах.

Предложена тканеинженерная конструкция для восстановления дефектов соединительной ткани, содержащая мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки костного мозга или жировой ткани, полученные из аутологичного или донорского материала, при этом ткань дезагрегируют; далее культивируют в виде прикрепленных колоний в ростовой среде, содержащей эмбриональную телячью сыворотку и глутамин, затем неоднократно пассируют в низкой плотности с изменением состава среды, а культивирование ведут избегая накопления в культуре клеток зрелой стромы.

Предложена тканеинженерная конструкция для восстановления дефектов соединительной ткани, содержащая фибробласты, которые получают при помощи липоаспирации или биопсии кожи и слизистой оболочки.

Предложена тканеинженерная конструкция, содержащая в качестве матрицы-носителя желатин, коллагены различных типов и деминерализованный костный матрикс. Матрица-носитель используется в виде геля, пленки и трехмерной конструкции, соответствующей дефекту соединительной ткани.

Предложен способ получения комбинированного трансплантата, характеризующийся тем, что процессинг КМВ в лаборатории осуществляется в соответствии с рекомендациями «Инструкции по контролю стерильности консервированной крови, ее компонентов, препаратов консервированного костного мозга, кровезаменителей и консервирующих растворов» - Минздрав № И-42-4-85 от 01.01.1986 г.

Для уменьшения общего объема образца для дальнейшего замораживания клеток и удаления эритроцитов производится выделение фракции мононуклеаров (ядросодержащих клеток костного мозга). С целью повышения эффективности выделения ядросодержащих элементов, клеток CD34+/CD45+, КОЕ-ГМ, КОЕ-ГЭММ в качестве седиментирующего средства используется 10% гидроксиэтилкрахмал (Инфукол ГЭК 10%).

Для этого смешивается 10% раствор ГЭК с образцом в соотношении 1:1. Седиментация эритроцитов происходит в течение 25 минут, после чего супернатант собирается пипеткой, а оставшаяся клеточная взвесь подвергается повторной седиментации. Супернатант, выделенный после осаждения эритроцитов, дважды отмывается от седиментирующего вещества (ГЭК) в среде RPMI 1640 путем центрифугирования с частотой оборотов 1500/мин в течение 10 минут. Клеточный осадок собирается пипеткой, оценивается примесь эритроцитов.

Допускается примесь эритроцитов в концентрате ядросодержащих клеток костного мозга (ЯСК) не более 5%. Концентрат ЯСК костного мозга человека тестируется по количеству ядросодержащих клеток, их жизнеспособности, стерильности.

На время проведения тестирования, но не более 36 часов, образцы ЯСК помещаются на карантинное хранение при температуре до 22°С, исключающее контакт с другими пробами.

Результаты всех исследований, характеризующие образец заготовленного препарата ЯСК костного мозга, вносятся в базу данных Организации под единым идентификационным номером образца.

В качестве криопротектора применяется высокоочищенный диметилсульфоксид (димексид), в том числе в комбинации с гидроксиэтилкрахмалом (инфукол ГЭК, 10% раствор для инфузий, Serumwerk Bernburg).

Приготовление ограждающих растворов осуществляется в боксе на ледяной бане (для поддержания температуры +4°С) с соблюдением стерильности.

Для замораживания и хранения клеточной взвеси используются полипропиленовые криопробирки объемом 5 мл, выпускаемые фирмой Corning (США).

Криозащитный раствор состоит из 10% ДМСО, 40% аутологичной сыворотки и 2% ГЭК (в конечной концентрации). Для приготовления такого раствора к 2,0 мл охлажденной до +4°С аутологичной сыворотки приливают по каплям с постоянным механическим помешиванием 0,5 мл диметилсульфоксида (ДМСО) и 1 мл 10% ГЭК (расчет дан на 1 криоампулу объемом 5 мл).

Свежеприготовленный ограждающий раствор, охлажденный до +4°С, медленно при постоянном механическом помешивании приливают к 1,5 мл клеточной взвеси. После этого клеточная взвесь с ограждающим раствором, охлажденная до +4°С, плотно закрывается крышкой, маркируется и помещается в криобокс.

Из одного образца костного мозга замораживается не менее 3 криоампул ЯСК и пробирка-спутник. Криобокс, содержащий образцы ЯСК с пробиркой-спутником, переносится в хранилище и подвергается плавному охлаждению до -80°С со скоростью 1°/мин, после чего криоампулы погружаются в жидкий азот для длительного хранения.

Концентрат ЯСК костного мозга хранится в сосуде Дюара в жидкой фазе азота до использования.

Хранение образцов и пробирки-спутника с единым идентификационным номером производится в отдельном пенале криохранилища. Каждый образец ЯСК, предназначенный для криозамораживания и криохранения, маркируется идентификационным номером с указанием концентрации и состава криопротектора, даты криозамораживания, названия лаборатории.

Способ получения комбинированного клеточного трансплантата характеризуется тем, что выделяют мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки из фетального или донорского материала, или из собственных тканей рецепиента, при этом ткань дезагрегируют, полученную клеточную суспензию ресуспендируют и культивируют на ростовой среде, содержащей трансферин, инсулин, фактор роста фибробластов и гепарин, до накопления в культуре клеток зрелой стромы.

В качестве фетального материала используют ткани: костный мозг, тимус, печень, жировая ткань эмбрионов человека 1-го триместра беременности.

В качестве донорского материала используют ткани: костный мозг, тимус, печень, жировая ткань.

Для получения аутологичных ММСК используют ткани: костный мозг, жировая ткань.

Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки в основном получают из донорского костного мозга, однако существуют и другие источники - скелетные мышцы, подкожная жировая ткань, фетальные органы гемопоэза (печень, тимус, селезенка). ММСК из фетальных органов гемопоэза и методики их получения практически не изучены. Описанные методики выращивания ММСК из костного мозга и липоаспиратов позволяют получить гетерогенные популяции клеток стромы, лишь небольшой процент которых являются стволовыми. Клетки зрелой стромы не обладают свойством дифференцироваться в различные клеточные линии и, таким образом, терапевтически неэффективны. После трансплантации стромальные клетки мигрируют преимущественно в соединительную ткань и там накапливаются. При стандартном пассировании в высоких посевных дозах доля зрелых стромальных клеток быстро увеличивается.

Использование в качестве трансплантата гомогенной (не менее 80%) популяции плюрипотентных ММСК позволяет повысить эффективность лечения, увеличить воспроизводимость результатов и избежать нежелательных эффектов.

Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки выделяются из фетальных (костный мозг, тимус, печень, жировая ткань) или донорских (костный мозг, жировая ткань, тимус) тканей. Для выделения фетальных клеток используют абортивный материал, полученный при искусственном прерывании беременности у здоровых женщин, предварительно обследованных на наличие вирусных и бактериальных инфекций.

Возможность использования биоматериала достигается на следующих сроках гестации: печень - 5-8 недель, тимус - 18-20 недель, костный мозг - 17-20 недель, подкожная жировая ткань - 17-19 недель. Если выделение клеток производится не из аспиратов (костный мозг, липоаспират), а из плотных тканей, например тимуса, орган предварительно измельчают и ферментативно дезагрегируют. Суспензию фильтруют через мелкоячеистое сито из нержавеющей стали. Клеточную суспензию (аспират) разводят 1:1 солевым раствором Хэнкса, центрифугируют в режиме 1,500 × g 10 минут и ресуспендируют в ростовой среде DMEM/F12, содержащей 15% эмбриональной телячьей сыворотки, селектированной для выращивания клеток в низкой плотности, 2 мМ глутамина. Суспензию клеток высевают на пластиковые чашки Петри с диаметром 100 мм. Плотность посева первичной клеточной суспензии составляет 1-20 миллионов мононуклеарных клеток на 1 см² в зависимости от источника выделения. Через сутки неприкрепившиеся клетки удаляют, ростовую среду заменяют. Культуры инкубируют при 37°С в атмосфере 5% СО₂. Через 6 дней наблюдают рост гетерогенных клеточных популяций. По достижении культурой 50% конфлуентности монослой трипсинизируют и пересевают на новые чашки с плотностью 10-30 клеток на 1 см² в ростовой среде, дополнительно содержащей 10 мкг/мл трансферрина, 1 мкг/мл инсулина, 10нг/мл фактора роста фибробластов - 2 и 8 ЕД/мл гепарина. Через 7-10 дней отбирают плотные колонии мелких клеток (диаметром 7-10 мкм) с большим количеством митозов. Отобранные колонии рассевают в новые чашки с плотностью 20 клеток/см² и выращивают до состояния преконфлуентности. Замену среды производят через каждые 2 дня. Последующие пассажи производят в том же режиме. Увеличение посевной дозы или изменение состава ростовой среды приводит к быстрому накоплению в культуре клеток зрелой стромы.

Способ получения тканеинженерной конструкции характеризуется тем, что фибробласты получают из кожи фетусов 1-2 триместра беременности, кожи и слизистых оболочек взрослого человека, полученных в результате пластических операций или биопсий, липоаспиратов. Кожу отмывают в среде Хэнкса, содержащей антибиотик и антимикотик, измельчают и ферментативно дезагрегируют в 0,25% растворе трипсина в течение 40 минут в условиях СО₂ инкубатора при температуре 37°С. Липоаспират ферментативно дезагрегируют аналогично. Суспензию клеток разводят 1:1 солевым раствором Хэнкса, центрифугируют в режиме 1000 × об./мин 5 минут и ресуспендируют в ростовой среде DMEM/F12, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ глутамина. Суспензию высевают на пластиковые чашки Петри с диаметром 100 мм. Плотность посева первичной клеточной суспензии составляет 500-1000 клеток на 1 см².

Способ получения комбинированного трансплантата характеризуется тем, что матрица-носитель представляет собой субстрат с развитой поверхностью. Субстраты с развитой поверхностью (СРП) готовят заранее (за 3-5 дней), замачивая их в культуральной среде DMEM.

В качестве субстратов используют биоматериалы на основе коллагена или желатина, или деминерализованного костного матрикса.

СРП помещают в 15-мл или 50-мл пробирки и наслаивают на них клеточную суспензию из расчета 5-10 млн клеток на 1 куб. см СРП. Субстраты при этом должны быть полностью покрыты культуральной средой. В среду добавляют аутологичную сыворотку крови пациента до 15-20% от общего объема.

Крышки пробирок приоткрывают. Пробирки помещают в СО₂-термостат и инкубируют при 37°С в атмосфере 5% углекислого газа в течение 12-24 ч. Затем СРП переносят в культуральные чашки и анализируют прикрепление клеток фазоконтрастным микроскопированием.

Субстраты с прикрепившимися клетками осторожно промывают в среде Хенкса (коллаген и деминерализованный костный матрикс непосредственно в чашках; желатин переносят в пробирки, разводят и отстаивают 5-10 минут, удаляя надосадок). Процедуру повторяют 2-3 раза.

При использовании ЯСК костного мозга или жировой ткани концентрацию клеток следует увеличить до максимума. Среда при прикреплении клеток не должна быть сильно закисленной. Для этого можно добавить раствор HEPES с рН 7,2-7,4 до финальной концентрации 25 мМ. После прикрепления клеток тканеинженерные конструкции можно инкубировать в культуральных чашках в культуральной среде DMEM с 10-20% аутологичной сыворотки крови пациента при стандартных условиях. Среду при этом следует регулярно (не реже, чем 2 раза в неделю) заменять.

Препараты, приготовленные на основе желатина, в отличие от других ИТП, могут использоваться как инъекционная форма и помещаться непосредственно в стерильные шприцы.

Также получение тканеинженерной конструкции характеризуется тем, что носитель получают простым смешиванием всех его компонентов при температуре 0 - +4°С. При необходимости к основным компонентам носителя вносят матриксные белки, факторы роста, антибиотики и/или антисептики, причем количество добавок может варьироваться в зависимости от клинической или экспериментальной задачи и объема выходящего продукта, например в качестве матриксных белков могут быть использованы фибронектин и/или ламинин, и/или белок в концентрации от 0,1 до 100 мкг/мл, а предпочтительно от 1 до 5 мкг/мл, в качестве биологически активных веществ - факторы роста фибробластов и/или трансформирующий фактор роста α и β и/или фактор роста, выделяемый тромбоцитами, и/или фактор роста гепатоцитов в концентрациях от 1-300 нг/мл, а предпочтительно от 1 до 100 нг/мл, или иные, в качестве асептических средств может быть использован гентамицин в концентрации от 0,08 до 0,4 мг/мл геля, а предпочтительно от 0,1 до 0,2 мг/мл, и/или пенициллин (или его производные), стрептомицин (или его производные), любые другие антибиотики широкого спектра действия. По завершении процесса изготовления носителя в него вносят суспензию аллогенной или аутогенной клеточной культуры фибробластов, мононуклеаров костного мозга, мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга, жировой ткани или иного происхождения.

Пример 1.

Клеточная культура. Мы использовали в качестве клеточной культуры малодифференцированные стромальные клетки жировой ткани крыс линии Вистар. Образцы жировой ткани были забраны у 11 животных. Их забирали из области холки животного объемом 0,5 см³ и доставляли в лабораторию. Из них 10 образцов использованы были для аутотрансплантации, а материал от одного животного использовался для аллотрансплантации. Из образцов выделяли стромальную фракцию малодифференцированных клеток жировой ткани по стандартному протоколу.

Мононуклеары получали из костного мозга. Образцы ткани были забраны у 5 животных и использовались для аллотрансплантации. Фибробласты выделяли из кожи крыс. Из них пять образцов было использовано для аллотрансплантации и пять для аутотрансплантации.

С целью обнаружения трансплантируемых клеток в окружающих тканях клетки были помечены BrdU.

Матрица-носитель. В качестве матрицы мы использовали желатиновую губку «Спонгостан» (Johnson& Johnson, Inc.), измельченную на гомогенизаторе Silent Crasher M при 15000 оборотов в минуту в течение 5 мин. Размер частиц составлял от 70 до 150 мкм в виде тонких, до 3 мкм в толщину, волнистых структур.

Комбинированный клеточный трансплантат. Полученную после гомогенизации желатиновой губки взвесь частиц соединяли с клеточными культурами из расчета 5х106 на мл и инкубировали в течение часа в CO₂-инкубаторе, после чего производили отмывку от питательной среды и упаковку в стерильных условиях в инсулиновые шприцы по 300 мкл. Таким образом, было получено три вида трансплантата, содержащих мезенхимальные стромальные клетки, мононуклеары костного мозга и фибробласты.

Тест на выживаемость. Для определения теста на выживаемость клеток в составе тканеинженерной конструкции при прохождении через стандартные иглы от шприцов Луер 0,6 мм в диаметре и иглу инсулинового шприца (0,3 мм) мы использовали методику подсчета живых клеток до прохождения через иглу и после нее.

Экспериментальное исследование.

Эксперимент проводили на 43 крысах-самках линии Вистар средней массой тела 250 грамм. Животные были разделены на 3 группы (контрольную, сравнения и основную). Вывод из эксперимента животных производился в соответствии с Международной конвенцией о защите животных путем передозировки препарата для наркоза (Золетил-50) на 5-6-е, 12-21-е и 27-35-е сутки после парауретрального введения трансплантата или только его матрикса (без клеточного компонента) в мочеполовую и тазовую диафрагмы между влагалищем и уретрой.

В контрольной группе (10 животных) крысам вводили только матрикс трансплантата без его клеточного компонента, из них 3-м - методом парауретральной инъекции инсулиновым шприцем (результат изучали морфологически после забоя животных на 5-е сутки) и 7-и - парауретрально через небольшой разрез кожи слева между влагалищем и уретрой. Морфологическое исследование проводили на 14-е (3 животных) и 35-е сутки (4 животных).

В группе сравнения (20 животных) крысам производили парауретральную инъекцию клеточного аллотрансплантата. Морфологическое исследование проводили после забоя животных на 6, 21-е и 30-е сутки.

В основной группе (13 животных) парауретрально инъецировали клеточный аутотрансплантат, а морфологическое исследование проводили после забоя животных на 5, 12-е и 27-е сутки.

Методы морфологического исследования.

Иссеченные участки парауретральной ткани, включающие уретру и стенку влагалища, размерами 0,5-1×0,3-0,5×0,2-0,5 см, по общепринятой технологии фиксировали в 10%-ном нейтральном формалине, обезвоживали в спиртах и заливали в парафин. Изготавливали тестовые гистологические срезы толщиной 4-5 мкм и окрашивали их гематоксилином и эозином. С учетом результатов изучения этих срезов ориентировали парафиновые блоки так, чтобы просвет уретры оказывался перпендикулярным срезу. Далее последовательно изучали окрашенные гематоксилином и эозином ступенчатые срезы до достижения в гистологических препаратах парауретральных тканей в области введения матрикса или трансплантатов. На этом же уровне ориентированных блоков изготавливали не менее 10 срезов для гистологического (окраски гематоксилином и эозином, пикрофуксином по Ван Гизону), иммуноморфологического (выявление антигена Ki-67, коллагена I и III типов) и морфометрического исследований.

Для иммуноморфологического (иммунопероксидазного) исследования гистологические срезы помещали на покрытые адгезивом (APES-ацетон) предметные стекла. Эндогенную пероксидазу в депарафинированных срезах блокировали 3%-ной перекисью водорода. Демаскировку антигенов производили по стандартной схеме, в течение 10-30 мин в СВЧ-печи в 0,1 М растворе нитратного буфера (pH 6,0). Использовали мышиные моноклональные антитела к коллагену I типа (Abcam, UK), коллагену III типа (клон HWD 1.1, Bio Genex, USA) и белку Ki-67 (Novocastra, UK). Ядерный негистоновый белок Ki-67 экспрессируется только в фазах G1, S, G2 и М клеточного цикла и является маркером пролиферирующих клеток. После инкубации срезов с первичными антителами (рабочее разведение антисывороток - 1:100-300, время инкубации - 45-60 мин при температуре 37С°) их обрабатывали универсальными вторичными биотилинизированными лошадиными антителами (Novocastra, UK). Для последующей визуализации результата реакции связывания антигена с антителом использовали стрептавидин-пероксидазный комплекс и раствор DAB (Novocastra, UK, BD Pharmingen, USA). Конечный продукт реакции представляет собой мелкие коричневатые гранулы, окрашивающие ядра клеток (для антигена Ki-67) и коллагеновые волокна I или III типов. После проведения иммунопероксидазной реакции гистологические препараты докрашивали гематоксилином, изучали и фотографировали, используя световой микроскоп DM-LB («Leica», Germany) с видеокамерой JVC и компьютером Pentium 4.

Проводили общепринятые отрицательные и положительные контрольные процедуры на используемые реагенты и ткани при обработке параллельных срезов. Отрицательный контроль заключался в проведении реакции с исключением первичных (специфических) антител путем их замены неиммунным реактивом (бычьей сывороткой), а положительный - в использовании гистологических препаратов рака молочной железы.

Морфометрически в парауретральной ткани в области введения матрикса или трансплантатов подсчитывали соотношение количества клеток с экспрессией в их ядрах антигена Ki-67 к числу клеток с неокрашенными ядрами (результат выражали в процентах). Подсчет клеток производили в каждом гистологическом срезе, не менее чем в 20 полях зрения, при увеличении микроскопа - ×400 (объектив - ×40, окуляр - ×10). Статистическую обработку материала проводили, вычисляя среднюю величину показателя, среднее квадратичное отклонение, ошибку средней. Сравнивали достоверность различий показателей между группами наблюдений с помощью критерия Стьюдента. Различия считались достоверными при 5% уровне значимости (р<0,05) по таблице Стьюдента.

Результаты и обсуждение.

Микроскопия комбинированного клеточного трансплантата. При фазово-контрастной микроскопии тканеинженерной конструкции в жидкой среде было отмечено, что большая часть клеток концентрировалась на частицах желатинового носителя от 5 до 50 единиц на частицу в виде одиночных клеток или их скоплений.

Тест на выживаемость. В результате проведенного теста до 97% живых клеток сохранялось при прохождении через иглу 0,6 мм в диаметре и 93% через иглу 0,3 мм в диаметре (инсулиновый шприц).

Результаты эксперимента.

1. 5-6-е сутки.

В наблюдениях контрольной группы (на 5-е сутки) в области инъекции бесклеточного матрикса сохранялись мелкие очаги кровоизлияний с умеренной лимфо- и макрофагальной инфильтрацией с примесью нейтрофильных лейкоцитов. В таких участках выявлялись фрагменты инъецированного матрикса в виде комплексов эозинофильных структур, среди которых встречались единичные фибробластоподобные клетки, лимфоциты и макрофаги. Отдельные сосуды были расширены и полнокровны. Пролиферативная активность клеток соединительной ткани и воспалительного инфильтрата в участках повреждения была минимальна, антиген Ki-67 экспрессировали ядра 6,7±1,3% клеток.

В отличие от контроля в наблюдениях группы сравнения (6-е сутки после инъекции клеточного аллогенного трансплантата) были резко выражены микроциркуляторные нарушения в виде расширенных полнокровных сосудов и отека ткани вокруг аллотрансплантата. Последний выявлялся в виде компактно расположенных эозинофильных структур с массивной инфильтрацией группами клеток с умеренно полиморфными округлыми ядрами, а также лимфоцитами, макрофагами и фибробластоподобными клетками. Была выражена перифокальная клеточная инфильтрация. В составе инфильтрата, наряду с макрофагами, лимфоцитами и нейтрофильными лейкоцитами, выделялись единичные лаброциты и группы эозинофильных лейкоцитов. Вокруг аллотрансплантата наблюдались активация фибробластов и повышенное число расширенных полнокровных капилляров. Антиген Ki-67 экспрессировали ядра 11,4±2,2% клеток соединительной ткани, стенок сосудов и инфильтрата в участках, перифокальных аллотрансплантату, а также клеток, локализованных среди частиц его матрикса.

В наблюдениях основной группы (5-е сутки после инъекции клеточного аутологичного трансплантата) микроциркуляторные нарушения и степень клеточной инфильтрации были сходны с выявленными в группе сравнения, но менее выражены. Морфология клеточного и матриксного компонентов аутотрансплантата не отличалась от аллогенного. Вокруг аутотрансплантата формировалась грануляционная ткань с множеством новообразованных капилляров. Пролиферативная активность клеток в составе аутотрансплантата и окружающей его соединительной ткани, включая клетки инфильтрата, была значительно выше, чем в наблюдениях группы сравнения. Экспрессировали антиген Ki-67 ядра 33,5±6,9% таких клеток.

Таким образом, в отличие от воздействия на ткани изолированного бесклеточного матрикса трансплантата, которое носило травматический характер, алло- и аутотрансплантаты модулировали локальную активность различных клеточных популяций, причем, по-видимому, клетки трансплантатов сохраняли свою жизнеспособность. Уже на 5-6-е сутки введение аллотрансплантата приводило к повышению в 1,7 раз (по сравнению с контролем) пролиферативной активности клеток соединительной ткани, перифокальной к трансплантату, наряду с выраженной, возможно, иммунной реакцией на его аллогенный клеточный компонент. Морфология клеточного и матриксного компонентов аутотрансплантата не отличалась от аллогенного, но пролиферативная активность клеток аутотрансплантата и окружающей его соединительной ткани была в 3,4 раза выше, чем при аллотрансплантации. При этом микроциркуляторная и иммунная реакции на аутотрансплантат были менее выражены. Каких-либо особенностей в тканевом распределении коллагена I и III типов не отмечалось, но они выявлялись среди фрагментов матрикса алло- и аутотрансплантатов, что косвенно указывает на синтетическую активность клеток трансплантатов.

2. 12-21-е сутки эксперимента.

В наблюдениях контрольной группы (на 14-е сутки эксперимента) микроциркуляторные нарушения и воспалительные изменения не отмечались. Лишь в 2-х случаях из 3-х выявлялись небольшие периваскулярные лимфо- и макрофагальные инфильтраты. Во всех наблюдениях было характерно формирование в области травмы очагов склероза со слабо выраженной лимфо- и макрофагальной инфильтрацией и единичными лаброцитами. Часть макрофагов инфильтрата содержали гемосидерин. Мелкие фрагменты введенного матрикса, причем без какой-либо клеточной реакции, были обнаружены только в 1-м из 3-х случаев. Пролиферативная активность клеток соединительной ткани и инфильтрата в очагах склероза была низкой. Экспрессировали антиген Ki-67 ядра 2,0±1,7% клеток. Заметных изменений в распределении коллагена I и III типов не выявлялось, кроме их накопления в очагах склероза.

В наблюдениях группы сравнения (на 21-е сутки эксперимента) превалировали пролиферативные процессы в перифокальных к аллотрансплантату участках соединительной ткани и продуктивные клеточные реакции. Микроциркуляторные нарушения были не выражены. В сохранившихся фрагментах аллотрансплантата выявлялись, наряду с матриксом, группы полиморфных клеток с базофильными ядрами, лимфоциты, макрофаги и фибробластоподобные клетки. Вокруг аллотрансплантата разрасталась грануляционная ткань, инфильтрированная лимфоцитами и макрофагами с примесью лаброцитов. Группы макрофагов содержали гемосидерин. Аналогичные инфильтраты отмечались вокруг сосудов и на расстоянии от аллотрансплантата. Пролиферативная активность клеток аллотрансплантата была высокой так же, как и клеток окружающей его грануляционной ткани. Экспрессировали антиген Ki-67 ядра 23,3±5,8% клеток. По периферии аллотрансплантата и в перифокальных к нему участках соединительной ткани было выражено накопление коллагена как I, так и III типов. Положительная реакция на эти типы коллагена цитоплазмы и клеточной мембраны части клеток, локализованных между фрагментами матрикса аллотрансплантата, указывала на возможность их синтеза не только клетками местных тканей, но и введенными аллогенными клетками.

В наблюдениях основной группы (на 12-е сутки эксперимента) преобладали пролиферативные изменения как со стороны клеток аутотрансплантата, так и окружающей его соединительной ткани. Сохранившиеся фрагменты аутотрансплантата были окружены множеством новообразованных расширенных сосудов. Элементы матрикса аутотрансплантата были разделены плотным клеточным инфильтратом, представленным умеренно полиморфными клетками с ядрами округлой, реже вытянутой формы. Эти клетки были морфологически сходны либо с лимфоцитами и моноцитами, либо с фибробластами и их скопления простирались далеко за пределы границ сохранившихся фрагментов матрикса аутотрансплантата. Перифокально к аутотрансплантату отмечалось выраженное разрастание грануляционной ткани. Лаброциты, в отличие от наблюдений группы сравнения, выявлялись редко. Экспрессировали антиген Ki-67 ядра 38,7±4,1% клеток. Так же, как и в группе сравнения, было выражено накопление коллагена I и III типов по периферии аутотрансплантата и в перифокальных к нему участках соединительной ткани. Положительная реакция на эти типы коллагена цитоплазмы и клеточной мембраны части клеток, локализованных между фрагментами матрикса аутотрансплантата, указывала на возможность их синтеза введенными аутологичными клетками.

Таким образом, на 12-21-е сутки эксперимента отмечалась повышенная пролиферативная активность клеток алло- и особенно (в 1,7 раз выше) аутотрансплантатов, а также окружающей их соединительной ткани. Вокруг трансплантатов разрасталась грануляционная ткань, причем для аллотрансплантатов была характерна ее лимфо- и макрофагальная инфильтрация с примесью лаброцитов и сходные по клеточному составу периваскулярные инфильтраты. Отмечалось накопление коллагена I и III типов, преимущественно перифокально к алло- и аутотрансплантатам и между фрагментами их матрикса. Положительная реакция на эти типы коллагена цитоплазмы и клеточной мембраны части клеток, локализованных между фрагментами матрикса аутотрансплантата, указывала на возможность их синтеза введенными алло - и аутологичными клетками.

3. 27-35-е сутки эксперимента.

В наблюдениях контрольной группы (на 35 сутки эксперимента) в парауретральной ткани выявлялись лишь единичные мелкие очаги склероза, местами с группами сидерофагов. Элементы трансплантированного матрикса не обнаруживались. Просвет уретры по своей ширине и форме не менялся. Пролиферативная активность клеток парауретральной соединительной ткани достоверно не отличалась от показателя, отмеченного для 14-и суток эксперимента в наблюдениях контрольной группы. Экспрессировали антиген Ki-67 ядра 1,8±0,6% клеток. Распределение коллагена I и III типов также соответствовало описанному для наблюдений той же контрольной группы.

В наблюдениях группы сравнения (на 30 сутки эксперимента) было характерно очаговое избыточное разрастание парауретральной соединительной ткани, что приводило к сдавлению и сужению просвета уретры. На месте аллотрансплантатов, клеточный и матриксный компоненты которых уже не визуализировались, среди очагов рубцовой ткани с незначительной лимфо- и макрофагальной, иногда с примесью нейтрофильных лейкоцитов, инфильтрацией выявлялись группы тесно расположенных и расширенных тонкостенных сосудов. В таких участках накапливался коллаген I и III типов. Отмечались также периваскулярные лимфо- и макрофагальные инфильтраты. Пролиферативная активность клеток соединительной ткани в очагах склероза была низкой. Экспрессировали антиген Ki-67 ядра 3,8±1,5% клеток.

В наблюдениях основной группы (на 27 сутки эксперимента) выявлялись сходные группе сравнения, но более выраженные изменения. Просвет уретры был резко сужен за счет сдавления увеличенным объемом парауретральной соединительной ткани, богатой сосудами. Выраженность лимфо- и макрофагальной инфильтрации была меньшей, чем в группе сравнения. Кроме того, среди очагов зрелой (рубцовой) соединительной ткани выявлялись группы липоцитов или поперечно-полосатых миоцитов в сочетании с множественными новообразованными мелкими сосудами. Нельзя исключить, что эти участки жировой и мышечной ткани - результат некоторых вариантов дифференцировки трансплантированных аутологичных клеток, но, возможно, такие клетки имеют и местное происхождение. Одновременно со зрелой соединительной тканью встречались очаги грануляционной ткани с активным неоангиогенезом. Пролиферативная активность клеток была различной в фокусах рубцовой и грануляционной ткани. Так, экспрессировали антиген Ki-67 ядра 1,3±0,2% клеток рубцовой ткани, но 15,5±3,7% - грануляционной ткани (в т.ч. с включениями групп липоцитов и миоцитов). Накопление коллагена I и III типов было особенно выражено в рубцовой ткани и вокруг конгломератов расширенных сосудов на месте аутотрансплантатов.

Таким образом, на 27-35-е сутки эксперимента, в отличие от контрольных наблюдений, в группах сравнения и основной выявлялось выраженное очаговое избыточное разрастание соединительной ткани, приводящее к сдавливанию и сужению просвета уретры. На месте алло- и аутотрансплантатов, компоненты которых уже не определялись, формировались очаги рубцовой ткани, богатые коллагеном I и III типов, с конгломератами расширенных тонкостенных сосудов. В наблюдениях с аллотрансплантатами сохранялись очаговые лимфо- и макрофагальные, нередко периваскулярные инфильтраты, а с аутотрансплантатами выявлялись очаги грануляционной ткани с активным неоангиогенезом, группами липоцитов и поперечно-полосатых миоцитов. Последнее может свидетельствовать о различной дифференцировке трансплантированных аутологичных клеток.

Таким образом, разработанный комбинированный трансплантат на основе клеток и матрицы-носителя сохраняет свои биологические и физические свойства после введения без значительной потери функционально активных клеточных единиц.

Проведенное экспериментально-морфологическое исследование результатов трансплантации в парауретральные ткани 43 крысам-самкам инъекционного комбинированного клеточного трансплантата, содержащего аллогенные и аутологичные клетки, показало, что клетки трансплантатов, особенно аутологичные, оказывают выраженное активирующее влияние на пролиферацию местных клеточных популяций соединительной ткани и, по-видимому, длительно, до 20 и более суток, сохраняют свою жизнеспособность, пролиферативную и синтетическую активность. Микроциркуляторная и иммунная реакции на аутотрансплантат выражены значительно слабее, чем на аллотрансплантат. При трансплантации аутологичных клеток выявляются очаги грануляционной ткани с активным неоангиогенезом, группами липоцитов и поперечно-полосатых миоцитов. Последнее может свидетельствовать о различной дифференцировке трансплантированных аутологичных клеток или влиянии аутотрансплантата на пролиферацию и дифференцировку местных клеток-предшественников разных линий. В исходе эксперимента, на 27-35-е сутки, наблюдается выраженное очаговое разрастание соединительной ткани в области введения как алло-, так и аутотрансплантатов.

Изобретение относится к медицине, в частности к приготовлению генетически немодифицированных клеточных культур фибробластов, мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток, мононуклеаров костного мозга и получению комбинированного трансплантата с матрицей-носителем. Изобретение представляет собой комбинированный трансплантат для восстановления дефектов соединительной ткани, характеризующийся тем, что содержит клеточные культуры мононуклеаров костного мозга или мультипатентных мезенхимальных стромальных клеток, или фибробластов человека и матрицу-носитель, полученную смешиванием указанных компонентов, при этом на субстрат наслаивают клеточную суспензию из аллогенной или аутогенной клеточной культуры из расчета 5-10 млн клеток на 1 см³, субстраты с прикрепившимися клетками промывают в среде Хенкса. Изобретение обеспечивает выраженное стимулирующее действие на разрастание соединительной ткани в области введения как алло-, так и аутотрансплантатов. 2 н. и 4 з.п. ф-лы.

1. Комбинированный трансплантат для восстановления дефектов соединительной ткани, характеризующийся тем, что содержит клеточные культуры мононуклеаров костного мозга или мультипатентных мезенхимальных стромальных клеток или фибробластов человека и матрицу-носитель, полученный смешиванием указанных компонентов, при этом на субстрат наслаивают клеточную суспензию из аллогенной или аутогенной клеточной культуры из расчета 5-10 млн. клеток на 1 см³, субстраты с прикрепившимися клетками промывают в среде Хенкса.2. Комбинированный трансплантат по п.1, где матрица-носитель выполнена в форме геля, измельченной губки, пленки и трехмерной конструкции, соответствующей дефекту соединительной ткани.3. Комбинированный трансплантат по п.1, где матрица-носитель дополнительно включает антисептики, выбранные из группы: ионы серебра, меди, золота и антибиотики широкого спектра действия.4. Комбинированный трансплантат по п.1, где источником мононуклеаров является взвесь костного мозга, полученная путем пункции заднего или переднего гребня подвздошной кости или грудины, в том числе при оперативных вмешательствах.5. Комбинированный трансплантат по п.1, где мультипатентные мезенхимальные стромальные клетки костного мозга или жировой ткани получены из аутологичного или донорского материала.6. Способ получения комбинированного трансплантата для восстановления дефектов соединительной ткани по п.1, характеризующийся тем, что клеточную суспензию, состоящую из мононуклеаров костного мозга или мультипатентных мезенхимальных стромальных клеток или фибробластов человека из расчета 5-10 млн. клеток на 1 см³ субстрата, наслаивают на матрицу-носитель, представляющую собой субстрат с развитой поверхностью на основе коллагена, желатина или деминерализованного матрикса, включающую матриксные белки, выбранные из группы коллагена, энтегрина, фибронектина, ламинина в концентрации от 0,1 до 100 мкг/мл и при необходимости факторы роста фибробластов и/или трансформирующий фактор роста α и β и/или фактор роста, выделяемый тромбоцитами и/или фактор роста гепатоцитов, далее субстраты с прикрепившимися клетками промывают в среде Хенкса и подвергают криозамораживанию в растворе, состоящем из 10% ДМСО, 40% аутологичной сыворотки и 2% ГЭК.