ТРЕХМЕРНЫЙ БИОАКТИВНЫЙ НОСИТЕЛЬ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ЖИВОТНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ Российский патент 1994 года по МПК C12N5/00 C12M3/04 

Изобретение относится к биотехнологии, в том числе к медицинской биотехнологии, в частности к системам и носителям для культивирования и выращивания клеток и тканей человека и животных и создания на их основе искусственных органов, и может найти применение в медицине и промышленной биотехнологии.

Одним из актуальных направлений современной клеточной биологии и биотехнологии является конструирование эффективно функционирующих систем для культивирования тканей и клеток человека и животных, необходимых, в числе прочего, и для создания искусственных органов. При этом проблема матрикса-носителя для культивирования субстрат-зависимых клеток и тканей является одной из главных, и важнейшее значение приобретают такие характеристики, как биоафинность и биодеградируемость, химическая инертность и нетоксичность, развитость поверхности субстратов, позволяющая создавать высокую объемную плотность культивирования. Существенное внимание в решении проблемы уделяется белкам и углеводно-белковым комплексам, составляющим комплементарную структурную основу межклеточного белкового матрикса живых тканей и базальных мембран (коллагены разных типов, фибронектин, ламинин, нидоген, ряд глиткопротеидов и протеогликанов и др.) и обладающим, как известно, выраженным влиянием на процессы пролиферации и дифференцировки клеток и формирование тканей. Так, создание живого дермального эквивалента для лечения тяжелых ран и ожогов впрямую основывается на получении матрикса-носителя наиболее оптимального по составу и структуре и адекватного природной базальной мембране кожи. Тот же подход осуществляется и при конструировании биосистем для тканей и клеток других типов.

Наиболее распространенным способом реализации этого подхода является формирование более или менее сложных по составу объемных гелей непосредственно из смесей изолированных вышеупомянутых высокомолекулярных соединений. В другом варианте синтезирован поперечносшитый полиакриламидный гель, включающий в свою структуру коллагены крысы или свиньи, в пространстве тонкослойной пористой мембраны из политетрафторэтилена. При этом диссоциированные клетки включаются в поры таких структур и образуют объемную тканеподобную систему, благоприятствующую росту и функционированию клеток.

Эти варианты требуют выделения и реконструирования отдельных компонентов межклеточного природного матрикса, чем нарушают его целостность и воссоздают композиционно, структурно и функционально менее совершенную трехмерную структуру, а также трудоемки и дороги.

В существующих других подходах метод получения ткани от клеток одного типа in vitro, на примере использования коммерческого пористого полимерного субстрата (фирма "Миллипор", США) и покрытого коллагеном, а также кератиноцитов, включающий следующие принципиальные стадии: а) создание пористого субстрата, подходящего для выращивания клеток, с фактором роста, специфического для данного типа клеток; б) посев клеток в поры субстрата; в) поддержание пористого субстрата в культуре до достижения монослоя ткани.

В другом варианте предлагаются любые подходящие трехмерные биосовместимые субстраты полимерно-синтетического происхождения (на основе сетки из полиамидных, полиуретановых, поливиниловых и других волокон) или на основе биодеградируемых биополимеров (желатина, кетгут) для выращивания в их структуре по всему объему культуры диссоциированных клеток стромального типа (фибробласты, особенно эмбриональные, адипоциты, эндотелий и т.д.), обладающих способностью к активному росту, с образованием в объеме этих трехмерных субстратов конфлюэнтных или субконфлюэнтных клеточных слоев - так называемого "стромального опорного матрикса" (более известного в широкой цитологической практике и литературе в традиционном плоском варианте как "фидерный слой". Сформированный таким образом "трехмерный стромальный опорный матрикс" предлагается в качестве подложки для выращивания, или поддержания в длительной культуре, или даже для имплантирования в организм клеток любых других типов, в первую очередь клеток, "трудных" для культивирования, например, первичных гепатоцитов, гомеопатических клеток, кожных клеток и т. п. Отмечается, что такой матрикс обеспечивает для этих клеток необходимую опору, факторы роста и регуляторные факторы, необходимые для поддержания долгосрочной активной пролиферации клеток в культуре; будучи выращенными в такой трехмерной системе, пролиферирующие клетки созревают и дифференцируются должным образом с образованием компонентов зрелой ткани, аналогичной ткани in vivo.

При всех достоинствах данного подхода следует отметить, что далеко не всегда удобно и возможно оперировать в реальной практике (особенно при эксплантации, имплантации или транспортировке) с живыми культурами стромальных клеток. Кроме того, при выращивании тканей и клеток в таких структурах может остро возникать проблема отделения полимерной основы от образовавшейся ткани, а также проблемы иммунной, нежелательной пролиферативной, специфически ориентированной метаболической и др. активностей клеток "стромального опорного матрикса", которые в практике могут сильно осложнить какое-либо воздействие извне на такую сложную клеточную систему, в первую очередь при имплантации или при эксплантации.

Известен ряд синтетических гидрофильных полимерных материалов с открытопористой пенистой структурой, обладающих хорошей биосовместимостью, инертностью, нетоксичностью и перспективных для использования в качестве матрицы-носителя при создании трехмерных систем культивирования тканей и клеток. Следует особо подчеркнуть, что полимерные субстраты, имеющие именно пенистую структуру, обладают наиболее высокой удельной поверхностью на единицу собственного объема, которая образуется многочисленными порообразующими пленочными перегородками, и этим выгодно отличаются от обычно предлагаемых волокнистых субстратов с сетчатой трехмерной структурой. При этом технология пенообразования позволяет достаточно легко получать структуры с любыми требуемыми размерами пор.

Так, существует ранее предложенный способ фиксации первичных гепатоцитов с сохранением их функциональной активности, в пространственной пенистой структуре эластичного гидрофильного полиуретана, обладающего хорошими биоафинными свойствами и удачной структурой пор без использования промежуточных слоев и подложек. Известно успешное использование близких разновидностей пористых полиуретанов в качестве покровых повязок на раны кожи, для заполнения внутренних полостей тела на ограниченный срок при некоторых патологиях и обладающих прекрасной тканесовместимостью, а в последнем случае и биодеградируемостью. Близкими свойствами обладают и некоторые другие синтетические пенополимеры неуретановой структуры.

С другой стороны, описан случай из клинической практики, заключающийся в успешном терапевтическом использовании чужеродного неклеточного дермального эквивалента (ксенографта кожи). Свежевыделенную кожу свиньи подвергали мягкой обработке трипсином для удаления всех клеточных компонентов и получившуюся бесклеточную мембрану, которая, как отмечается, в основном сохранила всю морфологию волокон интактного дермиса, использовали для покрытия сквозной кожной раны. Наблюдались замечательные эффекты миграции и пролиферации собственных клеток в ложе раны, но без какого-либо отторжения ксенографта. В результате коллагеновый ксенографт, включающий очевидно и все остальные компоненты базальной мембраны, деградировал и прогрессивно заместился грануляцинной тканью реципиента.

Описанный случай подтверждает экспериментальные данные об огромном влиянии межклеточного матрикса, причем в его интактном состоянии на все основные процессы функционирования и активации клеток разных типов; это подтверждается и обширной информацией об активации интактным матриксом нейтрофилов и моноцитов-макрофагов, чье участие в процессах репарации тканей в организме необходимо и важно.

Цель изобретения - упрощение, структурное и функциональное улучшение трехмерных носителей для культивирования и роста клеток и тканей, расширение возможностей внешнего воздействия на функции этих носителей и, на этой основе, расширение сферы их практического использования с одновременным повышением эффективности.

Цель достигается созданием композитных материалов с биологически активной и высокоразвитой поверхностью на основе трехмерных открытопористых гидрофильных полимерных субстратов-носителей с пенистой структурой, покрытых по всей поверхности тонкой пленкой межклеточного матрикса. Такую пленку формируют целенаправленно выращиванием на поверхности пенистого субстрата монослоя первичной культуры диссоциированных клеток, преимущественно стромального типа, например, фибробластов или эндотелия различного происхождения, а также других клеток, имеющих высокий пролиферативный потенциал и образующих значительные количества высокоэффективного межклеточного матрикса, с последующим удалением самих клеток с поверхности специальной мягкой обработкой, сохраняющей однако образованный этими клетками межклеточный матрикс.

Сущность предлагаемого способа заключается в формировании на основе объемных пенистых синтетических биодеградируемых или бионедеградируемых носителей "кондиционированной" биоактивной высокоразвитой поверхности из межклеточного матрикса, практически интактного и идентичного природному как структурно, так и функционально и композиционно. При этом в сравнении с прототипом многочисленные тонкопленочные порообразующие перегородки пенистого субстрата выполняют "опорную" функцию конфлюэнтного монослоя стромальных клеток, но более надежно, а интактный межклеточный матрикс придает этой опорной поверхности биоактивные свойства, тогда как использование субстратов-носителей с волокнисто-сетчатой структурой в предлагаемом подходе малоэффективно. Межклеточный матрикс служит основой для культивирования или выращивания любых других клеток либо in vitro (выращивание искусственных органов и тканей), либо in vivo (репарация и регенерация тканей, в т.ч. ранозаживление) в благоприятных условиях, так как стимулирует оптимальным образом пролиферацию, миграцию и функционирование клеток всех типов. Кроме того, трехмерная пористая структура синтетической матрицы в принципе позволяет включать и длительно удерживать в порах, т.е. локально и в сочетании с межклеточным матриксом, растворы самых разнообразных цитокинов (факторы роста клеток, биоактивные пептиды, интерлейкины, гормоны и т.д.), что потенциально способно создать уникальные сочетания, управляющие всеми основными функциями клеток и достижимые лишь в функционирующей живой ткани.

Первым и существенным преимуществом предлагаемых носителей является простота технологии получения таких композитных материалов в сравнении с вышеописанными примерами, доступность и дешевизна как полимерных пенистых субстратов, так и первичных культур диссоциированных клеток, а также легкость в последующем оперировании с готовым композитным материалом, не требующим особых предосторожностей в обращении.

Вторым преимуществом предлагаемых носителей является отсутствие посторонней метаболической активности, а также потенциальная низкая иммуногенность поверхностного межклеточного матрикса, особенно при использовании для формирования такого матрикса клеток эмбрионального происхождения, имеющих, как известно, весьма слабовыраженные иммуногистотипические свойства и к тому же генерирующих матрикс, обладающий повышенным потенциалом в стимулировании пролиферации клеток. Именно система предлагаемого типа, в отличие от прототипа и других аналогов, представляет наиболее полную и оптимальную возможность стимулирования роста и регенерации собственных клеток и тканей организма при имплантации или эксплантации, избегая использования чужеродных клеток и эффективно модулируя эти процессы.

Воздействие создаваемого слоя межклеточного матрикса на изменение цитоадгезивных свойств полимерной пористой матрицы демонстрировали в опыте следующим образом. Кусочки гидрофильного полимера пенистого поливинилформаля поперечным размером 4-8 мм с диаметром внутренних пор 100-300 мкм формировали в виде колонки и наносили на нее суспензию таких высокоспециализированных и требовательных к субстрату клеток, как первичные свежевыделенные гепатоциты крысы. В этом случае на колонке задерживалось 8-10% от общего числа наносимых гепатоцитов. После выращивания на таких же кусочках в условиях культуры монослоя из диссоциированных первичных фибробластов эмбриона человека или эндотелия глаза быка и формирования на поверхности полимерного субстрата межклеточного матрикса, на аналогичным образом скомпанованной колонке фиксировалось уже 50-60% первичных гепатоцитов.

Образование почти сплошного слоя межклеточного матрикса на поверхности пор по всему объему полимерной матрицы после удаления клеточного монослоя подтверждали непосредственно прямым методом - сканирующей электронной микроскопией образцов после их обработки раствором 2,5% глютарового альдегида и напыления золотом, в сравнении с необработанными культурой клеток контрольными образцами пенистых субстратов; одновременно подтверждалась и полнота удаления самих клеток. Таким образом доказано образование межклеточного матрика на пенистых гидрофильных полимерах двух химически различных типов - поливинилформале и эластичном полимочевинном полиэфирном полиуретане и показано, что в обоих случаях межклеточный матрикс покрывает около 70-75% поверхности полимеров (в основном исключая острые перегибы и сочленения перегородок в порах) по всему объему непрерывным слоем.

Преимуществом предлагаемых носителей является возможность селективного формирования межклеточного матрикса, как и самого конфликтного слоя клеток, только по одной из поверхностей пористых материалов, выполненных в виде пластины или листа определенной толщины (обычно 4-6) без существенного внедрения этого матрикса во внутренние поры пластины. Это достигается двумя приемами: 1) легким оплавлением в сочетании с подпрессовкой пластины полимерного субстрата только с одной стороны (поверхности), что ведет, во-первых, к резкому уменьшению размеров пор на этой поверхности (в 5-10 раз), без затрагивания пор в толщине пластины, во-вторых, резко нивелирует микронеровности этой поверхности, придавая ей некоторую "стекловидность" и уменьшает шероховатость; 2) плотным наложением такой пластины гладкой поверхностью сверху вниз на посеянную на ровную культуральную поверхность первичную культуру диссоциированных клеток, что способствует (в сочетании с уменьшенными размерами пор, уже сравнимыми с размерами самих клеток) разрастанию этих клеток в основном по поверхности без проникновения во внутренние поры в толще пластины.

Получение таких структур актуально при создании принципиально новых покровных материалов и повязок для лечения тяжелых ран и ожогов, когда чрезвычайно важно плотное взаимодействие именно межклеточного матрикса с пораженным участком для более эффективного его воздействия на собственные клетки раны и таким образом на процессы ранозаживления. С другой стороны, именно сохранение пор относительно больших размеров во всем остальном объеме очень существенно для введения и удержания в них растворов различных лекарственных препаратов (антибиотиков, анальгетиков, цитокинов и т.д.), также модулирующих ранозаживление. Далее в процессе ранозаживления и грануляции раны межклеточный матрикс, который целиком экспонирован на ране, подвергнется наиболее быстрой биодеградации, а с другой стороны воспрепятствует прорастанию собственной ткани раны вовнутрь пористого субстрата и обеспечит легкое и безболезненное отделение полимерной основы в случае ее бионедеградируемости.

Эта же структурная модификация новых композитных носителей является перспективной для поддержания разнообразных органолитических культур, выращиваемых, как известно, на границе раздела жидкой и газовой фаз. В этом случае такой материал может быть использован как плоская пористая основа требуемой толщины, покрытая биоактивным цитоадгезивным слоем и несущая в своих порах культуральную питательную среду. Особенно ценной такая конструкция представляется для выращивания плоскослойных органолитических культур эпителия кожи при создании живого дермального эквивалента, а также и для культур высокоспециализированных функционально поляризованных клеток, или для определения метастатического потенциала и выделения метастазирующих опухолевых клеток.

Гидрофильные пенистые полимеры механически измельчают в водной среде в измельчителе ткани с получением кусочков неправильной формы поперечным размером 3-6 мм для эластичного полиуретана и 4-8 мм - для поливинилформаля и размерами пор соответственно 100-500 мкм и 100-300 мкм. Суспензию кусочков пенополимеров тщательно отмывают раствором детергента, водой, этанолом, стерилизуют автоклавированием в водной среде и окончательно отмывают раствором ростовой питательной среды, содержащей 5% телячьей сыворотки.

Отмытые и слегка отжатые кусочки пенополимеров помещают в культуральные чашки Петри диаметром 60 или 100 мм неплотным слоем толщиной 10-15 мм и равномерно наносят на него сверху суспензию диссоциированных клеток первичной культуры эмбриональных фибробластов человека или эндотелия глаза быка в ростовой питательной среде с 5% телячьей сыворотки (3-5˙10⁵ клеток в 1 мл). Чашки оставляют в СО₂-инкубаторе на 16-18 ч для закрепления клеток на пенистом субстрате-носителе и затем осторожно переносят суспензию кусочков в другие чашки с одновременным их промыванием простой культуральной средой. Чашки с кусочками носителей оставляют СО₂-инкубаторе до достижения клетками монослоя на поверхности пор пенистой структуры (от нескольких дней до нескольких недель - в зависимости от типа клеток), периодически меняя ростовую питательную среду.

Контроль фиксации и пролиферации клеток на поверхности порообразующих пленочных перегородок носителей осуществлялся с помощью светового микроскопа.

После образования монослоя клеток кусочки носителей стерильно промывают трижды фосфатным буферным солевым раствором без ионов кальция и магния, рН 8,0-8,2, и обрабатывают с легким перемешиванием раствором следующего состава: дезоксихолат натрия 0,5%, хлорид натрия 150 мМ, этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) 2 мМ, фенилметилсульфонилфторид 2 мМ, 11-этилмалеимид 2 мМ, Трис-НСl 25 мМ, рН 8,0-8,2. Обработку проводят дважды по 5-7 мин. Слегка отжатые кусочки носителей промывают раствором 2 мМ Трис-НСl, 1 мМ фенилметилсульфонилфторида, рН 8,0 - дважды по 15 мин, затем последовательно растворами 2 мМ Трис-НСl, рН 8,0-8,2 - два раза, фосфатным буферным солевым раствором без ионов кальция и магния - два раза и водой - три или четыре раза.

Готовый композитный материал фиксируют обработкой 2,5% раствором глютарового альдегида для контроля поверхности сканирующей электронной микроскопией, либо отмывают ростовой питательной средой для дальнейшего использования в качестве носителя для культивирования и выращивания клеток и тканей.

Использование: биотехнология, медицина. Трехмерный биоактивный носитель для культивирования животных клеток и тканей содержит в качестве полимерной основы пенистый эластичный полимочевинно-полиэфирный полиуретан с размером пор 100 - 500 мкм или поливинилформаль с размером пор 100 - 300 мкм. Носитель покрыт выращенным на нем монослоем первичных стромальных клеток, которые обработаны раствором, содержащим дезоксихолат натрия, хлорид натрия, ЭДТА, фенилметилсульфонилфторид, этилмалеимид, трис-HCl, для образования межклеточного матрикса.

ТРЕХМЕРНЫЙ БИОАКТИВНЫЙ НОСИТЕЛЬ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ЖИВОТНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ, содержащий полимерный субстрат и выращенный на нем монослой первичных стромальных клеток, отличающийся тем, что в качестве полимерного субстрата он содержит пенистый эластичный полимочевинно-полиэфирный полиуретан с размером пор 100 - 500 мкм или поливинилформаль с размером пор 100 - 300 мкм, при этом носитель дополнительно обрабатывают раствором, содержащим дезоксихолат натрия, хлорид натрия, ЭДТА, фенилметилсульфонилфторид, этилмалеимид, трис-HCl, для образования межклеточного матрикса.