Способ определения количества гемоглобина крови Советский патент 1992 года по МПК A61B10/00 

Изобретение относится к ветеринарной гематологии и может быть использовано при ускоренном определении гемоглобина крови сельскохозяйственных животных как в условиях специализированных лабораторий, так и непосредственно в хозяйствах.

Известен гемиглобинцианидный метод определения содержания гемоглобина крови, заключающийся в трансформации гемоглобина в гемиглобинцианид, по интенсивности окраски которого проводится его количественная оценка. В кювету вводится 5 мл трансформирующего раствора, состоящего из ацетонциангидрина, калия железосинеродистого и натрия двууглекислого, и 0,02 мл крови, с последующим 10-минутным выдерживанием этой смеси и измерением ее оптической плотности на фо- тоэлектроколимегре, которая затем с помощью калибровочной кривой переводится в значение содержания гемоглобина.

Основным недостатком этого метода является длительность определения уровня гемоглобина (не менее 10 мин) и необходимость применения сложного, дорогостоящего и сетевого прибора фотоэлектроколориметра, требующего к тому же дополнительного 10-минутного про- ) грева. Кроме того, необходим сравнительно Ј дорогой набор химреактивов для приготовления трансформирующего раствора,

Наиболее близким к предлагаемому является солянокислый гематиновый метод определения количества гемоглобина крови, осуществляемый введением 0,02 мл крови в сосуд с 0,1 н. раствором соляной кислоты обьемом, приблизительно равным 1 мл, т. е. в соотношении 1 : 50, пятиминутным выдерживанием полученной жидкости и последующим поэтапным добавлением в нее дистиллированной воды до достижения цвета раствора, равным цвету стандарта гемометра.

Недостаток способа - его длительность получения результатов анализа (не менее 7 - 8 мин), небольшая точность и большая трудоемкость.

Многие элементы субъективности обусловлены визуальным определением цвета анализируемого раствора, погрешностью передозировки дистиллята при получении требуемого раствора, нестабильностью во времени цвета стандартного раствора гемоглобина, а также влиянием исскуственного освещения лабораторных помещений на результаты измерения.

Трудоемкость способа заключается в необходимости поэтапного добавления дистиллята и тщательного визуального конт- роля достигаемой при этом окраски раствора. В случае образования пены в раствор дополнительно предусматривается введение одной-двух капель серного эфира. В силу старения стандарта цвета требуется также проводить трудоемкую метрологическую поверку прибора (не реже 1 раз в б месяцев).

Цель изобретения - обеспечить ускоренное определение содержания гемогло- бина крови с одновременным повышением точности измерения и упрощения способа.

Указанная цель достигается тем, что в известном способе определения количества гемоглобина крови путем измерения кон- центрации солянокислого гематина, образуемого в растворе соляной кислоты при добавлении в него крови в определенном соотношении и выдерживании во времени, используют раствор соляной кислоты с концентрацией 0,02 - 0,05 н., при этом соотношение объем крови и раствора соляной кислоты выбирают соответственно равным 1 : 20 - 1 : 5, а определение количества гемоглобина крови осуществляют кондукто- метрически.

Чем больше значение удельного электросопротивления раствора, тем больше содержание гемоглобина в крови животных.

Описание предлагаемого способа опре- деления количества гемоглобина дается для режима, обеспечивающего наилучшие условия его проведения. Предлагаемый способ осуществляется следующим образом.

Пипеточным дозатором из пробирки взяли 0,02 мл свиной крови и поместили в 1 мл пробирку с 0,03 н раствором соляной кислоты, обьем которого выбран в 10 раз больше (0,2 мл). Пипетку, не вынимая из раствора кислоты, помыли путем 3-кратного всасывания раствора. По истечении 5 с осуществили забор раствора в микроячейку портативного кондуктомера объемом 50 мкл. Далее выполнили измерение величины удельного электросопротивления раствора, которое оказалось равным 189 Ом см. По калибровочной кривой находим, что данному значению удельного электросопротивления раствора соответствует содержание гемоглобина в анализируемой крови в коли- честве 12,4 %.

На перемешивание пробы крови и 3- кратную промывку пипеточного дозатора затрачено 8 с. Время выдержки раствора было 5 с, а на забор раствора в ячейку (объемом 50 мкл), измерение его удельного со,- противления и определение гемоглобина по калибровочной кривой затрачено 5 с. Таким образом, суммарное время анализа 1 пробы крови составило 8 с.

Представленные режимы реализации способа определения количества гемоглобина обусловлены необходимостью одновременного обеспечения целого ряда требований, перечень которых приводится ниже в порядке снижения их значимости.

Максимальная чувствительность способа, т. е. на один и тот же прирост показания содержания гемоглобина в крови должен быть получен максимальный прирост изменения удельного электросопротивления раствора солянокислого гематина; минимальное время полного гемолиза эритроцитов; минимальное время полного взаимодействия гемоглобина с раствором соляной кислоты; обеспечение большого соотношения между объемами крови и раствора соляной кислоты для получения объема анализируемого раствора, достаточного для заполнения измерительной электрической ячейки кондуктомера; выбираемое соотношение объемов крови и раствора соляной кислоты одновременно должно быть таким, чтобы можно было использовать промышленные пипеточные дозаторы с заведомо известными фиксированными объемами; значения удельного электросопротивления раствора солянокислого гематина желательно иметь приближенно в тех же пределах, в которых имеет место значение удельного электросопротивления крови (110 - 280 Ом-см) с той же целью, чтобы можно было использовать одну и ту же шкалу кондуктометра как для определения количества эритроцитов, так и количества гемоглобина.

Согласно изложенным требованиям для кондуктометрического определения содержания гемоглобина прежде всего необходи- мо обеспечение в растворе такой концентрации солянокислого гематина, чтобы при изменении содержания гемоглобина крови происходило наибольшее изменение удельного сопротивления исследуемого раствора.

Получено, что чувствительность способа определяется не только концентрацией раствора кислоты, но и соотношением объемов крови и раствора соляной кислоты. Согласно данным, представленным в табл. 1, при использовании 0,1, 0,05, 0,03 и 0,02 н растворов соляной кислоты максимальная чувствительность способа, т. е. максимальный прирост электросопротивления достигается при соотношениях смешиваемых

объемов жидкостей, равных соответственно 1 :2.5, 1 :5.1 : 10 и 1 : 20.

При этих оптимальных соотношениях объемов крови и раствора соляной кислоты определено значение оптимальной концентрации соляной кислоты при попарном сопоставлении разных ее концентраций (табл. 2). В опытных приняли, что допустимое снижение значения чувствительности способа не должно быть более чем в 1,5- 1,7 раза. Исходя из этого условия приемлемое значение концентрации соляной кислоты находится в пределах 0,1 - 0,02 н.

Пригодность этих значений концентрации соляной кислоты подтверждена и с позиции обеспечения высокой скорости гемолиза эритроцитов, полного и быстрого взаимодействия гемоглобина с раствором соляной кислоты (табл. 3) с целью осуществления экспресс-анализа проб крови. Согласно полученным результатам процесс гемолиза эритроцитов и взаимодействия гемоглобина с соляной кислотой при всех используемых ее концентрациях происходит достаточно быстро. Уже по истечении 5-6 с изменения электросопротивления раствора не выявляются. Это указывает на то, что реакция взаимодействия крови с раствором соляной кислоты в действительности завершается значительно раньше. При всех концентрациях раствора соляной кислоты, за исключением 0,01 н., цвет раствора при добавлении крови становится сразу бурым. При концентрации соляной кислоты 0,01 н. и менее, хотя раствор и сохраняет красный цвет, изменения электросопротивления раствора происходит на протяжении первых 60 с, что указывает на более длительный период гемолиза и одновременно на неполное связывание гемоглобина.

Согласно следующему критерию оптимальности, соотношение объемов крови и раствора соляной кислоты должно быть таким, чтобы можно было осуществить полное заполнение кондуктометрической ячейки без внесения воздушных пузырьков. Последнее практически осуществимо при объеме жидкости в пробирке в 2 - 3 раза больше объема ячейки. При исходном объеме ячейки 50 мкл необходим объем раствора солянокислого гематина не менее 100 мкл. Исходя из этого условия при фиксированном исходном объеме крови в 20 кмл соотношение объемов крови и раствора соляной кислоты должно быть не менее 1 : 5.

Следовательно, с учетом требуемого минимального анализируемого объема жидкости оптимальная концентрация соляной кислоты находится в пределах 0,05 - 0,02 н.

Использование 0,05 -0,02 н. растворов кислоты при соотношении объемов крови и раствора кислоты 1 : 5 - 1 : 20 позволяет, как следует из табл. 4, получать значения удельного электросопротивления на уровне 195 - 310 Ом см т. е. в тех же пределах, что и колебание удельного электросопротивления самой крови. Следовательно, эти предлагаемые значения концентрации кислоты

при соответствующем соотношении с объемом крови позволяют использовать единую шкалу кондуктомера (100 - 500 Ом.см) для

определения двух гематологических показателей: гемоглобина по предлагаемому способу и эритроцитов по известному.

При выборе исходной пробы крови обь еме 20 мкл и соотношении объемов крови и

раствора соляной кислоты 1: 5 - 1: 20 могут

быть использованы стандартные пипеточные дозаторы с объемом 100 - 200 мкл. Поэтому при выбранных соотношениях смешиваемых объемов жидкостей удовлетворяется и условие 4 требований.

В наибольшей степени необходимым требованием отвечает способ определения гемоглобина с использованием 0,03 н раствора соляной кислоты при соотношении объемов крови и раствора кислоты, равном

1 : 10. Удовлетворительные условия обеспечиваются при проведении анализа с использованием 0,05 и 0,02 н растворов соляной кислоты, поскольку при 0,05 н растворе кислоты уменьшается объем раствора, а при

концентрации ее менее 0,02 н заметно снижается чувствительность способа.

Технико-экономическая эффективность предлагаемого способа заключается в том. что он позволяет определить содержание

гемоглобина крови животных за 30 с, т. е. в 14- 16 раз быстрее, чем на гемоглобинометре и в 20 раз быстрее, чем на фотоэлектро- колориметре.

При использовании солянокислого гематинного метода источниками дополнительной погрешности являются достигаемая точность установления требуемого цвета при добавлении в раствор дистиллята и субъективность сравнительной визуальной оценки

цветов раствора и стандарта.

При использовании предлагаемого способа среднеарифметическое отклонение от показателей гемоглобина крови, полученных гемиглобинцианидным способом, не

превышало 5 %, в то время как по Сали в силу субъективности процесса сравнения цветов раствора и стандарта, неточности установления цвета раствора и старения стандарта цвета, оно достигало 10 - 35 %.

Предлагаемый способ требует меньше процедур, изменение осуществляется на простейшем электронном кондуктомере и без применения сравнительно дорогих хим- реактивов (ацетонциангидрин, калий желе- зосинеродистый, натрий двууглекислый и раствор гемоглобинцианида), Портативность используемого типа прибора и автономность его питания позволяет по сравнению с фотоэлектроколориметром применять способ не только е ветеринарных лабораториях, но и непосредственно в хозяйствах.

0

Формула изобретения Способ определения количества гемоглобина крови, включающий добавление крови в раствор соляной кислоты, выдерживание во времени и измерение концентрации солянокислого гематина, отличающийся тем, что, с целью ускорения анализа, повышения точности и упрощения способа используют раствор соляной кислоты с концентрацией 0,02 - 0,05 н, при этом соотношение объемов крови и раствора соляной кислоты равном 1 : 5 - 20, а определение количества гемоглобина крови осуществляют кондуктометрически.

Использование: ветеринарная гематология. Сущность изобретения: используют раствор соляной кислоты с концентрацией 0,02 - 0,05 н. Добавляют в него кровь в соотношении объемов 1 ; 5 - 20 Определение количества гемоглобина осуществляют кондуктометрически. 4 табл

Относительные величины прироста удельного электросопротивления раствора

солянокислого гематита (%) при изменении содержания гемоглобина в крови в

зависимости от соотношения объемов крови и раствора соляной кислоты для разных

значений концентрации раствора соляной кислоты

Относительные величины прироста удельного электросопротивления

растворов солянокислого гематина (%) при изменении уровня

гемоглобина в крови при разных сочетаниях

концентрации раствора соляной кислоты

Таблица 1

Таблица 2

Характер изменения удельного электросопротивления

раствора соляной кислоты при добавлении

крови в зависимости от времени

Значения удельного электросопротивления раствора солянокислого

тематика при разных концентрациях соляной кислоты и

соотношения объемов крови и раствора соляной

кислоты

Таблица 3

Таблица 4