Способ иммунотерапии Советский патент 1992 года по МПК A61K35/26 G01N33/68 

Изобретение относится к медицине, а именно к способам лечения лекарственными препаратами вторичных иммунодефици- тов, возникающих при хронических воспалительных заболеваниях в послеоперационном периоде, в результате радиационного поражения и т. п., а также аутоиммуных заболеваний.

При лечении иммуномодулирующими препаратами практически не используется хронотерапевтический подход, при котором следует учитывать существование суточных ритмов функциональной активности иммунной системы, Эти ритмы могут быть причиной различной чувствительности иммунокомпетентных клеток к лекарственным препаратам.

Лишь для небольшого числа иммуномо- дуляторов эндогенного происхождения существуют рекомендации по применению их в определенные фазы суточного цикла. Так, глюкокортикоидные гормоны рекомендуется вводить в утреннее, а Т-активин - вечернее время суток. Эти рекомендации базируются на принципе имитации циркадного ритма концентрации в крови здоровых людей данных веществ.

Лечебный эффект Т-активина, введенного всем больным в вечернее время (способ-прототип), оставляет желать лучшего - он составляет 45 %.

Целью изобретения является повышение эффективности лечения.

Поставленная цель достигается за счет того, что определяют суточные колебания чувствительности к препарату по изменению активности СДГ (сукцинат-дегидроге- наза) в лимфоцитах. Препарат вводят во время наибольшей чувствительности.

Сущность изобретения заключается в том, что определяют хртэнбэч тезию к Т-ак- тивину циркулирующих лимфоцитов индивидуально для каждого больного.

Как уже указывалось, известная хронотерапия препаратами тимуса по принципу имитации суточного ритма гормональной функции вилочковой железы у здоровых людей.

Известны также различные методы определения индивидуальной чувствительности лимфоцитов различных больных к

VJ

О1

ю

-активину. До сих пор не было известно олеблется ли чувствительность лимфоциов на протяжении суточного цикла. Заявиелями впервые показано, что такие колебания существуют, причем, они индивидуальны для каждого больного. Использование этого нового свойства обеспечивает положительный эффект. Следовательно, налицо существенные отличия.

Способ выполняют следующим обра- зйм;;-;;;;Л у : : : :- . ;. -;:;: - ..-. ,--;; ; ; ; .

Больных при поступлении в клинику обследуют с применением иммунологических методов . дценки функции Т-системы иммунитета. Н едостаточн о сть этой фун кцйи гШ казан йем для назначения препарата Т-активин. Для /определения оптимального режима применения препарата исследует In vitro чувствительность к нему лимфоцитов крови. Кровь забирают у больного в 8 часов утра и в 20 часов вечера. Исследование чувствительности лимфоцитов к Т-активину целе сообразно проводить: регистрацией изменений активности цитбхймйчески вы- являемого фермента сукцина дёгйдрогена- зы (СДГ) в лимфоцитах как венозной, Так в капиллярной кройй; из подушечки пйльца после инкубации цельной крови с препара-ТОМ . ,;V:;:X. ;.. . .. / - ../ :/ , . -У

; Т-активин назначают больнбму в то время, когда определяется наибольшая чувствительность к препарату лимфоц итов кро- в)С: .;.:;:/ ;;.; - .,.;/:. -г. , :..

: Чувствительность лимфоцитов к Т-ак- тйвину определяют следующим способом.

0,2 мл крови набирают в пипетку, промытую гепарином и добавляют к 0,2 мл за- буференното 0,9 % р-ра NaCI (PBS). Полученную смесь раскапывают по 0,1 мл в 2-центрифужные пробирки. В первую пробирку добавляют равный объем PBS или среды.1.99, а во 2-ю, равный объём раствора Т-активина на PBS или среде 199 с таким расчетом, чтобы конечная концентрация препарата была 0,1 мкг/млдлячелбвекаили 0,01 мкг/мл для мыши. Пробирки инкубируют в термостате в течение 1 часа при t° 37° С. После этрго их центрифугируют 10 мин. при скорости 1500 об/мин, отсасывают недостаточную жидкость, а из осадка приго- трвл;яют мазки на предметных стеклах. Мазки сразу фиксируют в 60 % ацетоне 1 мин при t° 4° С и проводят цитохимическую реакцию на выяснение активности СДГ (4). После этого ядра клеточных элементов докрашивают 1 % р-ром малахитового зеленого, промывают дистиллированной водой и исследуют под световым микроскопом при увеличении: о.к. 10, об. 90 с применением масляной иммерсии. Активность

фермента оценивают по среднему количеству гранул формазана в 1 лимфоците. Реакцию чувствительности учитывают по достоверному увеличению фермента в пробах с Т-активином по сравнению с контрольной пробой. Ошибка метода - 15 %.

Было проведено экспериментальное исследование возможности эффективности лечения Т-активином с учетом суточных колебаний чувствительности лимфоцитов к последнему. Эксперименты выполнены на

мышах, которым было смоделировано имму- нодефицитное состояние: облучение в дозе 200 и тимэктомия во взрослом состоянии. В

той и другой группе было использовано по 20 животных. Для определения чувствительности к Т-активину использовались следующие концентрации препарата: 1; 0,1 и 0,01 мкг/мл. Оптимальной оказалась ковцентрация 0,01 мкг/мл (табл. 2). Инкубация крови . животных с данной дозой препарата вызвала достоверную активацию в утреннее время суток (табл. 1).;

Животные были обработаны Т-актйвином в разовых дозах 0,03 и 6,003 мкг на мышь (количество инъекций - 5). Введение препарата проводилось в утреннем и вечернем режиме инъекций. Результаты оценивались по уровню иммунного ответа на

эритроциты барана, регистрируемого по количеству антителробразующих клеток в се: , лезенке на 4-е сутки после иммунизации 5 % суспензией эритроцитов барана. Контролем служили мыши, обработанные в тех же

режимах равным объемам физиологическо- . го р-ра NaCI. В результате, после курса инъекций Т-активином в дозе 0,03 мкг на мышь иммунный ответ облученных мышей повысился по отношению к контролю и при утрением, и при вечернем режиме применения препарата. У тимэктомирован- ных мышей стимулировался иммунный ответ только при утреннем режиме инъекций. Доза Т-активина 0,003 мкг намышь стимулировала иммунный ответ у облученных мышей только при утреннем режиме введения. У тимэктивированных животных стимуляция иммунного ответа наблюдалась в утренней группе в 6,7 раза, а в вечерней в 1,5 раза (табл. 2). Таким образом, при терапии экспериментальных иммунодефици- тов Т-активинОм с учетом времени наивысшей чувствительности лимфоцитов к препарату оказалось возможным получить

хороший иммуностимулирующий эффект

при 10-кратном снижении дозы препарата.

Следующая серия экспериментов была

проведена с мышами Swiss, у которых с

возрастом спонтанно развивается генетически запрограммированное аутоиммунное

заболевание с волчаночноподобным синдромом. Патогномоничными диагностическими признаками данного заболевания является антинуклеарных наличие аутоан- титэл (AHA) в плазме крови, спленомегалия, иммунокомплексный гломерулонефрит. В оценке процессе мы использовали первые два симптома. Титры AHA определяли до и после инъекций Т-активина. Спленомега- лию по величине селезеночного индекса после курса инъекций. До начала применения Т-активина определяли чувствительность лимфоцитов крови к препарату в утреннее и вечернее время. Лечение Т-зктивином проводили в разовой дозе 0,01 мкг на мышь. На курсе было использовано 10-11 инъекций через день. Введение препарата применяли в утреннем и вечернем режимах. Состояние животных после курса обработки Т-активи- ном оценивали следующим образом;

1)снижение титров AHA и близкий к норме селезеночный индекс - улучшение состояния (+);

2)неизменность титров AHA и близкий к норме, или незначительно повышенный селезеночный индекс - стабилизация процесса (0);

3)повышение титров AHA и повышенной селезеночный индекс - прогрессирова- ние заболевания (-).

В 2 идентичных экспериментах было использовано в общей сложности 50 животных. По времени наивысшей чувствительности лимфоцитов кТ-активину были выделены мыши, чувствительные утром, вечером и спорные случаи, когда чувст- вительность была одинаковой утром и вечером или ее не было вообще, к спорным случаям мы относим также мышей, у которых лимфоциты реагировали на Т-активин снижением активности СДГ, вместо обычного повышения.

В результате экспериментов получены данные, представленные в табл. 5.

Коэффициент взаимной сопряженности между режимом и эффективностью лечения составил 0,44 при Р 0,99. Таким образом, наилучшие результаты дает применение Т- активина в режиме, совпадающим со временем максимальной чувствительности лимфоцитов к препарату.

Для проверки возможности переноса экспериментальных данных по хронотерапии Т активином в клинику было проведено обследование и лечение по хронотерапевти- ческому принципу 22 больных с хроническими воспалительными гинекологическими заболеваниями, у которых выявлен иммунодефицит и 11 больных с раком гортани, которым была проведена операция экстирпации

гортани, ИД выявлен до и после операции, 11 больных с раком гортани, 6 больных T3NOMO, 5 больных T3NMO (по классификации ВОЗ Тз - стадия 3, N - наличие лимфо- 5 узлов, М - наличие метастазов). Всем больным была проведена операция экстирпация гортани, а при наличии метастазов в лимфоузлы - лимфоаденоэктомия. ИД выявлен до и после операции. В послеопераци- 0 онном периоде всем пациентам проводилась обычная терапия, включая ан- тибактериал ьную, десенсибилизирующую, общеукрепляющую. Всем этим больным было показано назначение препарата Т-акти- 5 вин. У больных до назначения препарата определяли состояние Т-клеточного звена иммунитета (данные не приведены) и чувствительности его Т-активину утром и вечером по указанным выше методом. Из 3-х 0 использованных для инкубации концентраций Т-активина (1, 0,1 и 0,001 мкг/мл) оптимальной оказалась 0,1 мкг/мл. После этого назначали Т-активин в режиме, совпадающем или не совпадающем с временем чув- 5 ствительности лимфоцитов по СДГ. Среди больных выделены группы чувствительности к Т-активину утром, вечером и не чувствительные к препарату.

Результаты обследования, режим и ре- 0 зультаты лечения гинекологических больных приведены в табл. 4, больных с раком гортани в табл. 3. Эффективность гинекологических больных оценивали по следующим .критериям: нормализации показателей об- 5 щего анализа крови, температуры тела, бимануального и ультразвукового исследования органов малого таза. Эффективность лечения больных с раком гортани оценивали по следующим критериям: нор- 0 мализация общего анализа крови, температуры тела, очищение раны от гноя, , появление живой грануляции в ране, заживление раны. В обоих случаях учитывали динамику симптомов интоксикации: сухость 5 слизистых, слабость, тошнота, отсутствие аппетита и т. д. Положительную динамику обозначали знаком +, отсутствие положительной динамики - знаком 0 (табл. 3, 4). В таблице 5 представлен эффект хронотера- 0 пии Т-активином экспериментальных животных и людей в режимах, совпадающих и не совпадающих с максимумом чувствительности лимфоцитов к препарату по СДГ.

Сопряженность между эффективностью 5 лечения и режимом применения препарата оценена по критерию Пирсона X2, который составляет 1,495 (р 0,05),

Таким образом, хронотерапия Т-активином с учетом индивидуального времени наивысшей чувствительности лимфоцитов

крови к препарату по СДГ дает значительно лучшие результаты, чем общепринятая схема назначения препарата всем больным в вечернее время. Для сравнения эффективности лечения Т-активином по способу- прототипу (только вечером) и по предлагаемому способу, нами была дополнительно проанализирована группа больных из 20 человек, которым препарат назначался только вечером без учета чувст- вительности к нему лимфоцитов. Положительный эффект от лечения отмечен у 9 больных, т. е. составил 45 %, в соответствии с результатами таблицы 6. Эффект от лечения пб предложенному способу - 75 %. Сле- довательно, предложенное решение на 30 % повышает эффективность лечения. Кроме того, способ позволяет не проводить лечение препаратом, предварительно установив, что эффекта от лечения не будет.

Примеры конкретного выполнения.

Пример 1. Больная Л., 22 года, история болезни № 9109, находилась на обследовании и лечении во втором отделении гинекологической больницы № 1 г. Новоси- бирска с диагнозом: левосторонний саль- пингоофорит, обострение хронического двустороннего аднексита. Из анализа известно, что больная страдает воспалением придатков в течение 5 лет, обострение забо- левания бывают каждые 3-6 месяцев. Больной было проведено исследование Т-клеточного звена иммунитета, выявлен иммунодефицит и в соответствии (3) назначен препарат в дозе 1 мл п/к на ночь. Общий анализ крови до лечения: гемоглобин - 132 г/л; лейкоциты - 8,8 х 109; эозинофилы - 1 %; палочкоядерные-3 %;сегментоядерные - 68 %; лимфоциты - 26; моноциты - 3 %; скорость оседания эритроцитов (СОЭ) - 41 мм/час. Общий анализ крови после лечения: гемоглобин - 120 г/л; лейкоциты - 6,6 х эозинофилы - 0; палочкоядерные - 3 %; сегментоядерные - 59 %; лимфоциты -32 %; моноциты - 6 %; СОЭ -40 мм/час. Бима- нуальное исследование до лечения: тело матки нормальной величины, безболезненное, придатки утолщены в спайках болезненные. Бимануальное исследование после лечения при выписке: придатки утолщены с обеих сторон, болезненные.

УЗИ до лечения: матка обычной величины, справа от матки в области придатков толстостенное образование разнородной консистенции с преобладанием солидного компонента размером 6x4 см, аналогичное образование определяется и в области левых придатков размером 3x4 см.

УЗИ после лечения: образования остались практически тех же размеров. При выписке из стационара после проведения лечения у больной сократились жалобы на тянущие боли внизу живота, слабость.

Лечение было неэффективным: в общем анализе крови осталось высокая СОЭ, при бимануальном исследовании и УЗИ - исследовании положительная динамика не отмечалась.

Через 3 месяца после выписки боли ста-, ли интенсивными, температура тела повысилась до 38° - 38,5°С. Проводимое амбулаторное противовоспалительное лечение, эффекта не обеспечивало, и больная вновь была госпитализирована в гинекологическую больницу № 1.

История болезни N210828, диагноз: обострение двусторонне хронического аднексита, сальпингоофорит слева. Была определена чувствительность к тактивину утром и вечером (08.00 и 18.00 ч) по выше описанному методу и с учетом наличия чувствительности утром (табл, 4, строка 1), был назначен тактивин в дозе 1,0 подкожно в 8 часов утра № 5. Субъективно, уже начиная с 3 дней лечения, нормализовалась температура тела, купировались боли, начался проф- люенс.

Общий анализ крови до лечения: гемоглобин - 134 г/л, лейкоциты - 15,3 х 109/л, палочкоядерные- 12 %, сегментоядерные - 68 %, лимфоциты - 17 %, моноциты - 3 %, СОЭ - 45 мм/час.

Общий анализ крови после лечения: гемоглобин - 130 г/л, лейкоциты - 4,8 х 109, эозинофилы - 1 %, палочкоядерные- 3 %, сегментоядерные - 63 %, лимфоциты - 28 %, моноциты - 5 %, СОЭ - 13 мм/час.,

Бимануальное исследование до лечения: тело матки отдельно не пальпируется. Интимно к матке примыкает образование размером 6x6 см, нижний полюс которого хорошо пальпируется, а верхний полюс из- за болезненности не определяется. Справа сзади пальпируется инфильтрация, доходящая до стенок таза в виде веера.

Бимануальное исследование после лечения: тело матки нормальной величины, придатки с обеих сторон в спайках безболезненны. УЗИ после лечения: матка обычных размеров. Кистозные изменения в яичниках. В малом тазу патологических образований не определяется. Лечение больной было эффективным. В общем анализе крови стали нормальными показатели общего количества лейкоцитов, снижение па- лочкоядерных нейтрофилов и СОЭ до нормальных показателей. При бимануальном исследовании и УЗИ после лечения образований не обнаружено, При повторном

осмотре через 5 месяцев наблюдается стойкая ремиссия.

Пример 2. Больная Г., история болезни № 2353, находилась на обследовании и лечении в гинекологической больнице № 1 г. Новосибирска, с диагнозом: двусторонний сальпингоофорит. Из анализа выяснено, что больная страдает воспалением придатков в течение 15 лет. Последний раз обострение было 1,5 года назад.

После определения чувствительности лимфоцитов к тактивину по активности фермента СДГ, было выявлено наличие чувствительности в вечернее время (табл. 4, строка 11). С учетом этого назначен тактивин в 20.00 в дозе 1,0 подкожно. После проведенного лечения тактивином был отмечен выра- женный эффект: - нормализовалась температура тела, купировались боли внизу живота, значительно улучшилось общее са- мочувствие, исчезла интоксикация.

Общий анализ крови до лечения: гемоглобин -116 г/л, лейкоциты - 9,7 х 109, эози- нофилы - 1 %, палочкоядерные - 6 %, сегментоядерные - 54 %, лимфоциты - 36 %, моноциты-3 %. СОЭ - 66 мм/час; через 8 дней лечения: гемоглобин - 130 г/л, лейкоциты-8,4 х 109, эозинофилы-2 %, палочкоядерные - 4 %, сегментоядерные - 49 %, лимфоциты - 39 %, моноциты - 6 %, СОЭ - 18 мм/час. После лечения тактивином: гемоглобин - 117 г/л, лейкоциты - 7,4 х 109, эозинофилы - 5 %, палочкоядерные - 1 %, сегментоядерные -50 %, лимфоциты - 40 %, моноциты-4 %, СОЭ-40 мм/час.

Бимануальное исследование до лечения: тело матки увеличено до 7 недель беременности, ограниченная в подвижности, болезненная. Придатки: слева определяется образование 4x5 см, болезненное, тол- стостенное, справа 3x5 см, болезненное.

После лечения: тело матки несколько отклонено вправо, увеличено до 6 недель беременности, подвижное, безболезненное. Придатки: справа - не определяются, безболезненные, слева и позади матки определяется образование 4x4, умеренно болезненное.

Через 2 месяца после лечения: тело матки обычных размеров, безболезненное, придатки без пальпаторных изменений.

УЗИ органов малого тэза до лечения: матка увеличена до 6 недель беременности, полость растянута гипертрофированным эндометрием. Слева и глубоко в заднем сво- де жидкостное образование, толстостенное, четкообразное 12x8 см, справа -6x2 см.

УЗИ после лечения Т активином: матка без особенностей, отклонена вправо, в области правых придатков спаечный процесс, в области левых придатков жидкостное образование, вытянутое, неправильных контуров, размеров 7x7.

УЗИ через 2 месяца после лечения: матка обычных размеров, в области придатков спаечный процесс.

Лечение больной было эффективным: после лечения нормализовались показатели крови, в малом тазу образования не определяются.

После определения чувствительности лимфоцитов к Т-активину по активности фермента СДГ было выявлено достоверно повышение активности в вечернее время (табл. 4, строка 11) и с учетом этого назначен Т-активин в 20.00 часов в дозе 1,0 подкожно. После второй инъекции был отмечен вы- раженный эффект: нормализовалась температура тела, купировались боли внизу живота, значительно улучшилось самочувствие, уменьшилась интоксикация.

Пример 3. Больная П., 26 лет, № истории болезни 11106, находилась на лечении во втором отделении гинекологической больницы № 1 г. Новосибирска с диагнозом: обострение хронического двустороннего аднексита.

Больна в течении четырех лет, обострение заболевания бывает до 4 раз в год - лечение амбулаторное и в стационаре.

При определении чувствительности лимфоцитов к Т-активину по активности СДГ было выявлено отсутствие чувствительности (табл. 4 строка 4). Назначение препарата не показано.

Пример 4. Больной С., 35 лет находится в ЛОР-отделении 1 ГКБ с диагнозом: рецидив опухоли, состояние после экстирпации гортани фарингостома. Проведена боковая фаринготомия справа. В послеоперационном периоде на фоне обычной терапии возникли осложнения: расхождение и нагноение швов, образование фарингосто- мы на 4-5 сутки после операции. Больному добавлено местное применение гипертонических растворов, антисептиков. Эффект в течение 8 дней отсутствовал. На 11 день после операции больному в терапию добавлен Т-активин, который вводили согласно ритма чувствительности. В 20.00 часов обычной терапевтической дозе № 5. На 3 сутки уменьшилось нагноение, а к 5 - прекратилось, на 2 сутки улучшился аппетит, сон. На 3 сутки в ране появились грануляции, на 10 сутки от начала лечения Т-акти- вином отмечено заживление раны вторичным натяжением. Фарингостома закрылась самостоятельно (табл. 3, строка 5).

Пример 5. Мышь Ms 11 с аутоиммунным заболеванием волчаночноподобного типа. Определен титр антинуклеарных ауто- тел (AHA) в плазме крови, который был равен 1:512. Определены суточные колебания чувствительности СДГ лимфоцитов крови к Т-активину по описанному выше методу. Оказалось, что в лимфоцитах крови, взятой утром, активность СДГ после инкубации с Т-активином повысилась с 15,7 гранул в контроле до 20,5 гранул (Р 0.05). В лимфоцитах крови, взятой вечером, активность СДГ была 17,2 гранулы в контроле и 20,3 гранул (Р 0,05). Таким образом, у данной мыши была определена наивысшая чувстви- тельность лимфоцитов к Т-активину в утреннее время суток. Животному был проведен курс инъекций Т-активина в разовой дозе 0,01 мкг числом 11, через день, в утреннее время. По окончании кур са инъек- ций титр AHA у данного животного снизились до значения 1 : 64 при отсутствии спленомегалии (селезеночный индекс 3,67, т, е. в пределах нормы). Таким образом, можно констатировать, что в результате ле- чения аутоиммунный процесс в определенной степени подвергся обратному развитию.

Мышь № 24 с аутоиммунным заболеванием волчаночноподобного типа. Титр анти-

нуклеарных аутоантител перед применением Т-активина 1 : 128. Наивысшая чувствительность лимфоцитов крови к Т-активину по активации СДГ определена в утреннее время суток: 8,1 гранулы в контроле, 13,5 гранул после инкубации с Т-активином (Р 0,05). Вечером соответствующие цифры1 были: 17,2 и 18,1 (Р 0,05). Животному было сделано 11 иньекций Т-активином в разовой дозе 0,01 мкг через день в вечернее время суток (т. е. в режиме, противоположному ритму чувствительности у препарату). В результате титр АН А увеличился до 1:512, а селезеночный индекс составил 6,17, т. е. выше нормы. Таким образом, у данного животного наблюдалось прогрессирование аутоиммунного процесса, положительного эффекта от применения Т-активина не отмечено. Ф о р м у л а и з о б р ет е н и я

Способ иммунотерапии, включающий введение Т-активина, отличающийся тем, что, с целью повышения эффективности лечения, в течение суток определяют активность сукцинат-дегидрогеназы лимфоцитов под действием Т-активина и дальнейшее введение препарата осуществляют в то время суток, которое соответствует наибольшему повышению активности исследуемого показателя.

Таблица

Изобретение относится к медицине, в частности к иммунологии. Цель - повышение эффективности лечения. Для этого при проведении иммунотерапии Т-активином в течение суток исследуют активность сукци- нат-дегидрогеназы лимфоцитов под воздействием вводимого препарата и дальнейшее введение осуществляют в то время суток, которое соответствует наибольшему повышению исследуемого показателя. 5 табл.

Чувствительность лимфоцитов крови мышей к Т-активину в утреннее и вечернее время суток (по показателю активации СДГ по среднему количеству гранул в 1

лимфоците)

х -Среднее количество гранул, достоверно отличающихся от контроля (к) ( ,05; критерий Вилкоксона-Манна-Уитни)

Таблица2

Количество АОК в селезенке (хЮ3) на 4-е сутки после иммунизации эритроцитами барана у мышей с экспериментальными иммунодефицитами после курса инъекций Т- активина

х - Количество АОК в селезенке (хЮ3), подчеркнуты значения, достоверно отличающиеся от контроля при Р 0,05 (критерий Вилкоксоена-Манна-Уитни)

,Т а б л и

Результаты обследования и эффективности хронотерапии Т-активином больных раком гортани

- среднее количество гранул в 1 лимфоците, достоверно отличающиеся от контроля

(Р.0,05), критерий Вилкоксона-Манна-Уитни + - эффект положительный

-- эффект отсутствует

ц а 3

Результаты обследования и эффективности хронотерапии Т-актиеином больных хроническими воспалительными заболеваниями

х - среднее количество гранул в 1 лимфоците, достоверно отличающиеся от контроля

(Р 0,05), критерий Вилкокса-Манна-Уитни + - эффект положительный - - эффект отсутствует

Результаты хронотерапии Т - активином экспериментальных животных и больных хроническими воспалительнвми и ЛОР - онкологическими заболеваниями

Таблица1

Таблицаб