Устройство для замораживания живых биологических объектов в контейнерах Советский патент 1989 года по МПК F25D3/10 

сд to

NP

01

Изобретение относится к холодильной технике, а более конкретно к аппаратам глубокого программного замораживания различных живых биологических объектов, например вьщеленных из организма или культивируемых в искусственшях условиях клеток, тканей и небольших органов лдавотных и растений, для последующего их сохра- нения при сверхнизких температурах и pereHepaii iH после оттаивания исходных клеток и тканей, а в случае меристем, почек и эмбрионов расте- НИИ и животных для возобновления их роста и развития и получения полноценных организмов.

Целью изобретения является повышение coxpaIп ocти замораживаемых биологических объектов.

На чертеже схематично изображено устройство для замораживания живых биологических объектов в контейнерах.

Устройство содержит теплоизолированную камеру 1 заморалшвания, систему 2 подачи криоагента в камеру 1, содержащую трубку 3,от которой непосредственно перед камерой 1 ответвляется трубка 4 и исполнительный орган 5 е Последний связан с системой 6;-программного управления. Усройство также, содержит установленны в камере 1 держатель 7 контейнеров 8,, выполкенньп в виде тонкостенной трубки, ответвленную от трубки 3 трубку 9 с размещенным на ней испол нительньм органом, напримерj электромагнитным клапаном 10, связанным с системой 6 программного управлени и трубку 11 отвода хладагента. Устройство снабжено системой 12 измерения температуры в камере 1 и контейнерах 8 с датчикаьш 13 и 14, под ключёниьми к системе 6 .программного управления

Держатель 7 имеет выступы 15, в которых могут быть выполнены пазы 16. Контейнеры имеют пробки 17 Ш1И

18,имеющие поперечнуго перегородку

19,выполненную под ней полость 20, заполненную нетоксичным, водным гелем.

Пробки имеют фиксирующие элемент для крепления их на выступах 15 держателя 7. У пробок 18, такими фик- сирующими элементами являются ручки 21, размещаемые в пазах 16 выступов 15, а у пробок 17 такими эле

0

5

0

5

0

5

ментамл; являются полые ручки 22, плотно надеваемые на выступы 15 держателя 7. При использовании крупных контейнеров емкостью несколько сот миллилитров необходимы дополнительные крепежные элементы. Вся поверхность держателя 7 (за исключением выступов, занятых контейнерами в данном процессе замораживания), и ,, поверхности подводящей и отводящей трубок 9 и 11 должны быть теплоизолированы. Держатель соединяется с этими трубками быстрозатягивающи- мися гайками или секторными байонет- ными замками (не показаны),

Устройство работает следуклцим образом.

Включают программу замораживания и лсидкий азот из системы 2 по трубкам 3 и 4 через исполнительный орган 5 поступает в камеру 1 замораживания в количестве, достаточном для сниже- ния температуры внутри камеры 1 с заданной скоростью. Электромагнитный клапан при этом закрыт,Тем временем оператор одевает на выступ 15 держателя 7 охлажденные до низкой положительной температуры контейнеры 8, нг1полнензш е раствором с биообъектами до пробок, полости 20 которых заполнены полутвердым гелем нетоксичного вещества, и, следовательно, раствор и гель контактируют между собой. После снижения температуры в камер е 1 примерно до температуры контейнеров 8 оператор устанавливает держатель 7 вместе с надетыми на его выступы 15 контейнерами В и быстро соединяет его гайками (или замками) с трубками 9 и 11, Контейнеры могут быть располо- жены под углом 0-45 к вертикали, В контрольный контейнер 8 вставляется датчик 14 так, чтобы его чувствитель- ньй элемент находился в центре (или несколько выше) зоны раствора и во всяком случае над зоной, занимаемой оседающими клетками или другими биологическими объектами. При дальнейf щем охлаждении камеры 1 температура в ней стабилизируется около (-1 С), После того, как температура в контейнерах сравняется с температурой

. камеры (при скорости охлаждения О,5 С/мин для этого требуется 1-2 мин) включается электромагнитный клапан 10 и поток сначала очень холодных паров, а потом и жидкого азота устремляется по трубке 9 через держатель 7, инициируя кристаллизацию водной фаиы в гепе., находящемся в полостях 20 пробок контейнеров 8 и по трубке 11 выходит в атмосферу. Через 10-15 с клапан 10 выключается, поток через держатель 7прекращается,но стабилизация температурил в камере 1 продолжается еще в течение 5-10 мин, чтобы возникшие во время 10-15-ти секундного импульса резкого охлаждения в водной фазе геля кристаллы льда успели вьфасти и достигнуть противоположной поверхности, контактирующей с раствором в контейнере. Затем стабилизация выключается и возобновляется медленное снижение температуры в камере с заданной скоростью. Когда температура внутри контейнеров понизится до точ ки замерзания раствора, немедленно,

без всякой задержки и переохлажде-. НИН начнется кристаллизация в растворе, поскольку раствор уже соприкасается с кристаллами льда, торчащими из геля. В результате выделения скрытой теплоты кристаллизации раствора температура внутри контейнеров начнет отставать от температуры камеры 1 и может на какое-то время оставаться на одном уровне. Расхождение показаний датчиков 13 и 14 служит сигналом к система 6 программного управления останавливает сношение температуры в камере 1. После вьфавни- вания показаний датчиков 13 и 14 снижения температурь; автоматически возобновляется с заданной скоростью в соответствии с дальнейшей программой охлаждения, В большинстве случаев после -40 или -70 с уже возможно быстрое замораживание непосредственно в жидком азоте, что улучшает результаты. Поэтому после окончания nporpariMH медленного ох- лазкдения оператор быстро отсоединяет держатель 7 и погружает -эго з жид-кий азот вместе с контейнераш, если их много и невозмож1ю исе снять настолько быстро, чтобы избежать ка;кого-либо подъема температуры внутри них, хотя бы и кратковременного. Затем, после того как контейнеры достигнут температ уры азота (), оператор уже без излишней спешки извлекает их и переносит в специальные хранилища в жидкий азот Ш1И в его пары (температура должна быть всегда ниже -140°С).

5

0

5

0

Таким образом, предлагаемое устройство обеспечивает практически иде- альнзто плавную кристаллизацию в растворах с биологическиьш объектами без каких-либо, хотя бы и небольших скачков температуры и соответ- ствутащих им изменений скорости роста кристаллов льда, а, значит, и скорости обезвоживания клеток, причем весь процесс может быть легко автоматизирован на одном держателе 7 могут находиться контейнеры с различными растворами криопротекторов, очень разные точки замерзания, и все равно достаточно только одной инициации кристаллизации около (-1 C) и во всех контейнерах обеспечивается одинаково плавная постепенная кристаллизация. Могут быть установлены также отдельные контрольньге контейнеры с 14 для каясдой группы расткоров с близкими точками замерзания. Так как точки замерзания растворов практически всех криопротекторов лежат- ниже температуры -1°С и вследствие очень низкой скорости роста кристаллов льда из-за чрезвычайно высокой вязкости геля переход кристаллов в раствор, контактирующий с ге0

5

0

исключен. Только в дальнейшем ходе процесса после того, как кристаллы льда достигнут противоположной

5 повер хности геля,. контактирующей с раствором, и после снижения темпе ратуры камеры до точки замерзания раствора начнется его кристаллизация, причем без вякого переохлажде- щш „ Это снижение может быть очень медленным: современные программные заморажЕ ватели обеспечивают скорость охлаждения 0,1 С/мин. Поэтог-1у рост. кристаллов будет столь же медленным, а так как клетки обычно оседают в Н1-о-:апою часть контейнеров то при условии расположения контейнеров под углом к вертикали кристаллы сначала будут расти в зоне, где нет клеток и вдали от них. Тем самым обеспечивается очень мягкое, постепенное, близкое к идеальному обезвоживанию клеток, при котором потоки воды в наименьшей степени

5 повреждают клеточные мембраны. С

другой стороны, когда кристаллы льда все же достигают клеток последние уже будут достаточно обезвожены,что

полностью исключит губительную кри- - сталлизацию внутри клеток.

Таким образом, предлагаемое устройство обеспечивает повышение сохранности замораживаеьшх биологических объектов.

Формула Изобретения

«

1. Устройство для замораживания живых биологических объектов в контейнерах содержащее камеру замораживания , систему подачи криоагёнта в камеру с исполнительным органом, связанным с системой; программного управления, систему измерения температуры в камере и контейнерах, установленный в камере держатель контейнеров, выполненный в виде тонкостенной трубки, систему подачи жид

кого криоагёнта к держателю с раз мещенным на трубопроводе исполнительным органом, отлич.ающееся тем, что, с целью повышения сохранности замораживаемых биологических объектов, держатель имеет выступы, а контейнеры снабжены пробками, имеющими поперечную перегородку, выполненную под ней полость и фиксирующие элементы для крепления на указанных выступах с обеспечением контакта между ними и перегородками. При этом полости пробок заполнены нетоксичным водным гелем.

2. Устройство non.l, отличающееся тем, что, с целью упрощения конструкции, исполнительный орган в системе подачи жидкого криоагёнта к держателю представляет собой электромагнитный клапан.

Изобретение относится к аппаратам глубокого программного замораживания различных биологических объектов. Целью изобретения является повышение сохранности замораживаемых биологических объектов. Жидкий азот из системы 2 по трубкам 3, 4 через исполнительный орган 5 подают в камеру (К) 1 замораживания. На выступы 15 держателя (Д) 7 надевают контейнеры 8, наполненные раствором с биообъектами до пробок, полости 20 которых заполнены полутвердым гелем нетоксичного вещества. Вводят Д 7 и К 1. После того, как температура в контейнерах 8 сравняется с температурой в К 1, включается электромагнитный клапан 10

поток хладагента проходит по трубке 3 через Д 7, инициируя кристаллизацию водной фазы в геле, и по трубке 11 выходит в атмосферу. После снижения температуры К 1 до точки замерзания раствора с биообъектами начинается кристаллизация в нем, поскольку раствор уже соприкасается с кристаллами льда, торчащими из геля. В устройстве обеспечиваются постепенное обезвоживание клеток и наименьшая степень их повреждения. 1 з.п. ф-лы, 1 ил.