Штамм гриба GLIосLаDIUм сатеNULатUм GILмаN. ет Аввотт для получения препарата против грибных возбудителей картофеля Советский патент 1993 года по МПК A01N63/00 C12N1/14 

Штамм имеет следующую характеристику,

.ультурально-морфологические признаки,

На картофельно-глюкозном агаре колония клочковато-пушистая, белая, с оливко- во-зелеными концентрическими зонами спорокошения в центре колонии. Конидие- носцы шероховатые около 100 мкм длиной. Кисточка трехярусная, веточки 15-20x4 мкм, метулы 7-10x2,5 мкм, фиалиды 10-20x2 мкм. Конидии эллипсоидные, 4-8x3-4 мкм, гладкие, светло-зеленные в длинных слизистых колонках.

Линейный рост колонии на агаризован- ных средах:

1.На сусло-агаровой среде - на 5-ый день роста - 21 мм, на 10-ый день - 30.мм, на 20-ый день - 90 мм; .

2.На картофельном агаре - на 5-ый день роста - 28 мм, на 10-ый - 44 мм, на 20-ый день - 80 мм;

З.На среде Чапека на 5-ый день роста - 21 мм, на 10-й день - 33,5 мм, на 20-ый день

-63,5 мм;

4.На овеянном агаре на 5-ый день роста

-24,5 мм, на 10-ый день - 43 мм; на 20-ый день - 75,5 мм;

5.На картофельно-глюкозном агаре на 5-ый день роста - 30 мм, на 10-ый - 45,5 мм, на 20-ый день - 90 мм.

Спорообразование гриба на агаризо- ванных средах на 21-ый день роста

1.На сусло-агаровой среде - 6,5x10 конидий в 1 мл;

2,На агаре Чапека - 7,2x10 конидий в 1 мл;

З.На картофельно-глюкозном агаре - 6,5x10 конидий в 1 мл;

4,На картофельном агаре - 4,4x10 конидий в 1 мл;

5.На овсяном агаре - 1,2x10 конидий в 1 мл.

Спорообразование начинается на 5-ый день роста, максимум спорообразования на 21 день, .-

И.физиолого-биохимические свойства.

Из источников углерода усваивает глюкозу, галактозу, сахарозу, мальтозу, фруктозу, арабинозу, рамнозу, Хорошо усваивает нитратный, нитритный и аммонийный азот.

Растет в широких пределах рН от 2,0 до 9,0.

Продукт синтезируемый штаммом не устанавливался.

Признаки штамма устойчивые.

Штамм периодически пересевается и хранится в пробирках на картофельно-глю- козной среде и сусло-агаровой среде при температуре 20-25°С.

Штамм Gllocladium catenulatum Gilmann. et Abbott. ВНИИСХМ ВИЗР Д-43 не патогенен для теплокровных животных. При м ё р 1. Отбор штаммов грибов-антагонистов к возбудителю фузариоза картофеля Fusarlum sambuclnum Fuck.

Основным и наиболее опасным патогеном картофеля при хранении является гриб Fusarlum sambuclnum Fuck. В связи с этим

отбор грибов-антагонистов проводился к наиболее вирулентному штамму Fusarlum sambucinum Fuck. 34 Материалы и методы. Объектами исследования служили гри5 бы рода Gllpcladium, Fusarium, Mortlerella, Cladosporium, Vertlclllium, Penlcillium, Trichocladium, Scopulariopsls, Paeclllomyces и др,, выделенные по общепринятой методике из клубней картофеля из разных обла0 стей Советского Союза. Всего проанализировано свыше 200 штаммов грибов.

Штаммы предполагаемых антагонистов выращивали на картофельно-глюкозно-ага- ровой среде в течении 20 суток в чашках

5 Петри, затем из образовавшегося газона вырезали блоки 0,5 см в диаметре.

Тест-объект F.sambucinum культивировали на картофель-глюкозном агаре в течение 14 суток. Из выросших культур готовили

0 посевную суспензию с титром 1х106 макро- нидий в 1 мл. 0,1 мл суспензии F,sambucinum высевали газоном на поверхность застывшего картофельно-глюкозного агара .в чашках Петри. В центре засеянных

5 тесг-объектом чашек Петри располагали блок с предполагаемым антагонистом. Чашки Петри оставляли при комнатной температуре 22-25°С. Учет результатов опыта проводили на 6-е сутки.

0Среди исследованных штаммов нами

отобраны изоляты, дающие зону задержки роста тест-культуры рабиусом не менее 10 мм (табл.1). Высокой антагонистической активностью по отношению к возбу5 дителю фузариоза F.sambucinum обладали грибы рода Glicladium и Paecillomyces, причем в отдельных случаях наблюдалось нарастание колонии антагониста на колонию тест-культуры.

0Наибольшей антагонистической активностью по отношению к F.samcinum обладает штамм Gliocladium catenulatum Gilmann et Abbott. Д-43.

Пример 2. Для анализа изменения

5 репродуктивной активности F.sambucinum под действием грибов-антагонистов проводили учет количества конидий тест-культуры в зоне ингибиции и в контроле (культура F.sambucinum без антагониста) при помощи камеры Горяева.

Данные приведены в табл.2.

Наибольшее снижение репродуктивной способности F.sambuclnum наблюдалось под действием гриба Gllocladlum catenulatum Д-43.

Пример 3. Микопаразитные свойства Gllocladium catenulatum Д-43 по отношению к возбудителям клубневых гнилей картофеля.

Для изучения микофйльных свойств предметные стекла, покрытые тонким слоем картофельно-глкжозного агара, инокулиро- вали одновременно (противоположные стороны) ми.копаразитом и тест-грибом. Совместные культуры ин.чубировали в сте- рильных чашках Петри на влажных фильтрах при температуре 25°С. В качестве тест-культур были взяты: Fusarium sambucinum, Geotrichum candidum, Verticilllum lateritlum. Через 5-7 дней пре- параты окрашивали метиленовой синькой, микроскопировали и проводили исследования с помощью светового микроскопа Leitz. Установлено, что под воздействием Gliocladium catenulatum Д-43 происходит разрушение конидий F.sambucinum, наблюдались случаи обвивания гифой ммкопара- зита гиф Verticillium lateritium и F.sambucinum, их параллельный рост, при этом происходят изменения в цитоплазме гиф тест-культур, их вакуолизация, сужение, разрыв. При помощи сканирующего микроскопа обнаружены контактные органы этого микопаразита, представленные длинными, тонкими ветвями, обвивающие гифу хозяи- на (тест-культуру), а также специализированные органы - конические апрессории, внедряющиеся в гифу хозяина, разрушая локально его оболочку.

Пример 4. Использование штамма Gliocladium catenulatum. Д-43 при получении препарата.

Для размножения штамм культивировали в пробирках на картофельно-глюкозном или сусловом агаре в течение 2-3 недель при температуре 25°С. Препарат используют в виде суспензии спор. Для этого в пробирку с культурой гриба добавляют стерильную воду до верхнего уровня среды и встряхивают до образования суспензии. Подсчет конидий в полученной суспензии проводят в счетной камере Горяева. после чего доводят концентрацию до 10б конидий в Т мл воды. Титр биопрепарата 6,5х106 конидий в 1 мл.

При хранении штамма в холодильнике при температуре 5-ТО°С в пробирках на картофельно-глюкозном агаре пересев требуется раз в год. Приготовленный биопрепарат (суспензия штамма) используется в

течении 24 часои. Норма расхода 10 мл нэ 1 кг картофеля.

Пример 5. Использование препарата (штамма) Gliocladium catenulatum Д-43 при проверке его антагонистической активности по отношению к Fusarium sambucinum 34 (табл.3).

Исследования проводили путем искусственного заражения клубней картофеля суспензией конидий грибов F.sambucinum и предполагаемых антагонистов грибов рода Gliocladium. Инфицировали картофель суспензией конидий в соотношении 1:1. Титр суспензии 1x10 конидий в 1 мл.

ГГромытые. обработанные спиртом и обожженные над спиртовкой клубни повреждали штампом на глубину 10 мм в пу- повинной части.

В полученные углубления пипеткЬй вводили до полного наполнения приготовленную суспензию. Для каждого образца брали по 10 клубней. В контрольные образцы с механическими повреждениями вводили стерильную воду совместно с суспензией гриба F.sambucinum в соотношении 1:1. Клубни укладывали в выстланные фильтровальной бумагой эксикаторы, нижняя часть которых заполнялась стерильной водой. Эксикаторы накрывали крышками и помещали в термостат или помещение с температурой 23-25°С и в холодильные камеры с температурой 5°С.

Учет загнивания клубней проводили через 10 дней после их продольного разреза через точку механического повреждения. Измеряли диаметр и глубину загнивания, с последующим вычислением площади некроза.

Двухфакторный дисперсионный анализ данных по площади некроза картофеля при заражении возбудителем фузариоза совместно с грибами рода Fusarium позволяют говорить о достоверности различий и о более высокой антагонистической активности G.catenulatum Д-43. Препарат (штамм) G.catenulatum снижает развитие болезни как при высоких температурах, так и при низких (5°С).

Пример 6. Использование штамма Gliocladium eatenulatum Д-43 для подавления развития сухой фузариозной гнили клубней картофеля по сравнению с Bacillus mycoides (прототип).

В табл.4 приведены данные по развитию патологического процесса в клубнях, инфицированных F,sambucinum, при внесении в гриб-суспензию бактерии Bacillus mycoides 683 (прототип) и предлагаемого штамма Gliocladium catenulatum Д-43.

Из результатов опыта следует, что использованием штамма G.catenulatum Д-43 ведет к более значительному снижению развития болезни на 81,3%, при применении Bacillus mycoides эта величина составляет 51,4%. .

Пример 7. Антагонистическая активность Gliocladlum catenulatum Д-43 по отношению к грибам возбудителям клубневых гнилей картофеля по сравнению с Bacillus mycoides 133 (прототип),

Методика проведения опыта описана выше. Повторность опыта 6-кратная,

Из данных табл.5 видно, что предлагаемый штамм Gliocladium catenulatum Д-43 обладает большим антагонистическим эф0

5

фектом по отношению к фитопатогенным грибам картофеля, а также более широким спектром действия по сравнению с Bacillus mycoides 133.

Таким образом, использование штамма Gliocladlum catenulatum Д-43, обладающего антагонистическим и микопаразитным действием в отношении фитопатогенных грибов, позволяет расширить арсенал биологических средств борьбы с возбудителями клубневых гнилей картофеля. Ф о р м у л а и з о б р е т е н и я Штамм гриба Gliocladlum catenulatum Gilmann et Abbott ВНИИСХМ-ВИЗР Д-43 для получения препарата против грибных возбудителей картофеля.

Антагонистическая активность грибов рода Gliocladlum и Paecillomyces по отношению к возбудителю фузариоза картофеля Fusarium sambucinum Fuck. № 34 In vitro

Таблица 1

ТаблицаЗ

Влияние грибоб рода Gliocladium на развитие болезни клубней картофеля сорта Огонек при разных температурах, инфицированных возбудителем фузариоза F.sambucinum 34

Таблица 2

Таблица 4

Таблица 5