Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии, защите растений и может быть использовано для борьбы с фитопатогенными микроорганизмами, поражающими картофель.
Известен ряд штаммов бактерий рода Bacillus, являющихся антагонистами различных возбудителей болезней сельскохозяйственных культур. Штамм Bactllus thuringtensis ИПМ-216 обладает фунгицид- ным действием в отношении фитопатоген- ных грибов. Штамм Bacillus subtllis B-116 оказывает антагонистическое действие на грибы Pythium и Rhysoctonia. Штаммы Bacillus mesentherlcus 1701 и Bacillus polymyxa - обладают антагонистическим действием на возбудителей корневой гнили пшеницы. Штамм Bacillus subtilis подавляет возбудителей белой гнили подсолнечника. Однако эти штаммы оказывают ограниченное действие, направленное на отдельных грибных возбудителей болезней различных сельскохозяйственных культур.
Наиболее близким к предлагаемому штамму является штамм бактерий Bacillus cereus - антагонистический микроорганизм против грибов Culvularla pallescens, Macrophomlna phaseoll, Colletotrichum gloesporides.
Недостатком известного штамма является его узкий спектр действия только на указанные грибы, поражающие кукурузу и маниок, и неспособность воздействовать на другие фитопатогенные грибы и бактерии, в частности на патогенную микрофлору картофеля.
Целью изобретения является получение нового штамма бактерий, обладающего бо.а
со
лее широким спектром ймтагонистичес.ой активности на возбудителей болезней картофеля,
Это достигается с помощью штамма Bacillus mycoides 683 (син. Bacillus cereus var. mycoides (Fiugge) Smilfi.). Штамм получен в 1984 году в лаборатории низших растений ИЭБ им. В.Ф. Купревичэ АН БССР путем выделения в куль гуру из клубня картофеля с симптомами бактериальной гнили. Штамм депонирован в коллекции культур микроорганизмов ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии под регистрационным номером 133 а группе споровых микроорганизмов 2/П-1990 г.
Культурально-адорфологические признаки,
Клетки грэмположительные, прямые неподвижные палочка 5-10 х 0,8-1,2 мкм; образует споры. гультивировании при 28°С в течение 3 суток характеризуется следующим ростом:
на мясопепк 1- лом агаре (МПА) рост обильный; колонии разрастаются слоем по поверхности субстрата, имеют характерное мицелиальное строение, серовато-белые, матовые, складчатые с волнистыми краями; на глюкозосолевой среде М/9 (состав среды указан на с. 4 описания) колонии сухие, серо-белые, матовые, в центре морщинистые, к краям плоские, неровные;
на сред Фриза рост слабый, колонии тонкие, плоские, белые, матовые, стелющиеся с ровной бугрисгоеатой поверхностью и почти ровными краями,
На жидкой среде (мясо-пептонный бульон МПБ) рост в виде хлопьеаидной пленки на поверхности среды, выпадающей в осадок на 6-7 сутки, Среда остается прозрачной.
На ломтиках картофеля дает рост, Колонии складчатой формы имеют кремовую окраску.
Физиолого-биохимические признаки, Хорошо усваивает углеводы: глюкозу, сахарозу, мальтозу, лактозу, маннит, ксилозу с выделением кислоты. Из галактозы кислоту не образует.
Потребляет неорганический азот а форме нитратов (NflNOs, КМОз,) и аммонийный (NH4CI). Развивается в присутствии органических источников азотз: пептона, дрожжевого экстракта. Разлагает белок с образованием аммиака.
Гмдролизует крахмал, нитраты восстанавливает до нитритов, индол не образует, желатину разжижает, молоко не свертывает.
Образует чзталэзу. Аэроб Оптималь ный рост при температуре 28°С Реакция Фогес-Проскауера положительная.
Штамм хранится на эгаризованной ереде (минеральной или картофельной) в холодильнике с периодическими пересевами. Безвредность (токсигеккссть) Исследования по определению токси- генности проводились на беспородных бе0 лых мышах при пероральном и внутрибрюшинном введении. На кажд й опыт при различных путях введения бы о взято по 10 животных. Для получения суспензии бактерии выращивали на косяках с
5 картофельным агаром в точени„ . уток при температуре 28°С, после чего смывали стерильной дистиллированной водой. Количество бактерий в суспензии определяли по оптическому стандарту мутности.
0 Культураль Ый фильтра; получали путем центрифугирования при б тыс об /мин в течение 20 мин культуоы бактерий, выращенной на жидкой среде Чапека в течение 48 час при темперслуре 28°С,
5 Для определения вирулентности бактерий животным вводили суспензию с титром от 1 Ю5 до 1 109 микробных тел/мл в количестве 0,5 мл внутрибрюшинно и 1,0 мл перорально, ЛДбо рассчитать не удалось из0 за отсутствия г/бели животных.
Определение токсигенности исследуемого штаммэ бактерий проводили путем введения стерильного культурального фильтрата белым мышам внутрибрюшинно в ко5 личестве 0,5 мл и 1,0 мл перорально. Изменения поведения и физиологического состояния животных не отмечено.
При проведении испытаний предлагаемого штамма бактерий случаев заболевания
0 людей или животных не было установлено. Штамм Bacillus mycoides 683 не патогенен для теплокровных организмов.
Исследования вирулентности л пато- генности для картофеля проводили на сор5 тах Белорусский ранний. Огонек и Темп путем искусственного заражения клубней. Для этого промытые, обработанные спиртом и обожженные целые клубни картофеля механически повреждались штампом на
0 глубину 10 в пуповинной части, В полученные углубления пипеткой вводили 0,3 мл бактериальной суспензии 1-2-х суточной культуры в концентрации 10 млн бактериальных клеток в 1 мл стерильной дистилиро5 ванной воды. Для каждого образца берется 10 клубней. В контрольный образец с механическим повреждением вводится стерильная вода. Клубни укладывают во влажные камеры и выдерживают при температуое 28°С в течение 8-Ю дней, после чего проводят учет индекса поражения. Проведенные испытания показали полную авирулент- ность штамма Bacillus mycoldes 683 для всех исследуемых сортов картофеля.
Пример 1. Выявление бактериальных штаммов, обладающих антагонистическими свойствами проводили методом отсроченного антагонизма на глюкозо-солевой среде М-9. Состав среды: 30 мл солевого концентрата (N32HP04 - 6,0; КН2Р04 - 3,0; NaCI - 0,5; NH4C1 - 1,0 г/л Н20); 6 мл 20% р-ра глюкозы; 3 мл 0,01 К p-pa CaCIz; 3 мл 0,1 М р-ра МдЗОз; 30 мл 5% р-рг дрожжевого экстракта; 300 мл 2% р-ра агара.
Испытуемые на антагонизм бактерии засевают пятнами Д 0,3-0,5 см на застывшую среду в чашки Петри. Инкубируют 48 час., после чего культуры убивают парами хлороформа (30 мин). Чашки проветривают в течение часа и засевают тест-культурой Чашки помещают в термостат на 24 часа, если тест-культура - бактерия, и на 72 часа для грибов, после чего выявляют наличие антагонистических штаммов, вызывающих вокруг своих колоний зоны антагонизма тест-культу р.
Всего исследовано более 200 штаммов различных бактерий, выделенных из стеблей и клубней картофеля. Отобрано 5 штаммов рода Bacillus, обладающих антагонистическими свойствами в различной степени {табл. 1).
Из них наиболее антагонистическим эффектом и спектром ингибируемых фитопа- тогенов обладает штамм Bacillus mycoldes 683. Он оказывает антагонистическое воздействие на ряд грибов и бактерий, участвующих в патогенезе клубневых гнилей картофеля, таких как Fusarlum sambucinum, Fusarium avenaceum, F.culmorum, F.solan, Phoma solanlcola, Geotrlchum candldum, Erwinta aroideae, Bacillus mesenterlcus vulgatus, Trichocladium sp., Alternaria sp., Gliocladium sp,, Stemphyllum sp., Pseudomonas xanthoclora, Fusarlum oxysporum.
Наибольший эффект действия отмечен по отношению к грибам рода Fusarium (зона подавления в Д 28-36 мм) - возбудителям сухой фузариозной гнили; Geotrlchum candidum ( мм) - возбудителю резиновой гнили картофеля и бактерии Erwlnia aroideae ( мм) - вызывающей мокрую гниль клубней.
П р и м е р -2. Исследовали на антагонистическую активность культуральную жидкость бактерий, проявивших антагонизм на агаризованной среде. Штаммы бактерий 683, 671, 795, 1019, 851, 863 рода Bacillus культивировали в колбах емкостью 250 мл с
50 мл 1,5% жидкой глкжозо-сопевой среды при Т 28°С в течение 48 часов. 8 качестве посевного материала использовали 2-х суточную культуру штаммов, выращенных в про- 5 бирках на картофельном агаре. Антагонистическое действие культуральной жидкости (КЖ) определяли общепринятым методом бумажных дисков по отношению к одному из самых вредоносных возбудителей 10 клубневых гнилей Fusarium sambucinum. Для этого диски из фильтровальной бумаги мм смачивали в КЖ исследуемых штаммов бактерий и накладывали на засеянную грибом среду в чашках Петри. Чашки инкубиро- 15 вали в течение 72 часов, после чего измеряли зоны антагонизма. Результаты представлены в табл. 2, из которой следует, что наибольшим антагонистическим эффектом отобранных антагонистов обладает штамм Bacillus mycoldes 0 683, который полностью подавлял рост гриба F.sambucinum в чашке.
Пример 3. Использование штамма Bacillus mycoides для подавления сухой и мокрой гнилей картофеля. 5 Изучали антагонистическое воздействие штамма в опытах in vino на клубнях картофеля сортов Белорусский ранний, Темп, Огонек. С этой целью проводили искусственное заражение клубней вышеопи- 0 санным способом (с. 3-4) суспензиями конидий гриба Fusarium sambucinum и бактерий Erwinia aroideae в концентрациях 105 конидий/мл и 10б бактериальных клеток/мл соответственно. В опытных вариантах гриб- 5 ную и бактериальную инфекции смешивали с суспензией штамма-антагониста Bacillus mycoldes в концентрации 107 и 108 бактериальных клеток/мл в соотношении 1:1, в контрольных - со стерильной водой в том же 0 соотношении. Учет площади некроза инфицированных клубней показал ингибирую- щее действие штамма В.mycoides 683 на развитие сухой гнили, вызываемой грибом Fusarium samduclnum (табл. 3) и мокрой бак- 5 териальной гнили, вызываемой Erwlnla aroideae (табл. 4). Так, внесение штамма-антагониста в грибную и бактериальную инфекции приводит к снижению развития патологического процесса в клубнях на 0 40,2-86,4%.
Таким образом, использование штамма Bacillus mycoldes 683 позволяет расширить арсенал биологических средств для борьбы с возбудителями клубневых гнилей картофе- 5 ля.
Формула изобретения Штамм бактерий Bacillus mycoldes ВНИИСХМ Nb 133 для получения препарата против возбудителей заболевания картофеля.
Тай яйца I
Использование: сельскохозяйственная микробиология, получение средств защиты картофеля от болезней. Сущность изобретения: использование штамма Bacillus mycoldes ВНИИСХМ № 137 для получения препарата против возбудителей болезней картофеля. Штамм выделен из белковых клубней картофеля: выращивается на МПА при 28°С. Усваивает глюкозу, сахарозу, мальтозу, лактозу, маннит, ксилозу, использует нитратные, аммонийные формы источников азота. Препарат получают, выращивая штамм на кзртофельно-f люкоз- ной среде при 28°С в течение 48 ч. Концентрацию клеток в суспензии доводят до 107 - 108 на 1 мл. Наибольший эффект отмечен против фузариозной, резиновой и мокрой гнили. Патологический процесс в клубнях при использовании препарата снижается на 40,2-86,4%. 4 табл.
Антагонистическое действие различных штаммов бактерий рода Bacillus на фитопатогенные гриби и бактерии
8г. яние культуральной жидкости различных штаммов бактерий рода Bacillus на рост Fusarium sambuclnurn.
Штамм, вид
863 Bacillus mesenterlcus 795 В,mesenterlcus vulgatus 851B.mesentericus vulgatus 1019 В,mesenterlcus vulgatus 683 Bacilius .nycoldes
Влияние штамма Bacillus mycoides 683 на развитие в клубнях картофеля гриба Fusarium sambuclnum - возбудителя сухой гнили
Таблица 2
Зона угнетения роста гриба, Д мм 16,5 ±1,5 18,0 ±2,0 7,0 ±1,0 6,5 ±1,0
-Ј5ЈLC6M AQI yjЈJ-§y-gI QPJLIP-SI -.
Таблица 3
Влияние штамма Bacillus mycoides 683 на развитие в клубнях картофеля сорта Темп возбудителя мокрой гнили aroideae
Таблица А
| J.Basic | |||
| Mlcroblol, 1987, 27, № 9 | |||
| p | |||
| Открытка или конверт | 1925 |
|
SU515A1 |
