Способ получения аттенуированного штамма вируса Советский патент 1979 года по МПК C12N7/00 A61K39/265 C12R1/91 

аборта, но период осеменения кобыл и энзоотическая картина у молодых лслиадей имеют значительное влияние на сезонное число заболеваний и возраст зародыша во время аборта, Период инкубации между носовой инокуляцией и абортом составляет от трех недель до четырех месяцев, что указывает на то, что инфекция, которая приводит к аборту, совпадает с более ранним энзоотическим заражением молодых лошадей на фермах Вирус легко распространяется при непосредственном контакте через различные посторонние предметы и через аэролизованные выделения. Вирус может передаваться от одной , у которой был аборт, к другой кобыле, но в большинстве эпидемий (как показывают данные) до полного аборта в течение 1-4 месяцев заражаются почти все кобылы.

Болезнь случается ежегодно у молодых лошадей на многих фе;рмах, на которых не было новых лошадей, что позволяет сделать предположени о наличии переносчиков среди взросл4х лошсщей. Регулярность вспышек при сборе восприимчивых молодых лошадей также свидетельствует о наличии носителя. Вспышки часто происходят тогда, когда восприим|чивые лошади собираются для продажи во дворах, на тренировочных площадках,, скачках и в военных организациях.

Инкубационный период ERP длится от 2 до 10 суток. Первичная инфекция полностью восприимчивых лошадей проявляется в виде лихорадки и сильного вы,целения из ноздрей. Температура может составить 41°С и лихорадка в несложных случаях продолжа ется от 1 до 7 суток. Температура после полудня, как правило, выше, чем утром. Агранулоцитоз происходит параллельно с лихорадко В течение первых двух суток лихорадки нейтрофилы и лейкоциты угнеТ аются. Лимфоциты возвращаются к нормально 1у уровню через 2-4 суток а нейтрофилы - через 5-9 суток. Потребление кормов и воды падает. Наблюдается средняя гиперемия носовой слизистой оболочки и прощупывается Ьтек нижнечелюстных лимфатических узлов. В несложных случаях части наблюдаются энтерит и диарея отекног и тендовагинит, Общая депрессия у лошадей, которые содержатся в покое, незначительная. Все признаки обостряются при выполнении упражнений или при pa6ote Полное выздоровление наступает через недели, если не развиваются осложнения.

Повторное заражение происходит через 4-5 месяцев и более. Это

последующее заражение, как npasvi ло, бессимптомно, безлихорадочно и не дает осложнений, в частности, у взрослых лошсщей на плег енных фермах. Влияние повторного заражес ния на лошадей, участвующих в скачках или занятых на тяжелой работе, неизвестно.

Известен способ получения аттенуированного штамма вируса Eq,uine g phinopneumonitis при проведении 3-10 пассажей в культуре клеток печени мартышки, а затем в первичных культурах клеток, полученных от овец, свиней, поросят и в перевиваемых линиях клеток, выделенных из первичных культур клеток 1.

Недостатком известного способа является потеря иммуногенности вирусом. .

Целью изобретения является сохранение иммуногенной активности вируса.

Это достигается тем, что вирус культивируют в перевиваемой линии клеток Веро (печень зеленой мартышки) в течение 30-60 пассажей при 23-33°С.

Модификация или ослабление морфологии или патогенности вируса осуществляется многочисленными способами. Иногда неоднократный серийных перенос в ткань хозяина ослабляет организм, серийный перенос в ткань, которая отличается от ткани хозяина, иногда приводит к ослаблению; 5 химический шок организма, облучение, низкотемпературный перенос и другиеспособы широко используют-я бактериологами и вирусологами сщя получения патогенно инертных Q организмов, который сохраняет свою способность заставлять своего хозяина образовывать антитела или клеточный промежуточный иммунитет, способный эффективно нейтрализовать болезнетворный организм. Ослабление без потери имму ногенности живого организма совершенно непредсказуемо и действенность любого способа определяется только опьатным путем.

Например, способ, пригодный для одного типа вируса, может оказаться непригодным для другого типа.

В известном способе ослабления вирулентного штамма ERP производится путем выравдивания и размножения ри5 нопневмонических вирусов, выделенных из плода зараженных лошадей, зараженных жеребят и выкидьией вг чувствительной ткани, полученной из чувствительных органов (например, 0 печень мартышки), восприимчивых опытных животных и восприимчивых перевиваемых линий клеток, пригодных для выращивания и размножения указанных вирусов, при этом размно5 жение включает от трех до десяти

переносов, полное ослабление вирусов до тех пор, пока они не потеряют патогенность для лошади путем серийного переноса через первичные культуры клеток, полученных от овец, свиней и поро.сят и из постоянных стабильных линий клеток, -выделенных из первичных культур клеток. Предполагается, что иммуногенная защита от повторного заражения вирулентным вирусом Е(Р не происходит, если авирулентный вирус не воспроизведет себя в животном-хозяине, Авирулентный вирус может быть извлечен и опознан после вакцинации.

Установлено, что если стабильную линию клеток из Африканской зеленой мартышки Cenocopithecus aethiops, линия клеток Веро, инокулировать вирулентным вирусом КРВ и серийно переносить в такой линии клеток при пониженной температуре, например 23-33°С, вирус становится ослабленным и невирулентным, но в то же время остается иммуногенным, т.е. при введении в лошадь-хозяина он приведет в действие свой иммунологический механизм для производства вирусных антител и получения клеточного промежуточного иммунитета. После этого животное становится стойким к последующей инфекции и из вакцинированного животного может быть получен вирулентный вирус, который опознается.

При использовании обычных методов серийного переноса, которые являются стандартными в данной области, было установлено, что необходимый авирулентный характер развивается без потери иммуногенности после примерно 30-60 переносен при температуре в диапазоне примерно 23 - 33°С. Однако может быть использовано примерно 250 - 300 переносов и более.

Вакцина KRP может назначаться юбому виду из семьи либо внепарентерально, либо внутрипарентерально. Вакцина в жидком виде может вводиться в ноздри, внутриглазно, внутримышечно, внутривенно, внутрибрюинно и т.д. В виде сухого порошка вакцина может назначаться внепарентерально. Как правило, вакцины такого типа в количестве 3000 - 100000 единиц TClOgp назначаются в одной дозе.

Воспроизведение вируса. Тканевые культуры клеток готовят использованием стабильной линии леток Веро, полученной из Африканкой зеленой мартышки при количестве ереносов 129. Стандартный стекляный сосуд для культуры засеивают рипсинизированной суспензией клеок Веро, содержащей-достаточное

количество среды для закрытия клеток на глубину 13 iVM, Используется среда Eo.gCes .п Es., (Aedium (, которая содержит 10% сыворотку эмбрионального теленка лля

питательной среды (5 %

Б под.дерниЕсИощей среде) . Однако может быть использована любая питательная среда, например, Лактальбумяная гндролизатная среда в сбалансированном соляном растворе ланкса Среда 199 и т.д. Сосуды с культ рой инкубируют при 37°С в течение суток, после чего образуется монослой клеток Веро.

Затем сосуд заражают Herpes I, (культура А183, полученная из калифорнийского университета) с использованкег-- стандартных асептических способов и после 24-72 час инкубации при 37°С цитопатология клеток показывает, что вирус воспроизвел себя. Число переносов вируса в клеткк Веро при 37°С составляет 13 раз, как и ранее. Затем вирус подвергается ослаблению. Ослабление.

Используя стандартные колбы с культурой клеток ткани н питательной средой, указанной выше, готовят монослой клеток Веро. Примерно 100 TClOso/ Л вируса .13-го переноса взо.дят в колбн и инокулированные колбы инкубнр тот при 26°С. Через 8-10 суток отмечают небольшие зоны перерождения клеток, и второй серийный перенос делают с некоторым количеством жидкой среды.. Инкубация при 26° продолжается и клеточная цитопатология увеличивается. После каждого серийного переноса цитопатология возрастает и после npHMep io 30-60 серийных переносов устанавливают, что цитопатология завершается через 3-5 суток инкубации при 26°С. Этот ослабленный вирус обозначен как вакцина A2S3 У26 Р50 ERP.

Последующие эксперименты в opiaнизме проводят с 50-ым или 55-ым :переносом холодного адаптированного вируса. Все количество вируса вакцины ERP вводят глубоко внутpи 1ышeчнo.

Заражение вирулентным ERP производят путем серийного переноса неослабленного вируса А183 в носовые выделения и во всю кровь через четырех лошадей. Перенесенный конский вирус вызывает классические симптомы ринопневмонии, а также аборты беременных животных. Пул, зараженный вирусами ERP, используется неоднократно для заражения экспериментальных лошадей с отличньоми результатами и неиммунных животных. Все вирусы вводят в ноздри.

Для определения всех серологических реакций на вакцину ERP

.или заражение вирусом используют серологическую реакцую нейтрали зации.

Чистота вируса вакцины ЕКр, полученного указанным способом, определяется путем нейтрализации цитопатогенного действия, получаемохо в культуре ткани с помощью известной сы-воротки типа Eq,uine Негре I.

Вирус вакцины дает большое количество синцития в клетках ик-т и клетках Веро при 37°С. Синцитий, мо Лет быть использован в. качестве маркера для вируса вакцины, так как вирулентный вирус ЕРР производит индиЭидуальное цитопатологическое действие округляющего типа на клетку в указанной линии клеток при 37°С.

Вирус вакцины убивает новорожденных хомяков и вирус выделяется из метровых хомяков для получения маркера того же типа для синцития. KJ-IHническйе cимптo IЫ конских вирусных болезней не наблюдаются в вакцинированных лошадях или жеребятах в различных- возрастных группах,

Вирус вакцины может быть выделен из конских периферийных лейкоцитоз через 2-11 суток после вакциналии ERP. Другие вирусные агенты не выделяются после вакцинации, за иск.шочением местной группы Иегрез( 11 вирусов) „ Кроме зтого, вирус вакцин1:а, Полученной из лошадей, содержит вакцинный маркер (синцитий).

Экспериментальный вирус вакцины А183 У2б Р50 проверялся на следующи вирусные агенты с помощью известных способов и ни один из агентов не Зыл обнаружен Eq,bivie infections /Kneniia virus Eq,uine Herpes н virus, aderno -irus,

tciuine EucephaEomyeEit-ta virus,Eouirie- 1

-nnftuenza CK ltq,ui M, AlEq.uil 2|.

ПриготоЁление вакцины. Ослабленный вирус, приготовленный описанным выше способом, выращивают в больших количествах с использованием той же питательной среды, которую применяют в стандартных колбах для получения монослоя клеток Веро. Колбы инкубируют до завершения цитопатологии, как правило в течение 3-4 суток. Затем питательную среду собирают и перемешивают со стабилизирующим раствором и раздляют на дозы примерно 1000-10000000 единиц ТС10 в обычные ампулы для вакцийы. Затем материал подвергался замораживанию, высушиванию в ампулах и запечатывался.

Пример 1« Проверка сохранности вакцины ERP и передачи вируса вакцины контактным лошадям. Кроме этого, проверяют действие вакцин в организме, по сравнению с неослабленным вирусом.

Группу из шести разных племенных лошадей обоих полов содержат в групповс л загоне. В пищу добавляют травяное сено и ячмень, устанавливают автопоилки. Группа получает ослабленную вакцину ЕРР, которую вводят всем глубоко внутримышечно. После первой через 28 дней делают аналогичную вакцинацию. Через 56 дней после первой вакцинации все лошади были заражены вирулентным вирусом S(. Определяют следующие параметры: всех лошадей ежедневно проверяют, на клинические признаки ERP, измеряют температуру и проверяют серологическую реакцию. Три лошади ВЕЛбиршот для выделения вируса из 1 носовых тампонов, и клеток кожи. .Выделение вируса началось на двух контактных точках в момент заражения. Полный подсчет кровяных телец проводят на лошадях, предназначенных для выделения вируса (см.табл.1i).

Выделение вирусов и идентификаци осуществляют на лошадях, у которых наблюдались выделения из носовых раковин Принципалам присваивают номера; 104, 77, 52, 53 и 54, а контактному контрольному экземпляру - номер 79. Результаты экспериментов приведены в табл.2,

Данные таблиц С1;идетельствуют о ЮМ, что

вакцина не вызывает симптомов болезни после любой в-акцинации;

вирус вакцины не. передается контактным котрольным животным в течение более 56 суток пребывания вместе перед зараж€ нием. Во время эксперимента производят многочисленные выделения вируса 11 Ео.. Herpes

Хотя контроль (К79) дает нормальные клинические сигчптог-Ы конской ринопневмонии, т.е. воспаление дыхательных органов, отсутствие аппетита и недомогание, повышение температуры на несколько градусов выше нормальной в течение двух дней после зарадсения вирулентным вирусом и сильное понижение счета белых кровяных телец, вакцинированные принципапы были защищены от вирулентрюго вируса-; отсутствие симптомов, нормальная температура тела и нормальный счет белых кровяных телец.

Пример 2. Определение сохранности ослабленной вакцины ERP у жеребых кобыл (отсутствие клинических симптомов или абортов), а также определение действенности вакцины у беременных лшвотных против вирулентного вируса ERP с целью получния информации по пассивному антителу ERP, переданному жеребятам, безопасности вакцины на различных стадиях беременности к определение пердачи вируса вакцины контактным коптрольным животным, которыми были невакцинированные беременные животные Опыт проводят на жеребых кобылах че.тырех групп (см. табл.З). Жеребых был пятой группы используют в ка- честве контрольной. Две группы вак нируют сразу, их. заражают в нос ви рулентным вирусом ERP спустя 40 дней. Одна из этих групп получает холодный адаптированный вирус вакцины 50-го переноса. Оставшиеся две группы жеребых кобыл вакцинируют дважды через промежуток в 20 дней указанным выше образом холод.ным адаптированным вирусом того же уровня переноса. Две последние группы заражают в нос через ъи дней после первой вакцинации. Исследуют следующие параметры: температуру, выделение вируса и идентификацию, цитопатогенное воздействие, титры нейтрализации сыворотки и клинические симптомы. Эти параметры определяли у кобыл и жеребят. Жеребят исследуют на ви рус из лейкоцитов крови и носовых раковин непосредственно сразу после обнаружения и через два или три дня после рождения. Кроме этого, собирают сыворотку в момент в лжере ки новорожденного жеребенка и чере неделю после этого. В некоторых сл чаях на молочную железу надевают чехлы из холста для предотвращения подсоса после родов для получения нескольких образцов предмолозивной сыворотки. Молозиво ЕРР, нейтрализующее антитело, замеряют у некото рых кобыл. Парные образцы сыворотки собирают у некоторых жеребчиков и кобыл в момент рождения и после. Пример 3, Получение данных о сохранности вакцины в жеребятах (определяется по томам и исследованиям клинической патологии), Опреде ление времени вакцинации жеребцов п наличии материнского антитела: выделению типа вируса у двухнедельног вакцинатного жеребенка и действенность пассивного антитела ERP (табл По группам 1-4 определяют следующие параметры: температуру тела, цитопа тогенное действие, выделение вируса из носовых раковин и лейкоцитов кро нейтрализующие серологии E.R и ежедневное наблюдение за клиническими признаками болезни; Группа 1, Реакция жеребчика на вакцинацию ERP. Эта группа из восьми жеребчиков получена от кобыл хорошо продокументированной родословной относительно их статуса ERP. Вакцину вводят жеребцс1м внутримышечно в количестве одной сублимированной 1 мл дозы вакцины Al83-y26-EUP содержаще 8 логов вируса/2 мЛ, который восстанавливает 2 мл стерильной вод перед использованием. Группа 2. Реакция жеребчика на вакцинацию ERP Жеребчик № Ь без матери. История матери по Енр неизвестна. Жеребчик № 74 от зараокенной контрольной кобылы, которая родила жеребенка через пять дней после заражения рулентным вирусом ЕРР, через носовую раковину. Этот вирус вьаделен у кобЕллы, однако у жеребенка ,после родов ввделен не был. Следо-вательно, увеличение не наблюдается в молозивном антителе ERP за короткий период времени до рождения после заражения. Группа 3. Жеребчики, зараженные вирулентным вирусом ERP. Эта группа состоит из четырех жеребцов, которых заражают через носовые раковины с помощью катетера с 10 мл вируса, содержащего логов вируса/2 мл. История кобылы ЕРР хорошо документирована, Группа 4. Состоит из двух жеребчиков от матерей с неизвестными историями по ERP. Жеребчиков заражают аналогичным образом, так же как и в группе 3. Ни один из вакцинированных жеребцов не показал серьезных клинических симптомов. Иногда выделялись . бактерии Streptococcus zooepidetti-icus из носовых каналов во время нечастых выделений из 1осовых раковин, которые не имели отношения к ERP. Ни один из четырех зараженных жеребцов (группа 3), содержащих молозивное антитело ERP, не был болен или подавлен, как зараженные жеребцы, у которых не хватало молозивного антитела ERP.. Таким образом, нормальная температура Т€гла жеребцсгв выше чем у взрослых. Кроме этого, стресс от воздействия окружающей среды, например, тренировка жеребцов или лежание на солнце, по-видимому, оказывают большее влияние на колебания температуры. Тенденция к лейкопении чаще проявляется у вакцинированных жеребцов в период между 3-7 днями. Лейкопения проявляется сильнее у зараженных контрольных жеребцов. После заражения сильная лихорадочная реакция наблюдается у зарал енных жеребцов без пассивного антитела в период между 2-6 днями. Очевидно,нет постоянного повы1иения температуры после вакцины ERP или зарал ения ERP высокими уровнями пассивных антител ETIP. Один х еребец 155, показавший самое низкое нейтрализующее антитело ERP, имеет такое же повышение температуры, как и контрольные заргикенные жеребчики, однако, не была замечена депрессия или анорексия. Из полученных экспериментальных данных можно сделать следующие выоды.

Приспособленный к холоду (26°С) вирус клетки Веро воспроизводитсяв организме при внутримышечном введении, образуя защитный иммунитет от вирулентного -вируса ERP, введенного Б носовую раковину.

Вирус вакцины не является патогенным при введении жеребым и жеребятам из различных иммунологических сред ERP.

Вирус вакцины может быть выделен из лошадей, которые до этого были подвержены ERP (измерение проводилось с помощью нейтрализующего антитела ERP) или от животных, не имеющих нейтрализующего антитела. Иногда вирус может быть выделен из промытых лейкоцитов крови или редко из носовых раковин.

Вирус вакцины ERP не передается контактным контрольным лошадям при отсутствии сероконверсии контактных контрольных животных или при выделении негативного вируса из контрольных животных,

Нейтрализующие серологии из вакцинированных животных успешно сравнивают с серологиями, вызванными вирулентным вирусом ЕКР, который используется для заражения.

Молозивное антитело ERP с высоким титром пассивно переходившее к жеребцам, по-видимому, защищает (отсутствие симптомов) жеребцов От вирулентного вируса ERP.

Клеточный промежуточный иммунитет, играет важную роль в защите лошадей от абортов ERP и клинических симптомов ERP, однако, до сих пор не представляется возможным измерить клеточный иммунитет ЕЙР это делается только путем заражения,

Число выделений вируса, сделанных после вакцинаций с помощью воспроизведенной вакцины ERJ или воздействия вирулентным вирусом .ERP,. во мноком зависит от типа и степени иммунитета, которым обладает хозяи Ьредпочтительно выделять вирусы из жеребцов с высокими уровнями молозивного нейтрализующего антитела ERP. Читается, что эти жеребцы имеют гуморальный иммунитет, который в зависимости от силы представет улучшенную симптоматологию при заражении вирулентным вирусом. Однко гу 1оральный иммунитет играет неначительную роль в изоляции состояния носителя вируса. В противополоность этому активный иммунитет, вызываемый вирусной инфекцией образует клеточный промежуточный и гуморальный иьадунитет. Отсюда после повторного воздействия воспроизведенным вирусом вакцины или вируленньзм вирусом состояние переносчика вируса практически устраняется. Повидимому, существуют животные, невосприимчивые к ERP, у которых наблюдается такое состояние, и животные, перенесшие до этого ERPjу которых тоже наблюдается такое же состояние по серологиям. Клеточный иммунитет, как гормональный иммунитет, теряется со временем. В настоящее время неизвестны сроки истощения клеточного иммунитета ERP.

Вирус вакцины ERP не переходит плацентальный барьер, судя по негативным нейтрализующим премолозивным образом сыворотки от восьми новорожденных жеребят. Кроме этого, у 18 новорожденных жеребят от вакцинированных и зараженных кобыл не был выделен положительный вирус вакцины bt uirie Hefpg 1 .Мно предположить, что кривые истощения пассивно приобретенного нейтрализующего антитела ERP, полученного от 5 жеребят путем выделения, неуклонно снижаются, не показывая внутриутробного воздействия вируса H6V-pes 1, так как, очевидно, не происходит активная индукция антитела.

Выделения вируса вакцины ЕДР чаще всего делаются из лейкоцитов крови, а не из носовых раковин. Эти данные также относятся к введению вируса вакцины через нос. Хотя только четыре; принципа из четырех дали выделения, все выделения были сделаны из лейкоцитов крови. Многие носовые выделения вируса, полученные во время экспериментов, могут быть получены из незначительных количеств крови, выделенной из капилляров, поврежденных при взятии образцов длинными носовыми тампонами размером 150 мм, когда животные двигались. Образцы некоторых носовых Тс1мпонов были потеряны из-зй. бактерий и загрязнения.

Наблюдаются три явных клинических случая мыта и были выделены Streptococcus zooepifle,mous,5tv-ep ec uiR-imiEi i cTpen-rpynnat.Stapn.oureus и у одного жеребенка был обнаружен51герtocbccus . Эти бактерии периодически выделяли у испытываемых животных. Все бактерии могут давать клинические симптомы лихорадки или

5 вьаделений из носовой раковины или то и другое вместе, поэтому их наличие часто исследуют для определения причины любого клинического отклонения, которое могло повлиять

0 на результаты исследований опытных животных. В больишнстве случаев бактериальные вспышки были довольно ясны, когда температура лошади и общие карты лейкоцитов просматривались. Stre-ptococcus z.ooe-pidemicus является частным сопутствующим агентом вируса Eq, Rtvinopneumonitra присутствие которого не вызывает удивления, если принять о внимание повсеместный характер этой популяции. Следовательно любой серьезный стресс лошади может обусловить вспышку Strep, zooepidemicus Изобретение относится к вакцик,э и к способу ее приготовления. Емрулентный изобят А183 вируса Et Uine 1 Heirpes вводится в монослой постоянной линии клеток Веро, Проверка сохранности вакцины ERP и контактным лошад который инкубируется в течение 3-5 дней при и цитопатология клеток завершается, СвежеприготовленнЬгй стабильный клеточный монослой клеток Веро инокулируетсяс частью приготовленного собранного вируса. Культура вновь инкубируется для получения цитопатологии по меньшей мере части клеток ткани. После этого часть полученного вируса серийно переносится по меньшей мере 30 раз при инкубационной температуре И получается иммуногенно активный авирулентный вирус, Табл-ииа 1 ачи вируса вакцины

Примечание. Ни одна из подопытных признаков ERP. лошгщей не имела клинических

I I

I I I I

t:

I I

I I

+гН

W «

Ш

«

о

СЛ

Г-- «

Д

H

a

X

о

« о

Ю

о и о

я

(в

.

W

« .

Ю re

JC

о «

(tf я го

к

Ш

tJ

ПЗ

а: m о

ID

о

и .

D, S

т

« Я я я

Ш

f

rfl

я т

О

с о

S

tt) з:

X Ю

у ф S

EH

. a

к а

G

Ol

г W -,.. . Результаты исследований по выделению Таблица4 вируса у новорожденных жеребят