Способ определения гонадотропной активности гипофизов рыб Советский патент 1981 года по МПК A01K61/00 

1

Изобретейие относится к рыборазведению, в частности к способам определения гонсщотропной активности гипофизов рыб.

Известен способ определения гонадотропной активности гипофизов рыб, заключающийся в обработке культуры тканей ооцитов рыб в питательной среде стандартным и определ 1е Фам растворами гормонов с последующей инкубацией при температуре 18-20 С и определением количества созревших. ооцитов {1.

. Недостатки известного способа : заключаются в небольшой точности из-за разной индивидуальной л .сезонной чувствительности самок вьюна ;К гонадотропным гормонам, необходимости использования большого числа (рыб и проведения при каждом тестировании сравнения с действием стандартного препарата, действенности способа только при условии высокой чувствительности самок к гонадотропинам (необходимость созревания более 50% животных при введении гормона) .

Цель изобретения - повышение т-очности.

2

Цель достигается тем, что согласно способу, заключающемуся в обработке культуры тканей ооцитов рыб а пительноЯ среде стандартным и определяе1«лм растворами гормонов с последующей инкубацией при температуре 18-2О С и определением количества созрешиих ооцитов,.обработке подвергают культуру тканей ооцитов

to самок с низкой чувствительностью к гонадотропным гормонам, иикубгшию проводят до появления 2-3% соэрейших ootuiTOB, гонадотропную актив,ность гормонов рыб определяют по 15 формуле ствнлорт/ стандйрт.

/1 |М|ЧАП& .

иссле :

ИОСЛвА

где КусслеА- концентрация исследуемого препарата, вызывающая максимальный

20 процент созревания в ряду возрастакхоих шщ убывакжких концентраций/. танАе«(т концентрация стандарт25ного препарата, вызывающая максш альный процент созре.вания, ооцитов в ряду возрас.тающих или убывающих концентраций; стандарт. гонадотропная активность стандартного пре парата. Фрагменты яичника рыб по 150200 ооцитов инкубируют в течение 48-53 ч при, i8-2Q C на питательной среде 199 на растворе Хенкса с добавлением 12-16 различных концентраций исследуемого и стандарт,ного препарата с известной гонадот|ропной активностью, вызывающих созревание не менее 2-3% ооцитов. Проводят подсчет созревших и несозревших ооцитов для каждой концентрации гормонов и устанавливают концентрации исследуемого и стандартного препаратов, вызывающие максимальный про цент созревания ооцитов в ряду после довательно убывающих или возрастающих концентраций. Гонадотропную активность исследуемого препарата опре деляют по формуле . с-т«ИАаРт. етанА.аРТ. послеАгде ,- концентрация исследуемо го препарата, вызывающая максимальный проце созревания в ряду возр тающих или убывающих концентраций; Кстомдарт: концентрация стандартн го препарата, вызывающая максимальный проце созревания ооцитов в р ду возрастающих-или убывающих концентраций танАост гонадотропная активнос стандартного препарата При этом К танАврт (например, ме дународного стандарта) может быть экспериментально установлена для данного тест-объекта один раз в люб сезон года и в дальнейшем использоваться в течение ряда лет и в разны сезоны года как постоянная величина при расчетах гонадотропной активност Предлагаемый способ дает возможность судить о гонадотропной активности при достижении соэревания всего лишь небольшого процента ооци тов. Использование концентраций, вызывающих максимальный ответ ткани мишени (процент сЪзревания ооцитов) исключает влияние индивидуальной или сезонной чувствительности рыб (животных) к гонадотропинам на конечный результат биологического т тирования, тем самым повышая его точность, снижает трудоемкость, рас ширяет сезонные возможности биологи ческого тестирования,за счет возможности использования самок с чувствительностью к гонадотропным ropMOHeiM, удешевляет применение способа за счет сокращения количест ва нспользуенаих для тестирования . животных до 2-3 и отсутствия необходимости проведения при кгивдом естировании сравнения с действием тандартного препарата. Стандартный репарат является необходимым только ля первого определения гонадотропной активности и в последующих опыах в другие сезоны года полученные анные могут быть использованы как же известная величина. На фиг. 1 изображено влияние азличных концентраций лютеинизируюего гормона (ЛГ) крупного рогатого скота с активностью 2,7 ед/мг на созревание ооцитов вьюна с разной сезонной чувствительностью к зтому гормону; на фиг. 2 - влияние различных концентраций хорионического гонадотропина (ХГ) с активностью 2500 м.е./мг на созревание ооцитов вьюна с различной сезонной и индивидуальной чувствительностью к этому гормону; на фиг. 3 - влияние различных концентраций препарата гипофиза карпа с активностью 140 м.е./мг на созревание ооцитов вьюна с различной сезонной и индивидуальной чувствительностью к гонадотропинам гипофиза. В конце сентября - начаше октября (а), в январе (б) ив начале апреля (в) процент созревания ооцитов в зависимости от концентрации гормона различен (фиг. 1) и колеблется в разные сезоны года от 2-5 до 70-90%. Однако максимальная реакция (процент созревания ооцитов) наблюдается только при строго определенной концентрации гормона (0,6 мг/мл). Аналогичная закономерность наблюдается и внутри каждого сезона года в отношении индивидуальной чувствительности отдельных рыб, т.е. максимальная реакция (процент созревания ооцитов) наблюдается только при строго определенной концентрации гормона (0,6 мг/мл). В конце сентября-начале октября (а), в январе (б) и в апреле (в) процент созревания ооцитов в зависимости от концентрации ХГ различен (фиг. 2) и колеблется от 2-8 до 70-90% в разное время года и у отдельных животных. Однако максимальная реакция (процент созревания ооцитов) наблюдается только при строго определенной концентрации гормона (80 м.е./мл). В конце сентября-начсше октября (а), в январе (б) и в апреле (в) процент созревания ооцитов в зависимости от концентрации препарата гипофиза различен (фиг. 3) и колеблется от 2-8 до 70-90% в разное время года и у отдельных животных. Однако максимальная реакция (процент созревания ооцитов) наблюдается только при строго определенной концентрации препарата (0,4 мг/мп или 56 м.е./мл). Пример 1. Яичники, взятые от только что .декапитированной рыбы. разделяют на фрагменты по 15U ооцитов в каждом. В каждый из 24 бюксов диаметром 45 мм помещают по одному фрагменту яичника и добавляют 5 мл питательной среды № 199 на растворе Хенкса, содержащей определенную концентрацию исследуемых гипофизов карпа 111-й стадии зрелости или стандартный препарат гипофизов карпа 1У-Й стадии зрелости с активност 140 м.е./мг. В 12 бюксах создают концентрацию стандартного препарата мг/мл: 1,4; If 2; 1,1; 1,0; 0,9; 0,8 0,7; 0,6; 0,5; 0,4; 0,3; 0,2 или соответственно, м.е./мл: 196, 168, 154; 140; 126; 112; 98; 84; 70; 56; 28, а в других 12 бюксах создают концентрации исследуемого препарата гипофизов карпа 111-й стадии зрелости, мг/мл: 1,4; 1,2; 1,1; 1,0 0,9; 0,8; 0,7; 0,6; 0,5; 0,4; 0,3; 0,2. Инкубацию ооцитов с гормонами проводят в течение 48 ч при 18с. Через 48 ч инкубации ооцитов анализируют влияние каждой концентрации исследуемого и стандартного препара тов на созревание ооцитов вьюна, т.е. проводят подсчет созревших и несозревших ооцитов и вычисляют про цент созревания. Устанавливают концентрации исследуемого и стандартного препаратов, вызывающие наиболее значительный процент созревания ооцитов, который наблюдается (фиг.З при концентрации стандартного препарата 0,4 мг/мл или соответственно 56 м.е./мл и при концентрации препа рата гипофизов карпа 111-й стадии зрелости 0,9 мг/мл, Исходя из соотношения станд ОРТ/ стандарт. исслелг мое лед получаем - 0,4 X 140 А«сслеА. по 62,2 м.е./ Пример 2. Яичники, взятые от.только что декапитированной рыбы разделяют на фрагменты по 200 ооцитов в каждом. В каждый из 32 бюксов диаметром 45 мм помещают по 2 фрагмента яичника и добавляют по 5 мл питательной средал № 199 на растворе Хенкса, содержащей определенную концентрацию исследуемого препарата ХГ или стандартного препарата ХГ с уста новленной активностью 1000 м.е./мг. В 16 бюксах создают концентрации стандартного препарата, м.е. 40; 50г 60; 70; 80; 90; 100; 110; 120; 140; 16О; 200; 240; 280; 320; 360 или соответственно, мг/мл: 0,04; 0,05; 0,06; 0,07; 0,08; 0,09j 0,10; 0,11; 0,12; 0,14; 0,16; 0,20; 0,24; 0,28; 0,32; 0,36. В 16 других бюксах создают концентрации исследуемого препарата ХГ, мг/мл: 0,04; 0,05; 0,06; 0,07; 0,08; 0,09; 0,10; 0,11; 0,12; 0,14; 0,16; 0,20; 0,24; 0,28; 0,32; 0,36. Инкубацию ооцитов с гормонами проводят в течение 53 ч при . Через 53 ч инкубации ооцитов анализируют влияние каждой концентрации исследуемого и стандартного препаратов на созревание ооцитов вьюна, т.е. проводят подсчет созревших и несозревших ооцитов и вычисляют процент созревания. Устанавливают концентрации исследуемого и стандартного препаратов, вызывающие наиболее значительный процент созревания ооцитов. Наиболее значительный процент созревания ооцитов вызывает концентрация стандартного препарата 0,08 м/е./мл или соответственно 80 M.eJ/мл и концентрация исследуемого препарата ХГ 0,12 мг/мл. Исходя из соотношения . стандарт. стандарт. получаем (леА.- КиослелА.еслел ,,, „.,./„, Пример 3 (отсутствие в данное время стандартного препарата). Яичники, взятые от только что декапитированной рыбы, разделяют на фрагменты по 200 ооцитов в каждом. В каждый из 16 бюксов диаметром 45 мм помещают по два фрагмента яичника и добавляют по 5 мл питательной среды № 199 на растворе Хенкса,содержащей определенную концентрацию исследуемого препарата ХГ.В 16 бюксах создают концентрацию препарата ХГ,мг/мл1 0,02; 0,03; 0,04; 0,05; 0,06; 0,07; 0,08; 0,09; 0,10; 0,11; 0,12; 0,13; 0,14; 0,16; 0,18; 0,20. Инкубацию ооцитов с гормонами проводят в течение 48 ч при . Через 48 ч инкубации ооцитов анализируют влияние каждой концентрации,исследуемого препарата на созревание ооцитов вьюна, т.е. проводят подсчет созревших и несозревших ооцитов и вычисляют процент созревания. Устанавливают концентрацию препарата, вызывающую наиболее значительный процент созревания ооцитов в данных условиях, юна равняется 0,03 мг/мл., Максимальная реакция на гонадотропный гормон (процент созревания ооцитов) независимо от индивидуальной и сезонной чувствительности животных наблюдает ся только при строго определенной концентрации гормона (стандартного препарата). Для данного определения активности исследуемого препарата ХГ можно использовать параметры тестиования стандартного препарата (приер 2), проведенного несколько месяев назад на другой группе рыб с иной чувствительностью ткани-мишени гонадотропному гормону. Подставляем в формулу атандотт- необходимые ИССЛвА I-VICCAfeA. параметры стандартного препарата ХГ

с активностью 1000 м.е./мг из примера 2 и получаем

к OtOSxlOOQ ,,-,с . /.тл . 0,03 м.е./мг

Использование предлагаемого изобретения позволяет повысить точность и экономичность способа, снизить его трудоемкость, расширить сезонные, возможности биологического тестирования .за счет использования самок рыб с низкой чувствительностью к гонадотропным гормонгил и отсутствия необходимости проведения при каждом тестировании сравнения с действием стандартного препарата.

Формула изобретения

Способ определения гонадотропной активности гипофизов рыб путем обработки культуры тканей ооцитов рыб в. питательной среде стандартным и определяемЁШ растворами гормонов с последующей инкубгщией при температуре 18-20 с и определением количества созревших ооцитов, отличающий с я .тем, что, с целью повышения точности, обработке подвергают культуру тканей ооцитов самок рыб

с низкой чувствительностью к гонадотропным гормонам, инкубацию проводят до .появления 2-3% созревших ооцитов, а гонадотропную активность гормонов рыб определяют по формуле

... Кисслед. концентрация исследуемого препарата, вЫзы0вающая максимальный

процент созревания в ряду возрастающих или убывакйцих концентраций; отоилаРг - койцевтрация. стандарт5ного препарата, вызызаюи ая максимальный процент созревания ооцитов в ряду возрастгиощих или убывающих 0концентраций)

стандарт- гонадотропная активность стандартного препарата.

Источники информации, принйтые во внимание при экспертизе 1. Веригин В.Ё, и Щ). Опыт определения активности гипофизов.Вопросы ИХТИОЛОГИИ , т. 11,

вып. б., 1971, с. 1014-1026. аз ом 0,5 0,6 &1 0.8 0.9 W 11 1.2 1.3 ar az ft3 9.4 o.s ал ол o.8 0.9 w // К(и1г1мл) it i к{мг/мА)

af 0.2 C 0,4 0,5 0.6 0.7 9.8 0.9 tO M Фие.1 1.t U К(нл1нл)

и I

§ 4

§

ч, го

§

I

с

U

20

I

ТО

J

8

0

W гв

40

60 га

1ZO W К{ме/мл)

т J40 к()