СПОСОБ ОТБОРА ПАЦИЕНТОК С СИНДРОМОМ "СЛАБОГО" ОТВЕТА ЯИЧНИКОВ ДЛЯ ПРОВЕДЕНИЯ ПРОГРАММЫ "ДОНАЦИЯ ООЦИТОВ" Российский патент 2015 года по МПК G01N33/53 G01N33/74 

Изобретение относится к медицине, а именно к гинекологии и репродуктологии, и может быть использовано в программах ЭКО и ПЭ для определения показаний к проведению программы «Донация ооцитов».

В настоящее время внимание всех репродуктологов мира направлено на поиск путей повышения эффективности программ вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ). Исход программы ЭКО во многом зависит от двух составляющих: состояния слизистой оболочки полости матки и качества переносимых в полость матки эмбрионов. Благодаря развитию гормональной стимуляции яичников в настоящее время в программе ЭКО получают большое число яйцеклеток (ооцитов), оплодотворение которых позволяет выбрать и перенести в полость матки эмбрионы лучшего качества. Эффективность ЭКО достигает 30-40%.

Однако, несмотря на применение современных препаратов, у некоторых пациенток в программах ЭКО получают мало ооцитов, а в ряде случаев, если клетки не удается получить, программу прерывают. Малое количество ооцитов (менее 3-5 клеток) и неравноценность их по качеству (незрелые ооциты, нарушение структуры клеток) может быть причиной сбоев на этапе оплодотворения. При этом выбор эмбрионов для переноса в полость матки представляет определенные трудности. Часто возникает необходимость переноса эмбрионов в более ранние сроки, на 2-3 сутки культивирования (до стадии бластоцисты).

Также выяснилось, что не у всех пациенток программ вспомогательных репродуктивных технологий фолликулярный аппарат яичников одинаково реагирует (отвечает) на вводимые стандартные дозы фолликулостимулирующего гормона при проведении контролируемой стимуляции яичников (КСЯ) с целью получения мультифолликулярного роста. Состояние, при котором регистрируется неадекватная ответная реакция яичников на стандартные дозировки вводимых гонадотропинов, получило название синдрома «слабого» ответа яичников (ССОЯ). При этом состоянии в протоколе стимуляции яичников достигается не более 3-5 преовуляторных фолликулов и/или ооцитов при пункции (Корсак B.C. и соавт., 1996, Боярский К.Ю., 1998, Краснопольская К.В., 2003, Дахно Ф.В., 2011).

По данным статистики, пациентки со «слабым» ответом яичников на стимуляцию составляют около 1/3 всех пациенток программ ЭКО. В данной группе женщин частота наступления беременности наиболее низкая и составляет от 7,6 до 17,5%. При этом в 12-30% проведение программы ЭКО может быть прекращено из-за отсутствия ооцитов или эмбрионов, пригодных для переноса. Как правило, наиболее часто «слабый» ответ яичников в программе ЭКО наблюдается у женщин старшего репродуктивного возраста со сниженным овариальным резервом. Термин ″овариальный резерв″ характеризует запас ооцитов в яичниках женщины.

«Слабый» ответ яичников в программе ЭКО у пациенток молодого и старшего репродуктивного возраста в разной степени влияет на эффективность программы ЭКО. Это связано с качеством ооцитов. При одинаковом количестве ооцитов и эмбрионов эффективность программы у пациенток молодого возраста будет выше.

Таким образом, «слабый» ответ яичников на стимуляцию можно предполагать в следующих случаях:

пациентка старше 37 лет;

уровень ФСГ на 2-3 день цикла более 10 МЕ/л;

количество антральных фолликулов при УЗИ на 2-4 день цикла менее 5;

уровень АМГ<1 нг/мл;

избыточный вес (ИМТ>30 кг/м²);

операции на яичниках в анамнезе;

плохой ответ на стимуляцию в предыдущих программах.

Непосредственно в протоколе ЭКО о «слабом» росте фолликулов будет свидетельствовать определение при УЗИ менее 4 доминантных фолликулов после 6 дней стимуляции гонадотропинами с дозами ФСГ 300 ME (Охтырская Т. А., источник: http://www.babyplan.ru/biblioteka).

Такой ответ яичников на стимуляцию снижает результативность проводимых программ, приводя к высоким экономическим затратам на лечение.

В связи с этим прогнозирование возможного ответа яичников на контролируемую стимуляцию является актуальной задачей современной репродуктологии. Имея возможность предвидеть ответ яичников на проводимые программы, врачи репродуктивной медицины могут своевременно проводить коррекцию лечения, меняя по мере необходимости его тактику и методики (Кулаков В.И., 2002, Милютина М.А., 2007).

Для оценки овариального резерва проводят гормональное обследование на 2-3 день цикла (ЛГ, ФСГ, эстрадиол, АМГ) и ультразвуковое исследование органов малого таза. Значения ФСГ от 3 до 8 МЕ/л предполагают хороший овариальный резерва и адекватный ответ яичников на стимуляцию в программе ЭКО. Повышение ФСГ может быть предиктором слабого ответа. В ряде случаев у молодых женщин на фоне нормальных показателей ФСГ возможно скрытое снижение овариального резерва, выявляемое только по низкому уровню АМГ. Другим критерием овариального резерва является объем яичников и количество фолликулов, определяемое при УЗИ на 2-4 день цикла. Наличие менее 5 фолликулов диаметром до 10 мм расценивается как косвенный признак сниженного овариального резерва (http://www.babyplan.ru/biblioteka/_/eko/slabyj-otvet-v-programmah-eko-sovremennyj-vzglyad-na-problemu#ixzz33ELw9NkT).

Наряду с перечисленными методами существуют дополнительные тесты, позволяющие уточнить функциональное состояние яичников - определение ингибина В, тесты с гонадотропинами (гонадотропин-рилизинг гормоном). Однако, как правило, функциональные тесты, являясь дорогостоящими и создающими нагрузку на работу яичников, не вносят значимый вклад в диагностику и зачастую приводят к появлению функциональных кист.

Из существующего уровня техники известен способ прогнозирования исходов программы ЭКО и ПЭ путем качественной и количественной оценки содержимого фолликулов, отличающийся тем, что в фолликулярной жидкости, аспирированной раздельно из правого и левого яичников, исследуют активность пептид-гидролаз и при ее уровне не менее 75 мг/мл/ч в одном из яичников прогнозируют благоприятный исход (патент РФ №2193777, 27.11.2002).

Недостатками данного технического решения являются:

1. Высокий риск возникновения осложнений, связанных с выполнением трансвагинальной пункции фолликулов, которая проводится под общим наркозом и может осложниться кровотечением.

2. Необходимость исследования двух образцов фолликулярной жидкости (из правого и левого яичников).

3. Метод осуществляется на этапе пункции фолликулов, до которой значимая часть пациентов со «слабым» ответом яичников на гонадотропную стимуляцию не доходит, ввиду абсолютного отсутствия доминантных фолликулов.

4. Не позволяет отобрать пациенток с синдромом «слабого» ответа яичников для проведения программ «Донация ооцитов».

Известен способ прогнозирования исхода программы ЭКО и ПЭ путем исследования фолликулярной жидкости, отличающийся тем, что в фолликулярной жидкости проводят количественное определение содержания ФНО и ФРФ, рассчитывают прогностический индекс (ПИ) по формуле ПИ=0,0027·X+Y·(+8,9626·10-7·Y-3,0827·10-6·X)-0,1448, где X - количество ФНО, Y - количество ФРФ, и при значении ПИ, меньшем чем 0,3038, прогнозируют благоприятный исход оплодотворения in-vitro, а при значении, равном или большем чем 0,3038, прогнозируют неблагоприятный исход оплодотворения in-vitro (патент РФ №.2273031, 27.03.2006).

Недостатками данного технического решения являются:

1. Высокий риск возникновения осложнений, связанных с выполнением трансвагинальной пункции фолликулов, которая проводится под общим наркозом и может осложниться кровотечением.

2. Метод осуществляется на этапе пункции фолликулов и процесса оплодотворения in-vitro, до которых значимая часть пациентов со «слабым» ответом яичников на гонадотропную стимуляцию не доходит, ввиду абсолютного отсутствия доминантных фолликулов.

3. Не позволяет отобрать пациенток с синдромом «слабого» ответа яичников для проведения программ «Донация ооцитов».

Известен способ прогнозирования эффективности лечения бесплодия методом экстракорпорального оплодотворения, включающий проведение трансвагинальной пункции фолликулов под контролем УЗИ с последующим исследованием полученной фолликулярной жидкости, отличающийся тем, что фолликулярную жидкость подвергают хемилюминесцентному анализу по стандартной методике, определяют свободнорадикальную активность образцов и по показателю общей антиоксидантной активности дают прогноз наступления беременности: при показателях общей антиоксидантной активности 0,05 и выше дают неблагоприятный прогноз, при показателях общей антиоксидантной активности ниже 0,05 дают благоприятный прогноз - вероятность наступления беременности более 50% (патент РФ №2357673, 10.06.2009).

Недостатками данного технического решения являются:

1. Высокий риск возникновения осложнений, связанных с выполнением трансвагинальной пункции фолликулов, которая проводится под общим наркозом и может осложниться кровотечением.

2. Метод осуществляется на этапе пункции фолликулов, до которой значимая часть пациентов со «слабым» ответом яичников на гонадотропную стимуляцию не доходит, ввиду абсолютного отсутствия доминантных фолликулов.

3. О прогнозе беременности может идти речь после получения ооцитов, оплодотворения, культивирования эмбрионов и переносе их в полость матки, что невозможно у женщин с отсутствием доминантных фолликулов на этапе гонадотропной стимуляции.

4. Не позволяет отобрать пациенток с синдромом «слабого» ответа яичников для проведения программ «Донация ооцитов».

Известен способ прогнозирования исхода программы экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов у женщин с бесплодием путем исследования в периферической венозной крови антигенов комплекса гистосовместимости до начала стимуляции суперовуляции, отличающийся тем, что в лейкоцитах определяют полиморфизм генов HLA II класса и при обнаружении носительства гаплотипов DQA1*0101-DQB1*0501 или DQA1*0102-DQB1*0502 прогнозируют неблагоприятный исход, а при отсутствии носительства гаплотипов DQA1*0101-DQB1*0501 и DQA1*0102-DQB1*0502 - благоприятный исход программы ЭКО и ПЭ (патент РФ №2474822, 10.02.2013).

Недостатками данного технического решения являются:

1. Метод может быть использован только у пациенток с аутоиммунными заболеваниями, привычным невынашивание беременности, самопроизвольными абортами в анамнезе.

2. Для анализа HLA-антигенов используется метод серологического гистотипирования, который основывается на реакции лизиса клеток с последующим микроскопированием, точность которого зависит от субъективной оценки исследователя.

3. Метод ориентирован на прогнозирование исходов завершенных программ ЭКО (после переноса эмбрионов в полость матки) и не учитывает пациенток с синдромом «слабого» ответа яичников и отсутствия доминантных фолликулов на этапе гонад отропной стимуляции.

4. Не позволяет отобрать пациенток с синдромом «слабого» ответа яичников для проведения программ «Донация ооцитов».

Несмотря на то, что установлено несколько возможных этиологических факторов, снижение овариального резерва вероятнее всего является основной причиной «слабого» ответа яичников на проводимую стимуляцию суперовуляции (Булавенко О.В., 2011, Устинкина Т.И., Шустов С.Б., 2011, Питько В.А. и соавт., 2013), что, в свою очередь, ограничивает эффективность применения схем стимуляции суперовуляции как с применением агонистов, так и антагонистов ГнРГ, т.е. у женщин со сниженным ответом яичников на стимуляцию суперовуляции эффективность лечения бесплодия в большей степени зависит от состояния овариального резерва пациенток, чем от выбранных схем индукции суперовуляции.

Не существует точного прогностического теста для оценки степени ответа яичников на стимуляцию суперовуляции, однако существует ряд тестов для определения овариального резерва с различной прогностической значимостью. Высокий уровень ФСГ (более 12-15 МЕ/л), повышенный уровень эстрадиола (более 30-75 пг/мл) и пониженный уровень ингибина В (менее 45 пг/мл) в сыворотке крови на 2-3 день менструального цикла рассматриваются в настоящее время основными прогностическими характеристиками. Кроме того, пониженная концентрация в сыворотке крови антимюллеровского гормона может служить еще одним индикатором старения яичника (Barri, P.N., Martinez, F., Coroleu, В., et al. Managing non-responders. Fertility and Reproductive Medicine// Proceedings of XVI World Congress on Fertility and Sterility. - 1998. - P.127-137.; Gorgy, A., Taramissi, M. Defining and predicting the poor responder// Fertil. Steril. - 2001. - V.75. - P.226-227.; Keay SD, Liversedge NH, Mathur RS, et al. Assisted conception following poor ovarian response to gonadotrophin stimulation// Br J Obstet Gynaecol. - 1997. - V.104(5). - P.521-527.; Mohamed KA, Davies WA, Allsopp J, et al. Agonist ″flare-up″ versus antagonist in the management of poor responders undergoing in vitro fertilization treatment// Fertil Steril. - 2005. - V.83(2). - P.331-335.).

Наиболее близким к заявленному техническому решению является метод, с помощью которого для оценки овариального резерва проводят гормональное обследование на 2-3 день цикла (ЛГ, ФСГ, эстрадиол, АМГ) и ультразвуковое исследование органов малого таза. Показатели ФСГ от 3 до 8 МЕ/л предполагают хороший овариальный резерва и адекватный ответ яичников на стимуляцию в программе ЭКО. Повышение ФСГ может быть предиктором «слабого» ответа. В ряде случаев у молодых женщин на фоне нормальных значений ФСГ возможно скрытое снижение овариального резерва, выявляемое только по низкому уровню АМГ. (http://www.babyplan.ru/biblioteka/_/eko/slabyj-otvet-v-programmah-eko-sovremennyj-vzglyad-na-problemu#ixzz33ELw9NkT).

Недостатками данного технического решения являются:

1. Не учитывает возможный регресс антральных фолликулов под влиянием высоких доз ФСГ при низких значениях АМГ.

2. Не позволяет установить вероятность развития доминантных фолликулов или их отсутствия при гонадотропной стимуляции яичников пациенток с синдромом «слабого» ответа.

3. Не позволяет отобрать пациенток с синдромом «слабого» ответа яичников для проведения программ «Донация ооцитов».

Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение является получение прогностического и диагностического маркера, позволяющего до включения в программу ЭКО, выделить пациенток с отсутствием возможности достижения доминантных фолликулов на фоне гонадотропной стимуляции яичников и своевременно определить показания к использованию «донорских» ооцитов.

Поставленная задача решается тем, что способ отбора пациенток с синдромом «слабого» ответа яичников для проведения программы «Донация ооцитов» включает исследование гормонов крови: у пациентки на 2-3-й дни менструального цикла, предшествующие проведению гонадотропной стимуляции исследуют в сыворотке крови уровень антимюллерова гормона (АМГ) и если уровень АМГ составит 0,1-0,5 нг/мл, дополнительно определяют концентрацию фолликулостимулирующего гормона (ФСГ), рассчитывают соотношение абсолютных значений ФСГ/АМГ и, если величина полученного соотношения равна или превышает 51, пациентке осуществляют проведение программы «Донация ооцитов».

Техническим результатом, обеспечиваемым приведенной совокупностью признаков, является своевременная коррекция лечения пациенток с синдромом «слабого» ответа яичников (с отсутствием вероятности получения собственных ооцитов в протоколах ЭКО), подбор оптимальной программы ВРТ с использованием «донорских» ооцитов без ущерба для здоровья этих женщин и существенных материальных затрат.

Антимюлеров гормон или ингибирующее вещество Мюллера - это гомодимерный гликопротеин, состоящий из 535 аминокислот и относящийся к семейству β - трансформирующих факторов роста. Этот нестероидный гормон у женщин вырабатывается только клетками гранулезы фолликулов от преантральной стадии до стадии больших антральных фолликулов, т.е. в стероиднезависимом периоде. Максимальное количество данного гормона выделяется клетками гранулезы преантральных и антральных фолликулов диаметром 4 мм. В фолликулах большего диаметра (6-8 мм) секреция данного вещества прекращается. В дальнейшем уровень АМГ резко падает, что приводит к росту активности ароматазы и увеличению продукции эстрадиола. Это говорит о существовании механизма обратной связи между синтезом гранулезой предоминантного фолликула эстрадиола и АМГ.

АМГ имеет преимущественно 2 типа воздействия на яичник: подавляет первичные стадии роста фолликулов и фолликулостимулирующий гормонально-зависимый рост и селекцию преантральных и небольших антральных фолликулов. Таким образом, АМГ защищает гранулезную ткань растущих фолликулов от избыточного влияния ФСГ. При снижении уровня АМГ происходит более быстрый рост доминирующего фолликула. Эти фолликулы продуцируют гормон ингибин В, который определяет базальный уровень и более раннее влияние ФСГ с его негативным влиянием на антральные фолликулы. Дальнейшее уменьшение количества антральных фолликулов приводит к снижение уровня АМГ.

Показано на основании полученных результатов исследования уровней антимюллерова гормона, что близкие значения его уровней у пациенток нормальным ответом яичников на стимуляцию и со слабым ответом не позволяют рассматривать антимюллеров гормон как абсолютный критерий ответа яичников в программах вспомогательных репродуктивных технологий (В.А. Питько и др., Определение антимюллерова гормона и допплерометрические исследования кровоснабжения яичников в диагностике синдрома слабого ответа яичников. - Международный медицинский журнал, 2013, №2, С.72-75)

Снижение уровня АМГ является наиболее ранним и достоверным показателем старения репродуктивной системы и в совокупности с подсчетом количества антральных фолликулов и уровнем ФСГ может определять овариальный резерв.

Фолликулостимулирующий гормон (ФСГ), или фоллитропин, вызывает рост и созревание фолликулов яичников и их подготовку к овуляции. ФСГ продуцируется гипофизом. У женщины ФСГ стимулирует образование фолликулов. Американские исследователи M. Soules et al. (2001) разработали достаточно стройную классификацию периодов репродуктивной функции женщины. Согласно этим данным, переход к менопаузе начинается при первом же статистически значимом повышении базального уровня ФСГ, что происходит в конце третьего - начале четвертого десятилетия жизни женщины. Возрастное уменьшение общего числа фолликулов приводит к снижению числа антральных фолликулов, из которых происходит селекция доминантных фолликулов. Эти фолликулы продуцируют гормон ингибин В, который определяет базальный уровень ФСГ. С возрастом уровень ингибина уменьшается, что приводит к повышению базального уровня ФСГ. В то же время, в более поздних работах было установлено, что наиболее ранним и достоверным показателем старения женской репродуктивной системы является снижение уровня АМГ. При исследовании различных факторов старения яичников (уровень АМГ, количество антральных фолликулов, базальные уровни ФСГ, ингибина В и эстрадиола), обнаружено, что только уровень АМГ и количество антральных фолликулов имеют четкую корреляцию с возрастом у женщин всех возрастных групп, тогда как уровни ФСГ и ингибина В обладали такой корреляционной связью только у пациенток после 40 лет, а уровень эстрадиола вообще не имел корреляционной связи (Булавенко О.В., 2011).

Но если говорить не о возрасте женщины, а о факте сниженного овариального резерва яичников, возникшего по различным причинам в течение репродуктивного периода (перенесенные операции на яичниках, аутоиммунные процессы, воспалительные процессы), становится понятным, что крайних минимальных значений изученных маркеров, указывающих на способность яичников женщины продуцировать полноценные ооциты до настоящего времени не установлено.

Также нет четких критериев и их нижних нормативных границ, указывающих на возможность или невозможность получения доминантных фолликулов при гонадотропной стимуляции яичников в программах ЭКО (а, следовательно, и ооцитов, и эмбрионов) у пациенток со сниженным АМГ 0,1 до 0,5 нг/мл и нормальным или повышенным уровнем ФСГ. В результате этого значимая часть пациенток с синдромом «слабого» ответа яичников, вынужденно подвергается необоснованному воздействию высоких доз гонадотропинов и в последующем снимается с протоколов стимуляции. Даже для последующих программ ВРТ (как минимум для второй) решение об очередной попытке стимуляции пациентка принимает самостоятельно, опираясь на мнение врача, о том, что только аналогичный отрицательный результат подтвердит необходимость «донации» ооцитов. Таким образом, пользуясь настойчивым желанием пациентки получить собственные ооциты, врачи, ввиду отсутствия убедительного маркера вынуждены назначать второй «бесполезный» протокол стимуляции с использованием еще более высоких доз гонадотропинов.

Нечеткость диагностических критериев, определяющих «слабый» ответ яичников на стимуляцию, отсутствие комплексной оценки овариального резерва, позволяющей прогнозировать реакцию яичников на введение индукторов, затрудняют выбор наиболее эффективной программы ВРТ, что в конечном итоге ухудшает результаты лечения бесплодия у данного контингента больных и требует дальнейших исследований.

При этом низкие показатели АМГ при неизменных или повышенных уровнях ФСГ могут отражать степень истощения яичников и в совокупности, по нашему мнению, являться прогностическими критериями целесообразности включения пациенток в программу ЭКО для достижения собственных ооцитов, либо выбора альтернативного метода лечения - программы «Донация ооцитов». Разработанный нами способ отбора пациенток с синдромом «слабого» ответа яичников для проведения программы «Донация ооцитов» позволит врачу-репродуктологу, используя абсолютные значения ФСГ и АМГ, легко вывести коэффициент ФСГ/АМГ для определения дальнейшей тактики ведения конкретной больной - либо включение пациентки в протокол ВРТ для достижения собственных ооцитов, либо перевод пациентки на программу с использованием «донорских» ооцитов.

В ходе апробации разработанного нами метода, целенаправленно предложено использование абсолютных значений ФСГ и АМГ. Наши исследования показали, что расчет коэффициента с приведением к единой размерности не меняет сути предложенного способа, но снижает его диагностическую точность. Помимо этого, трудоемкость перевода единиц затрудняет широкое использование способа в клинической практике репродуктологов.

Подробное описание способа и примеры его клинического выполнения

Способ осуществляют следующим образом. У пациенток на 2-3 дни менструального цикла, предшествующие проведению гонадотропной стимуляции исследуют в сыворотке крови уровень антимюллерова гормона (АМГ) и если уровень АМГ составит 0,1-0,5 нг/мл, дополнительно исследуют сывороточные концентрации ФСГ (фолликулостимулирующего гормона) и рассчитывают соотношение абсолютных значений ФСГ/АМГ и, если величина полученного соотношения равна или превышает 51, пациентке осуществляют проведение программы «Донация ооцитов».

Трансвагинальное ультрасонографическое исследование органов малого таза и яичников проводят на аппарате «AlokaprosaundSSD - 3500 SX» (Япония).

1. Определение содержание антимюллерова гормона (АМГ) в сыворотке крови.

Определение в сыворотке крови содержания антимюллерова гормона выполняют с использованием иммуноферментного набора «AMHGenIIELISA» (BeckmanCoulterInc., США). Забор крови проводят утром натощак из локтевой вены.

Определение АМГ основано на принципе ферментно-усиленного «двухступенчатого» сэндвич - контроля. При проведении анализа стандарты, контроль и образцы пациентов инкубировались в микропланшетных ячейках, покрытых антителами к антимюллерову гормону. После инкубации и промывки ячейки обрабатывались биотинилированными антителами к антимюллерову гормону. После второй инкубации и последующей промывки добавлялся стрептавидин, конъюгированный с пероксидазой хрена. После третьей инкубации и последующей промывки ячейки инкубировались с субстратом хреногенного раствора. Затем добавлялся стоп-раствор и определялось количество превращенного фермента субстрата путем измерения оптической плотности при длинах волн 450 и между 600 и 630 нм. Измеренное поглощение прямо пропорционально концентрации присутствующего антимюллерова гормона. Набор стандартов антимюллерова гормона использовался для построения стандартной кривой поглощения, по которой можно было рассчитать его неизвестные концентрации в исследуемых образцах.

2. Определение содержания фолликулостимулирующего гормона (ФСГ) в сыворотке крови.

Определение в сыворотке крови содержания фолликулостимулирующего гормона выполняют с использованием иммуноферментного набора «ГонадотропинИФА - ФСГ» («Алкор-Био», Россия). Забор крови проводят утром натощак из локтевой вены.

В наборе использован «сэндвич» - вариант твердофазного иммуноферментного анализа. Для реализации методики использованы два моноклональных антитела с различной эпитопной специфичностью к ФСГ. Одно из них иммобилизовано на твердой фазе (внутренняя поверхность лунок), второе конъюгировано с пероксидазой хрена. В лунках, при добавлении исследуемого образца и конъюгата анти-ФСГ-пероксидаза, во время инкубации одновременно происходит иммобилизация ФСГ, содержащегося в исследуемом образце, и связывание образовавшегося комплекса с конъюгатом. Несвязывающиеся компоненты удаляются промывкой. Количество связывающегося конъюгата прямо пропорционально количеству ФСГ в исследуемом образце.

Во время инкубации с раствором ТМБ происходит окрашивание раствора в лунках. Степень окраски прямо пропорциональна концентрации ФСГ в анализируемых пробах. После измерения оптической плотности раствора в лунках на основании калибровочного графика рассчитывается концентрация ФСГ в исследуемых образцах.

Рассчитывают соотношение абсолютных значений ФСГ/АМГ и, если величина полученного соотношения равна или превышает 51, пациентке осуществляют проведение программы «Донация ооцитов».

Работоспособность заявляемого способа подтверждается следующими клиническими примерами:

Пример 1.

Больная Н-ева, 41 года, амбулаторная карта №513 обратилась в ООО «Центр репродукции человека и ЭКО» с целью проведения ей программы ИКСИ. Больная предъявляет жалобы на первичное бесплодие в течение 3,5 лет. Из анамнеза известно, что больная в 2011 году перенесла консервативную миомэктомию. В 2012 г при гистероскопии диагностирован аденомиоз. У супруга выявлена олигоастенозооспермия, лейкоспермия.

На этапе обследования перед программой по эндокринному статусу диагностирован синдром гиперандрогении надпочечникового генеза, назначена коррекция преднизолоном. По инфекционному фактору у пациентки выявлен дисбиоз цервикального канала, у супруга - дисбиоз семенной плазмы, проведено противовоспалительное лечение с эффектом.

Перед включением в протокол стимуляции на 2 день менструального цикла определяли сывороточные концентрации ФСГ и АМГ, которые у пациентки составили 8,4 мМЕ/мл и 0,15 нг/мл, соответственно. Исходя из полученных значений, определяли коэффициент отношения ФСГ к АМГ - ФСГ/АМГ=56, что свидетельствовало, согласно нашему способу, о невозможности получения доминантных фолликулов в цикле гонадотропной стимуляции и необходимости дальнейшего лечения пациентки с использованием «донорских» ооцитов. Стимуляция суперовуляции проведена со 2 дня менструального цикла с использованием гонадотропных препаратов в суммарной дозе 2700 ME, в сочетании с антагонистами гонадотропин-рилизинг гормона, назначенными с 6 дня гонадотропной стимуляции яичников, продолжительность введения составила 5 дней. Гормональная стимуляция сопровождалась ультразвуковым и гормональным мониторингом. При 3-х кратном УЗ исследовании, проведенном на 5, 8 и 10 дни гонадотропной стимуляции лидирующие фолликулы не были визуализированы. Больной рекомендована отмена дальнейшей овариальной стимуляции, ввиду отсутствия ее эффекта. В дальнейшем успешно осуществлена программа «Донация ооцитов».

Пример 2.

Больная Д-ова, 34 лет, амбулаторная карта №488 обратилась в ООО «Центр репродукции человека и ЭКО» с целью проведения ей программы ИКСИ. Больная предъявляет жалобы на первичное бесплодие в течение 4 лет. Из анамнеза известно, что в 2012 году произведена лапароскопия в объеме сальпингоовариолизиса, резекции правого яичника, каутеризации левого яичника по поводу апоплексии правого яичника. В 2012 году проведено 8 искусственных инсеминаций спермой мужа, из них 6 на фоне стимуляции клостилбегитом, 2 - в естественном цикле. У супруга выявлена астенозооспермия. В 2013 году пациентка была включена в протокол стимуляции для проведения программы ИКСИ №1. На фоне гормональной стимуляции с использованием гонадотропинов в суммарной дозе 3500 ME, в сочетании с антагонистами гонадотропин-рилизинг гормона, назначенными с 6 дня гонадотропной стимуляции яичников, продолжительность введения составила 7 дней, программа была остановлена ввиду отсутствия доминантных фолликулов.

На этапе обследования перед второй программой ИКСИ по эндокринному статуса патологии не выявлено. По инфекционному фактору у супруги выявлен кандидозный вагинит, у супруга - дисбиоз семенной плазмы, проведено противовоспалительное лечение с эффектом.

После 4-х месячного перерыва после 1 программы ИКСИ, перед включением в протокол стимуляции №2 на 2 день менструального цикла определяли сывороточные концентрации ФСГ и АМГ, которые у пациентки составили 5,1 мМЕ/мл и 0,1 нг/мл, соответственно. Исходя из полученных значений, определяли коэффициент отношения ФСГ к АМГ (ФСГ/АМГ=51). Что свидетельствовало, согласно нашему способу, о невозможности получения доминантных фолликулов в цикле гонадотропной стимуляции и необходимости дальнейшего лечения пациентки с использованием «донорских» ооцитов. Стимуляция суперовуляции проведена со 2 дня менструального цикла с использованием гонадотропных препаратов в суммарной дозе 2650 ME, в сочетании с антагонистами гонадотропин-рилизинг гормона, назначенными с 6 дня гонадотропной стимуляции яичников, продолжительность введения составила 5 дней. Гормональная стимуляция сопровождалась ультразвуковым и гормональным мониторингом. При 3-х кратном УЗ исследовании, проведенном на 5, 8 и 10 дни гонадотропной стимуляции лидирующие фолликулы не были визуализированы. Больной рекомендована отмена дальнейшей овариальной стимуляции, ввиду отсутствия ее эффекта. В дальнейшем успешно осуществлена программа «Донация ооцитов».

Пример 3.

Больная Ч-ян, 37 лет амбулаторная карта №1473 обратилась в ООО «Центр репродукции человека и ЭКО» с целью проведения ей программы ИКСИ спермой донора. Больная предъявляет жалобы на первичное бесплодие в течение 10 лет. Из анамнеза известно, что с 2013 года страдает ревматоидным артритом. На этапе обследования перед программой выявлена гипофункция яичников.

Перед включением в протокол стимуляции на 2 день менструального цикла определяли сывороточные концентрации ФСГ и АМГ, которые у пациентки составили 15 мМЕ/мл и 0,3 нг/мл, соответственно. Исходя из полученных значений, определяли коэффициент отношения ФСГ к АМГ (ФСГ/АМГ=50), что свидетельствовало, согласно нашему способу, о возможности получения доминантных фолликулов на фоне гонадотропной стимуляции и собственных ооцитов в циклах ВРТ. Стимуляция суперовуляции проведена со 2 дня менструального цикла с использованием гонадотропных препаратов в суммарной дозе 2550 ME, в сочетании с агонистами гонадотропин-рилизинг гормона, назначенными с 6 дня гонадотропной стимуляции яичников, продолжительность введения составила 5 дней. На 11 день гонадотропной стимуляции введен триггер овуляции в дозе 10000 ME. Гормональная стимуляция сопровождалась ультразвуковым и гормональным мониторингом. У данной пациентки на момент проведения пункции было зарегистрировано 2 лидирующих фолликула в правом яичнике и 2 - в левом. Толщина эндометрия составила 11 мм.

Аспирация ооцитов проведена через 36 часов после введения овуляторной дозы ХГ под контролем УЗ аппарата «ALOKA 3500» (Япония), оснащенного пункционной траекторией с использованием трансвагинального датчика с адаптером для пункционной иглы «COOK» (Австралия). При пункции было получено 3 ооцита. Произведен перенос 2 эмбрионов в полость матки.

Результатом конкретной программы ИКСИ у данной пациентки явилась маточная беременность, диагностированная первоначально по сывороточному уровню ХГЧ в динамике через 14 и 17 дней после переноса эмбрионов и при УЗИ в 7-8 недель гестации.

В наше исследование было включено 29 пациенток. Критериями включения были: уровень АМГ 0,1-0,5 нг/мл, количество антральных фолликулов от 1 до 3 в каждом яичнике на момент включения в протокол стимуляции (2-3 дни менструального цикла) и настойчивое желание пациентки, направленное на получение собственных ооцитов в программах ВРТ. С целью выявления диагностического критерия, указывающего на крайнюю степень снижения овариального резерва, при котором на фоне гонадотропной стимуляции невозможно достичь развития фолликулов, ретроспективно, после завершения контролируемой овариальной стимуляции и протокола ВРТ пациентки были разделены на 3 клинические группы. В первую клиническую группу (n=9) были включены обследуемые, у которых на фоне гонадотропной стимуляции в протоколах ВРТ не удалось достичь развития фолликулов. Вторую клиническую группу (n=14) составили пациентки, у которых на фоне идентичных доз вводимых гонадотропинов удалось получить ответную реакцию яичников в виде развития доминантных фолликулов и получения при трансвагинальной пункции яичников не менее 1 ооцита. Однако эффекта после проведенной программы ВРТ (клинической беременности) не наступило. Третья группа (n=6) была сформирована из пациенток с диагностированной клинической беременностью после проведения протокола ВРТ с использованием аналогичной гонадотропной стимуляции.

В качестве контроля было проведено аналогичное обследование у пациенток, включенных в программы ВРТ с нормативным уровнем АМГ от 1 до 2,5 нг/мл и с количеством антральных фолликулов более 5 в каждом из яичников на момент включения в программу. Ретроспективно были отобраны 10 пациенток с положительным результатом проведенных программ ВРТ (клинически подтвержденная беременность).

В каждой из исследуемых групп на момент включения в программу на 2-3 дни менструального цикла определяли уровни ФСГ и АМГ. Вычисляли коэффициент отношения абсолютных значений ФСГ к АМГ (ФСГ/АМГ). Проведенный межгрупповой сравнительный анализ показал, что у обследуемых 1 клинической группы вариабельность коэффициента находилась в пределах от 51 до 118. Средний внутригрупповой коэффициент составил 84,8. Во второй клинической группе коэффициент отношения ФСГ/АМГ находился в пределах 24,2-50. Среднее значение коэффициента составило 39,1. В наиболее успешной третьей клинической группе колебания изучаемого коэффициента определялось пределами 11,6-50. При этом в среднем коэффициент составил 32,3. В контрольной группе коэффициент отношения ФСГ/АМГ колебался от 2,6 до 6,7, в среднем составив 4,4. Приведенные данные указывают на тот факт, что у пациенток с отсутствием ответной реакции яичников на гонадотропную стимуляцию яичников регистрировался наивысший коэффициент отношения ФСГ/АМГ, превышающий в 19,3 раза коэффициент в группе контроля. При менее выраженном истощении яичников (во 2 и 3 клинически группах) изучаемый коэффициент был соответственно в 2,2-2,6 раза меньше по сравнению с 1 группой и в 8,9-7,3 раза соответственно выше, чем в группе контроля.

Анализ представленных данных позволил нам предложить коэффициент отношения ФСГ/АМГ в качестве оценки резервных возможностей яичников в протоколах ВРТ и выделения группы пациенток с критически выраженным истощением яичников с целью определения показаний к программе «Донация ооцитов».

Заявленный способ позволяет:

- своевременно проводить коррекцию тактики лечения пациенток с синдромом «слабого» ответа яичников (с отсутствием вероятности получения собственных ооцитов в протоколах ЭКО),

- определить объективные показания к проведению оптимальной программы ВРТ с использованием «донорских» ооцитов,

- устранить необоснованное медикаментозное воздействие на организм пациенток,

- снизить материальные затраты на лечение бесплодия.

Изобретение относится к медицине, в частности к гинекологии и репродуктологии, и описывает способ отбора пациенток с синдромом слабого ответа яичников, нуждающихся в переводе на программу лечения с использованием донорских ооцитов. Способ характеризуется тем, что у пациентки исследуют гормоны крови, затем на 2-3-й дни менструального цикла, предшествующие проведению гонадотропной стимуляции, исследуют в сыворотке крови уровень антимюллерова гормона (АМГ), если уровень АМГ составит 0,1-0,5 нг/мл, дополнительно определяют концентрацию фолликулостимулирующего гормона (ФСГ), выраженную в мМЕ/мл, рассчитывают соотношение ФСГ/АМГ и, если величина полученного соотношения равна или превышает 51, производят коррекцию лечения и перевод пациентки на программу лечения с использованием донорских ооцитов. Предложенный способ позволяет избегать неэффективных дорогостоящих высокодозированных гонадотропных стимуляций и определяет объективные показания к переводу пациентки на программу лечения с использованием донорских ооцитов без ущерба для здоровья. Способ может быть использован в программах ЭКО и ПЭ. 3 пр.

Способ отбора пациенток с синдромом слабого ответа яичников, нуждающихся в переводе на программу лечения с использованием донорских ооцитов, путем исследования гормонов крови, отличающийся тем, что у пациентки на 2-3-й дни менструального цикла, предшествующие проведению гонадотропной стимуляции, исследуют в сыворотке крови уровень антимюллерова гормона (АМГ) и, если уровень АМГ составит 0,1-0,5 нг/мл, дополнительно определяют концентрацию фолликулостимулирующего гормона (ФСГ), выраженную в мМЕ/мл, рассчитывают соотношение ФСГ/АМГ и, если величина полученного соотношения равна или превышает 51, производят коррекцию лечения и перевод пациентки на программу лечения с использованием донорских ооцитов.