Тушитель белковой флуоресценции Советский патент 1981 года по МПК G01N21/74 

Изобретение относится к биофизике, а именно к методам изучения белковой флуоресценции, и может быть применено для избирательного тушения флуоресцен ции ионами. Известны следующие тушители белковой флуоресценции: Cs, NOC J cV f , ДР.. Однако некоторые из них обладают способностью коагулировать белки (Си), другие (Fe N0 ) - высокой оптической плотностью в зонах возбуждения белковых хромофоров. З способен вступать в реакцию с белками, РО обладает малой эффективностью тушения Все это может привести к искажению ре зультатов исследования и требует внесения поправочных коэффициентов. Цель изобретения - получение неис каженных характеристик белковой флуоресценции. Указанная цель достигается тем, что в качестве тушителя белковой флуо есценции применяют молибдат натрия. В настоящее время молибдат натрия применяют в производстве лаков и красок, а также в химии для определения в кислой среде анионов . , AsO SiOj в виде гетерополисоединений. Новое назначение вещества основано на его способности тушить флуоресценцию белковых хромофоров. П р и ме р. Все растворы готовят на 10 мМ трис-HCl буфере (рН-6,8). Раствор молибдата натрия (1 мл в концентрации 1,5 мМ) непосредственно перед измерением смешивают с 3 мл раствора САЧ (сывороточный альбумин человека в концентрации 100 мкг/мл) или раствором триптофана (20 мкг/мл). Полученной смесью заполняют измерительную кювету с рабочей гранью в 1 см, которую помещают в рабочий отсек спектрофлуориметра. Монохроматор длины волны возбуждения устанавливают на величину 280 нм (в случае САЧ и триптофана) или на 296 нм (где;поглощает только триптофан). Регистрацию флуоресценции проводят в интервале длин волн от 300 до 350 нм, максимум флуоресценции приходился на 332 и 3+ нм при регистрации спектров флуоресценци САМ и триптофана. При анализе экспери ментальных данных эффект внутреннего фильтра рассчитывается в тех случаях, когда оптическая плотность превышает 0,15 ед. Оптическая плотность определяется на спектрофотометре VSU-2P. Ни е J pивeдeны параметры тушения флуоресценции САЧ и триптофана молибдатом и другими тушителями { нитрат натрия и йодид калия) в равных концентрациях (1,5 мМ). Данные о концентрационной зависимости тушения флуоресценции триптофана 8 растворе ионами представле ны на фиг. 1 в Штерн-Фольмеровских координатах: концентрация тушителя ((,- интенсивность флуоресценции без тушителя J - интенсивность флуоресценции с тушителем), Как следует из фиг. t, тушение флуоресценции триптофана полностью соответствует закону Штерна-Фольмера во всем использованном интервале концентраций (от 0,5 мМ до 5 мМ) Полученные величины констант -тушения (К) показывают,что молибдат обладает более высокой эффективностью тушения флуоресценции триптофана по сравнению с йодидом (для йодида к 6,25 М , для молибдата К 11,2 М. Это наглядно видно на фиг. 2, на которой представлены кривые тушения флуоресценции триптофана молибдатом .и йодидом (1-спектр флуоресценции триптофана без тушителя, 2 - спектр тушения йодидом, 3 - спектр тушения молибдатом). б б4 На фиг. 3 представлен спектр флуоресценции САЧ в отсутствии (А) и в присутствии 1,5 мМ молибдата натрия Молибдат в отличие от йодида не способен вступать в реакцию с белками. Об этом свидетельствует тот факт, что молибдат не приводит к изменению форь44 спектров флуоресценции триптофана и САЧ и к смещению их максимумов. Молибдат в зонах возбуждения флуоресценции белковых хромофоров не обладает такой высокой оптической плотностью, как нитрат и Fe . Так, если поглощение NOj при длине волны 296 нм условно принять за 100, то оптическая плотность составляет 39%. Это позволяет б случае применения молибдата не рассчитывать поправку не эффект внутреннего фильтра, так как оптическая плотность растворов триптофана и белка не превышает 0,15 ед. При добавлении MOj требуется внесение поправки на эффект внутреннего фильтра. Преимущество предлагаемого тушителя заключается в том, что он обладает высокой эффективностью, не вступает в реакцию с белками, не требует внесения поправочных коэффициентов при длине |золны 29б нм. Формула изобретения Применение молибдата натрия в качестве тушителя белковой флуоресценции. Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1. Бурштейн Э.А. Биофизика, 1968, 13, 3, i«33.

f12,5Ю,015

5,0

г,5

с

79

10

J amtfd

n

12

Iff

8

300 3iff 340 т 3SO ю0 y/-w

риг.1

втн fi. 16

fit 12 IB

IfffM

3W Ш 60

/f фиг.З