Способ оценки качества спермы сельскохозяйственных животных Советский патент 1982 года по МПК A61D7/02 

Изобретение относится к искусств ному осеменению сельскохозяйственны животных. Известен способ оценки качества спермы сельскохозяйственных животны включающий измерение дыхания клеток полярографическим методом в среде инкубации до и после добавления в среду 2, - динитрофенола Г1. Состав среды инкубации в зависи. мости от вида клеток и целей определения различен; Обычно.применяют сложные многокомпонентные среды инкубации, в состав которых входят редкие и дорогостоящие реактивы. Та для оценки замороженно-оттаянной спермы хряка использовалась среда з мораживания ГХЦКУ, состоящая из глюкозы, хелатона, цитрата калия и унитиола. Для оценки устойчивости к замора живанию свежеполученной спермы этот способ не применялся. Присутствие В ГХЦКУ среде цитратов и унитиола, влияющих на дыхание, мешает оценке действия других веществ и делает невозможным применение предлагаемого способа для оценки свежеполученной спермы хряков. Цель изобретения - отбор неповрежденной устойчивой к замораживанию спермы. Поставленная цель достигается тем, что дополнительно определяют целостность внешней клеточной мембраны сперматозоидов по реакции дыхания на янтарат калия. Пример. 3-5 мл свежеполученной спермы через 1 ч после получения центрифугируют в течение 10 15 мин при 700 д. Плазму сливают и сперматозоиды ресуспендируют в таком количестве 0,25 М сахарозы, чтобы концентрация сперматозоидов суспензии составляла около 2 млрд. клеток на 1 мл. Дыхание суспензии спермато3зоидов измеряют полярографически в ячейках объемом на 1 мл при помощи платинового электрода. В полярогр фическую ячейку вносят последователь но 0,9 W1 61-ой глюкозы, 0,,11м суспензии сперматозоидов, 0,0250,05 мл 0,20 М янтарнокислого калия и 0,025 - 0,050 мл ДНФ в концентрации 10М. Полярографическую запись проводят для эндогенного дыхания (Vg), после внесения добавок янтарной кислоты Vq и 2, -ДНФ- , по 2 - 3 мин после каждой добавки. По кривой дыхания рассчитывают отношение скорости дыхания с янтарнокислым калием к скорости эндогенного

/VoHff дыхания L-и отношение скорости

ЭН дыхания с 2,Ц ДНФ к скорости дыхания

«АНФ с янтарнокислым калием .

Измерение скорости дыхания производят, определяя уменьшение тока

В делениях шкалы самописца, либо в ммкА кислорода после расчета цены деления самописца о

Добавка субстрата дыхания янтарнокислого калия используется в качестве пробы на целостность мембран сперматозоидов.

Установлено, что использование в качестве среды инкубации 5,9 6,1 глюкозы и последовательное введение в среду янтарнокислого калия в концентрации 5 г 15 мм и ДНФ в конечной концентрации 2,5 10 М дает возможность оценить проницаемость мембран и энергетическую систему сперматозоидов разных проб свежепйлученной спермы, так как при этом исключается влияние на дыхание присутствующих в ГХЦКУ среде цитратов и унитиола.. Одновременно максимально упрощается среда инкубации (фиг.1). .

На фиг,1 приведена полярограммавлияние янтарнокислого калия на дыхание сперматозоидов, инкубированных в ГХЦКУ среде и а глюкозе. Стрелками показаны моменты введения сперматозоидов (сп.) и добавок янтарнокислого калия и 2,А ДНФ„1В 6%-ой глюкозе янтарнокислый калий усиливает дыхание и имеется высокая стимуляция дыхания 2,-ДНФ. t} . В ГХЦКУ среде янтарнокислый калий не усиливает дыхание и ниже стимуляция дыхания 2, -ДНф-.

Установлено, что в свежеполученые интактные сперматозоиды янтарного калия позволяет оценить прочность регуляторных механизмов энергетической системы. При этом, чем выше стимуляция дыхания в сперме после

0 добавления 2,-ДНФ, тем она устойчивее к замораживанию (табл.2).

На фиг.2 приведены полярограммы: I, Сперма пригодна к замораживанию -янтарнокислыйкалий не усиливает дыхание,чнк/эн 1 и имеется высокая

стимуляция дыхания 2,4-ДНф k. И . Сперма не пригодна к замораживанию - не имеется стимуляции дыхания янтарнокислым калием,

0-/Уэ :,1, но слабая стимуляция 2,4-ДНФ, Ч нФ/Ч1НК . Ji . Сперма непригодна к замораживанию, имеется стимуляция дыхания янтарнокислым калием 1) 1 , и не высокая стимуляция дыхания

5 2,, УА„ф/Уя„ 2.

П р и м е р 2. Было исследовано дыхание и влияние на дыхание сперматозоидов 2,-ДНФ 80 эякулятов от 11 хряков совхоза Детскосельский.,После

0 замораживания и оттаиЪания этих эякулятов проверена их оплодотворяющая способность. Установлена вдсокая и достоверная корреляция между величиной стимуляции дыхания 2,А-ДНФ в

5 сперме и оплодотворяющей способностью этих эякулятов (,71 при piO,001 . Из денных табл.3 следует, что, если, стимуляция дыхания в свежеполученной сперме выше. 3,6-4,2, то оплодотворяющая способность 60.

Предлагаемый способ оценки качества спермы -имеет преимущества перед имеюи4имися способами оценки по активности, концентрации, устойчивости к температурному шоку, так как этот способ является более объективным, имеет графическую регистрацию результатов, является более точ1 0 кислый калий не- проникает и не усиливает дыхание. Усиление дыхания имеет место в случае увеличения проницаемости мембран сперматозоидов при повреждении, например при температурном шоке (табл.1). Если в свежеполученной сперме имеет место усиление дыхания после добавления янтарнокислого калия, сперма не пригодна к замораживанию. Таким образом, проба на янтарнокислый калий увеличивает точность определения и позволяет сразу отбраковать сперму с нарушенной проницаемостью мембран. Добавка 2,4-ДНФ после янтарнокислоным (высокая связь с оплодотворяющей способностью) и дает возможность быстро оценить сперму время оценки, как и при определении температурного шока, составляет 10-15 мин). « Использование предлагаемого способа позволит уменьшить затраты труда на замораживание нерезистентВлияние янтарнокислого калия на дыхание свежеполученных Х

267 t 20, i19,7

2kQ ± 28,0531 ±11,5

215 ± 28,5385 ±15,8 228 ± 31, 116,7 120 t 21,0307 tI8,ij

117 t 10,0526 t15,0 135 t 16,1323 t39,0 79 ± 6,10295 t13,0

± 12,029 t17,0

99 ± 9,1028 4 130,1

125 t 13,0267 ,0 938

Таблица

33,3

,08 50,0 ,25 21,3 ,23 1,3 0,20 50,0 0,07 76,9 0,10 35,7 0,18 80,0 0,20 85,7 0,38 3Q,0 0,18 12,5 0,21 сперматозоидов и после температурного шока Сперма Кол-во Скорость дыхания в ммкА0|2/мин УянкУлнФ опытов ;г-1-- -,- I яикЧ 1-Р Свежеполученная 15 273±7б,5 ,0 8l9t10.,3 1,0 3,1 Подвергнутая шо-, ку1592±29Л170± 6,7 3521102,41,82,0 . Влияние 2,+-ДНФ на дыхание спермы подопытных хряков и ее оплодотворяющая способность после замораживания-оттаивания ряк С в е ж е .п о л у ч е н н а яЗамороженноСкорость дыхания в ммкА-Оп/мин на 1 млрд.СП. оплодотворения ,. 9НК. I VSHK 90 ного семени и повысить оплодотворяемость от осеменения замороженно-от таянной спермой, что способствует ускорению внедрения метода в Мроиэводство. Способ может быть использован для оценки спермы при разработке различных методов ее сохранения. Таблица 2 оттаянная

7938990

Прогнозирование оплбдотворяющей способности замороженно-оттаянной спермы хряков

Таблица 3

Формула изобретения

Способ оценки качества спермы сельскохозяйственных животных, преимущественно хряков, включающий полярографическую, оценку энергетической системы сперматозоидов в среде инкубации по реакции дыхания на 2,динитрофеИол, отличающийс я тем, что, с целью отбора неповрежденной устойчивой к замораживанию спермы, дополнительно определяют целостность внешней клеточной мембраны сперматозоидов по реакции дыхания на янтарат калия.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 25 1. -Бюллетень ВНИИРГЖ, Л., 1978, вып.33, с,28-30.

«S

и

м

got efiuOMt t ZtJ