СПОСОБ ОЦЕНКИ БИОЛОГИЧЕСКОЙ ПОЛНОЦЕННОСТИ СПЕРМАТОЗОИДОВ Российский патент 1997 года по МПК A61D19/02 

Изобретение относится к области искусственного осеменения сельскохозяйственных животных, в частности к способам оценки семени производителей, например быков.

Известен способ оценки биологической полноценности сперматозоидов по интенсивности их энергетического обмена, а именно по интенсивности дыхания, измеряемой полярографическим методом в среде инкубации до и после добавления в нее 2,4-динитрофенола (2,4-ДНФ). (Бюллетень ВНИИРГЖ. Вып. 33. Л. 1978, с. 28 30). Способ позволяет оценить замороженно-оттаянное семя, например, хряка. Однако для инкубации здесь применяют сложные многокомпонентные среды, в состав которых входят редкие и дорогостоящие реактивы. С другой стороны, присутствие в таких средах цитрата и унитиола, влияющих на дыхание сперматозоидов, снижает эффективность названного способа.

Наиболее близким по техническому результату к предлагаемому является способ оценки биологической полноценности сперматозоидов по морфо-функциональному состоянию мембраны, определяемому по степени проницаемости через них в эндоцеллюлярное пространство янтарата калия и последующего вызванного им изменения интенсивности дыхания. Этот способ предусматривает использование в качестве среды инкубации 5,9 6,1% раствора глюкозы и последовательное введение в среду янтарнокислого калия в концентрации 5 15 мМ и 2,4-ДНФ в концентрации 2,5•10^-5 - 5•10^-5 М. Дыхание сперматозоидов измеряют в ячейках объемом на 1 мл с использованием платинового электрода. По кривой дыхания рассчитывают отношение скорости дыхания с янтарнокислым калием к скорости эндогенного дыхания и отношение скорости дыхания с 2,4-ДНФ к скорости дыхания с янтарнокислым калием. Измерение скорости дыхания производят, определяя уменьшение электрического тока в делениях шкалы самописца, либо и в ммкА кислорода после расчета цены деления самописца.

Проба на янтарнокислый калий увеличивает точность определения и позволяет выявить семя с нарушенной проницаемостью мембран. Добавка 2,4-ДНФ после янтарнокислого калия позволяет оценить прочность регуляторных механизмов энергетической системы, в частности, чем выше стимуляция дыхания в семени после добавления 2,4-ДНФ, тем оно устойчивее при замораживании-оттаивании (а. с. СССР N 938990, кл. A 61 D 19/02, 1982). Однако данный способ сравнительно сложен, требует дорогого оборудования и высокой квалификации исполнителей. Для оценки семени требуются значительные затраты времени 10 - 15 мин.

Цель настоящего изобретения повышение эффективности оценки биологической полноценности сперматозоидов.

Технический результат заявленного изобретения достигается тем, что предложен способ оценки биологической полноценности сперматозоидов, включающий определение степени проницаемости их плазматических мембран, причем особенностью способа является то, что степень проницаемости мембран измеряют по концентрации ионов калия в семени до и после добавки в него средства, разрушающего плазматические мембраны сперматозоидов, например дигитонина, причем для использования допускается семя при отношении концентраций ионов калия до и после добавки дигитонина не менее 1,4.

Известно, что функциональное состояние мембран связано с трансмембранным градиентом концентрации ионов K⁺ и Na⁺, создаваемым специальным мембранным насосом. K⁺-Na⁺-зависимая АТФ-аза биологически полноценных мембран выкачивает из эндоцеллюлярного пространства Na⁺, а из внешней среды, наоборот, закачивает в клетку K⁺, создавая таким образом трансмембранный электрический потенциал (Я. Кагава. Биомембраны. М. Высшая школа, 1985). Ухудшение функционального состояния мембран и соответственно их избирательной проницаемости вызывает перераспределение этих ионов между эндоцеллюлярным пространством клеток и внешней средой в сторону снижения или даже полного устранения градиента концентраций, то есть K⁺ выходит из сперматозоидов, а Na⁺, наоборот, входит в сперматозоиды. Следовательно, по величине трансмембранного градиента этих ионов можно судить о структурной и функциональной полноценности плазматических мембран сперматозоидов.

Для определения соотношения отдельных ионов и экзо- и эндоцеллюлярных пространствах клеток используют ионоселективные электроды.

Согласно заявленному способу для измерения концентрации K⁺ и Na⁺ используют ионоселективный электрод в сочетании с серебряным электродом сравнения и милливольтметр, например pH-150.

Пример 1. Из эякулята быка берут пробу 0,01 0,2 мл и в 100 раз разбавляют специальной буферной средой следующего состава: трис(оксиметил)аминометан (основание) 2,42 г; лимонная кислота 1,34 г; глюкоза 0,1 г; дистиллированная вода 100 мл.

Ионоселективный электрод с электродом сравнения погружают в разбавленное семя и измеряют электрический потенциал (ЭДС). Затем для разрушения мембран сперматозоидов к образцу добавляют дигитонин, 3 5 капель 5% спиртового раствора на 10 мл разбавленного семени, перемешивают и вновь проводят измерение ЭДС.

Дигитонин, связывая холестерин мембран, нарушает их проницаемость и блокирует работу мембранных насосов. Это приводит к утечке ионов по градиенту и к выравниванию экзо- и эндоцеллюлярных концентраций. Соответственно первое измерение электрического потенциала отражает концентрацию ионов в жидкой части семени, второе усредненную концентрацию в плазме и сперматозоидах. По разнице концентраций до и после добавки дигитонина судят о трансмембранном градиенте и соответственно о биологической полноценности сперматозоидов.

Пример 2.

На ферме госплемзавода "Коммунарка" Ленинского района Московской области в 1992 году изучили результаты 1300 осеменений коров по данным ректальных исследований семенем 13 быков Центральной станции искусственного осеменения после предварительного измерения градиента концентрации ионов калия относительно плазматических мембран сперматозоидов (табл. 1).

Для выяснения связи между градиентом концентрации K⁺ относительно плазматических мембран сперматозоидов и потенциалом воспроизводительной способности быков были выполнены корреляционный и регрессионный анализы (табл. 2).

Как видно из табл. 2, статистически достоверная корреляция с результатами осеменения обнаружена лишь с трансмембранным отношением концентраций ионов калия, а именно с отношением концентрации в цельном семени (после добавки дигитонина к концентрации в плазме семени (до добавки дигитонина). На основании полученных корреляций можно составить следующее регрессионное уравнение прогноза результативности искусственного осеменения:

где K отношение концентрации калия в семени после добавки дигитонина к концентрации до добавки: K II I, Y потенциал биологической полноценности семени, выраженный как процент стельных коров от числа осемененных.

Соответственно существующему правилу для использования в искусственном осеменении допускаются быки с репродуктивным потенциалом, обеспечивающим не менее 50% стельности. В связи с этим требованием к биологически полноценному пригодному для использования следует относить семя, при тестировании которого отношение концентраций K⁺ до и после добавки дигитонина (K) составляет не менее 1,4.

Для проверки степени точности определяемого по вышеприведенному уравнению потенциала воспроизводительной способности отдельных быков фактическая результативность осеменений по нескольким хозяйствам Московской области была сопоставлена с прогнозируемой (табл. 3).

Как показывают данные табл. 3, разница между прогнозом и фактической результативностью осеменения в целом не существенна, хотя абсолютного совпадения не наблюдается. Отклонения эти вполне понятны, поскольку в каждом конкретном случае на результаты осеменений действовало множество факторов, не связанных с качеством семени и воспроизводительной способностью быков. Абсолютно точный прогноз любым способом, в том числе и предлагаемым нами, может быть получен только в стандартных условиях и на стандартных матках. Вместе с тем в обычных условиях предлагаемый нами метод позволяет выявить существенную разницу репродуктивного потенциала быков и ранжировать их по этому показателю. Вычисленные значения прогноза могут быть использованы в селекции для определения рейтинга производителя по потенциалу воспроизводительной способности.

Способ применим в практике работы элеверов по выращиванию и оценке быков-производителей и станций искусственного осеменения сельскохозяйственных животных, а также в научных исследованиях.

Использование: животноводство, а именно искусственное осеменение сельскохозяйственных животных. Сущность изобретения: с целью повышения эффективности способов оценки биологической полноценности отдельных эякулятов и воспроизводительного потенциала самцов, например быков, предложен способ определения морфо-функционального состояния плазматических мембран сперматозоидов по концентрации ионов калия в жидкой части семени до и после добавления в него средства, разрушающего плазматические мембраны сперматозоидов, например дигитонина. Прогнозируемая результативность осеменения достаточно высоко и статистически достоверно коррелирует с результатами искусственного осеменения. 1 з.п. ф-лы, 3 табл.

1. Способ оценки биологической полноценности сперматозоидов, включающий определение степени проницаемости их плазматических мембран, отличающийся тем, что степень проницаемости мембран определяют по концентрации ионов калия в жидкой части семени до и после добавления в семя разрушающего мембраны сперматозоидов средства, причем для использования отбирают семя при отношении концентрации ионов калия не менее 1,4. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве средства, разрушающего мембраны сперматозоидов, используют дигитонин.