Способ идентификации ингибиторов протеиназ Советский патент 1985 года по МПК C12Q1/38 

|

сх

Ч

05

Изобретение относится к биохимии растений и может быть использовано также в области генетики, селекции и защиты растений, биохш-ши питания и кормления.

Цель изобретения - повышение чувствительности и упрощение способ

Пример. Идентификация ингибиторов трипсина среди белков зерна пшеницы.

Зерно пшеницы размалывают, навеску муки зДпивают 4-кратным объемом 2 М мочевины и выдерживают 18 ч при 4 С. Смесь центрифугируют, осадок отбрасывают.

Изофокусирование белков проводят ,в пластине полиакриламидного геля 125Х250 0,2 мм на приборе типа Мултифор фирмы LKB (Швеция) или другом приборе для изофокусирования. Состав геля: 6% акриламида, 0,28% метиленбисакриламида, 1% амфолитов типа Сервилат (Serva, ФРГ), можно также использова.ть амфолиты других фирм, например Амфолины (LKB ), с интервалом рН 2-11. Гель полимеризуют на свету после дегазации, добавив к 10 мл раствора геля 0,5 МП раствора рибофлавина (10 мг/100 мл) и 20 мкл ТЕМЕДа. Экстракт белков зерна наносят на гель каплями объемом 0,5-25 мкл на образец. Поскольку ингибиторы трипсина отличаются у фазных сортов и видов пшениц по компонентному составу и активности, объем Ъкстракта нужно подбирать в каждом отдельном случае для того, чтобы получить контрастный спектр ингибиторов. В описываемых условиях следует наносить 6-9 мкл экстракта из муки мягкой пшениЩ) сорта Безостая Т, твердой пшеницы 20-25 мкл, диплоидной однозернянки 0,5-1,0 мкл. На одной пластине анализируют одновременно 24 образца (1 см на образец) или 48 образцов (по 0,5 см). На гель накладьшают электродные полоски, смоченные 1 М NaOH (-) и 1 М HjPO (+). Сверху накладывают крьш1ку с

платиновыми- электродами. ИзофокусироваНие ведут 2,5 ч при постоянной мощности тока 10 В. Конечное напряжение 1800 В. Электродные полоски удаляют вместе с тем участком гля, на котором они лежали. На гель накладьшают лист гладкой фильтровальной бумаги, смоченной раствором трипсина (0,03 мг/мл, фирма Spota, Чехословакия) в 0,2 М фосфатном буфере рН 8,0. Оптимальный рН трипсина около 8,0-9,0. Гель накрывают полимерной пленкой для предотвращения высыхания. Через 15 мин бумагу убирают и на гель накладывают фотопленку типа Фото-65, предварительно смочив гель фосфатным буфером. Сверху накладьюают жесткую полимерную пленку для предотвращения подсыхания и деформации краев фотопленки и выдерживают в термостате 35 мин при . Под действием фермента, адсорбированного поверхностью геля, желатин разрушается, что можно контролировать по появлению мутной жидкости из-под краев фотопленки. Можно также просматривать гель с пленкой на свету, не наклоняя гель. Момент завершения инкубации определяется по мере пояления различных полос - неразрушенными остаются лишь участки слоя желатина, соответствующие ингибиторам данной протеиназы. Фотопленку снимают с геля, накладывают на нее влажную фильтровальную бумагу, которую затем подсушивают листом сухой фильтровальной бумаги. Фотопленку отделяют от бумаги. Зоны, соответствующие ингибиторам трипсина, обнаруживаются на фотопленке в виде темных полос на прозрачно фоне. Фотопленку подсушивают на воздухе и фотографируют в проходящем свете. Ингибиторы можно также выявить на фильтровальной бумаге, которую накладывали на фотопленку после инкубации.Ингибиторам соотв, ствуют светлые полосы на темном фоне

СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ ИНГИБИТОРОВ ПРОТЕИНАЗ путем фракционирования белка в гелях, отличающ и и с я тем, что, с целью повышения чувСтвительно(:ти и упрощения способа, на разделяющий гель после фракционирования накладывают лист фильтровальной бумаги, смоченной раствором протеиназы в буфере с рН, оптимальным для используемой протеиназы, и с активностью протеиназы, соответствующей активности трипсина в концентрации 0,0250,05 мг/мл, через 10-30 мин бумагу удаляют, на гель накладывают фотопленку типов Фото или Аэропленка и инкубируют до визуального обнаружения на фотопленке полос неразрушенного желатина, снимают фотопленку с геля, накладьшают на нее лист влажной фильтровальной бумаги и идентифицируют ингибиторы по зо. нам неразрушенного желатина в виде i темных полос на прозрачном фоне фотопленки или светлых полос на (Л темном. фоне на фильтровальной бумаге.