ческой потребности в кислороде то снижение ХПК-, интенсивность обеих фаз нитрификации и развитие микрофау ..ны может лимитироваться не только I токсичностью испытуемой жидкости, но и недостатком кислорода. Чувствитель ность способа таким образом зависит от реальных условий и варьирует в за висимости от них. Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности является способ определения степени воздействия на микрофлору активного ила физических и химических факторов внеш ней среды, предусматривающий контактирование опытных и контрольных образцов микрофлоры с субстратом-ацетатом натрия в аэробных условиях, фиксацию результатов окисления субстрата путем непрерывной регистрации изменения во времени показателей 02 и/или рН и сравнение продолжительности окисления субстрата по времени потребления кислорода и/или подкисления среды в контрольных и опыт ных образцах . Стандартная доза субстрата ЛОО мг/л, фиксирование результатов окисления субстрата производится на диаграммной ленте в виде интегральной кривой с последую щим пересчетом в дифференциальную форму. Вывод о токсичности вещества делается по увеличению времени окисления стандартной дозы ацетата натрия С2 . Недостатком известного способа является то, что при рекомендуемой дозе тест-субстрата время окисления даже в отсутствие токсина составляе 50-70 мин, а это не позволяет обнарухси.ватьвоздействие факторов среды, резко и в короткий промежуток време ни угнетающих дыхание микрофлоры активного ила или оказывающих обрат мое воздействие, т.е. сужает перечень задач, которые можно решать с его помощью. Целью 13обретения является повышение точности определения степени воздействия факторов среды на микро флоре активного ила. Указанная цель достигается способом определения степени воздействия на микрофлору активного ила физ ческих и химических факторов внешней среды, заключающимся в контакти ровании подвергнутых воздействию фа тора fопытных) и контрольных образцов микрофлоры с субстратом в условиях аэрации, фиксации результатов кисления субстрата путем непрерывной регистрации во времени показателей рН и сравнении продолжительности окисления субстрата по времени потребления кислорода и/или подкисения среды в контрольнь1х,.и опытных СЗразцах, причем в качестве субстрата используют фенол или его оксипроизводные при концентрации 10-30 мг/л. При этом, с целью определения обратимости воздействия фактороввнешней среды на микрофлору активного ила, контактирование образцов с субтратом осуществляют как сразу после воздействия фактора, так и в интервале до k8 ч после воздействия. С целью обеспечения определения степени воздействия факторов среды в зависимости от окислительно-восстановительных условий, часть образцов выдерживают перед контактированием с субстратом в условиях аэрации, а часть - в бескислородных условиях. При окислении фенолокисляющей микрофлорой избытка субстрата, т.е. при концентрации фенольных соединений (фенол, крезолы) в пределах 10-30 мг/л последние миллиграммы этих соединений окисляются с возрастающей скоростью. Это дает возможность более точной регистрации (до с) момента-завершения окисления, при котором потребление кислорода и выделение двуокиси углерода микрофлорой резко и синхронно замедляются, что повышает чувствительность определения .. При использовании в качестве субстрата феиольных соединений момент резкого замедления потребления кислорода и синхронного с ним уменьшения подкисления jMI среды свидетельствует об исчерпанности субстрата, поскольку после начала движения указателей 02 и рй в сторону повышенных значений этих параметров летучие фенолы в жидкой фазе образца микрофлоры аналитически не обнаруживаются. Другим средством слежения и контроля действительной исчерпанности субстрата может служить внесение в образц1з1 микрофлоры 1-2 мг/л фенольных соединений, сопровождаемое появлением на кривой 02 и рН ступенчатого изгиба лишь в том случае, если потребление кислорода и подкислёниё среды уже уменьшились, что объясняется ак тивизацией ферментных систем микроорганизмов вследствие появления в о ружающей среде нерначительного коли чества субстрата, дополнительного п требления кислорода И выделения дву окиси углерода. В случае, если микрофлора исследуемого образца или очистного соору жения не реагирует на внесение 10-30. мг/л фенольных соединений уск рением потребления 2 или подкислен 1Й, то для решения поставленной зад чи микрофлору необходимо предварительно адаптировать к этим соединениям, что достигается использова- нием известных технических решений, приемов. . При внесении в образцы микрофлоры 10-30 мг/л фенольных соединений время потребления кислорода и подкисления среды колеблется в предела 1-15 мин, что позволяет обнаруживать, воздействие факторов среды, ре ко угнетающих дыхание микрофлоры активного ила. Проведение определения сразу после воздействия и в интервале времени до 8 ч расширяет возможности спо соба, позволяя различать факторы, воздействующие обратимо, от факторов при которых воздействие и эффект разнесены во времени. Часть контрольных и опытных образ цов выдерживают до внесения.субстрата в бескислородных условиях, причем, в этом случае, субстрат вносят спустя 5-10 мин после возобновления аэрации. Состояние-и активность ферментных систем микроорганизмов зависят от окислительно-восстановительных условий. Поэтому выдерживание образцов микрофлоры в аэробных и анаэробных условиях дает возможность выявить факторы среды, воздействующие в этих условиях различным образом. Предварительная мин аэрация образцов микрофлоры восстанавливает использование молекул кислорода в качестве акцептора электронов и в то же время при удалении образовавшейся двуокиси углерода кривая jSi перемещается в область нейтральных значений и выше, где момент резкого замедления выделения микрофлорой двуокиси углерода и поворот указателя рН в сторону повышенных знамений МОЖНО зарегистрировать с большей точ ностью. С целью упростить ход определения и исключить побочные воздейст1вия, бескислородные условия создают за счет потребления кислорода мИкррфгюрой активного ила в объеме образца. Использование для обескислороживания образцов микрофлоры продувки газом, например азотом, может усложнять ход определения, а использование для этой цели общепринятых реагентов, например NOjSO и GoCl2, может исказить результаты определения. Способ осуществляют следующим образом ., Активный ил аэрационного сооружения, окисляющего фенольные соединения (фенол, крезолы) , или адаптиро- ванную к этим соединениям микрофлору разливают в стеклянные сосуды емкостью до 1 л. . . Емкость применяемых при определении сосудов и количество необходимого активного ила определяются размерами датчиков. При использовании для регистрации потребления кислорода анализатора растворенного кислорода типа ЭГ-152003, оптимальный объем ила равен 1л. Для регистрации подкисления среды с использованием рН-метра типаЛПУ-01 и потенциометра КСП- для каждого образца берут 0,1 л активного ила или адаптированной микрофлоры с концентрацией биомассы по сухому веществу (при 105 С) в пределах 1-5 г/л. Определение начинают с регистрации на диаграммной ленте кривых потребления кислорода и подкисления среды при внесении субстрата в контрольный образец микрофлоры. Предварительно в образец до дна опускают резиновую трубку, оканчивающуюся стеклянным капиляром или керамическим распылителем, подсоединенную через ротаметр к воздушной инии или микрокомпрессору, например, ипа МК-Л2. При аэрации образца с расходом воздуха в пределах 0,3,5 л/мин погружают в него на 1/2 , лубины сосуда датчик анализатора кисорода и/или на 1/2 длины электрод Н-метра. Температуру образцов при опредеении поддерживают постоянной с поощью автоматического регулятора, апример, типа ЭРА-М. При аэрации образцов микрофлоры кривая потребления кислорода переходит на плато, определяемое расходом кислорода на эндогенное дыхание Кривая jiH в этом случае сдвигается в сторону более высоких значений .за счет удаления имеющейся и выделя щейся объемом биомассы микрофлоры двуокиси углерода. Когда температура образца микрофлоры достигает требуемого значения в пределах , в него вносят фенольное соединение ( водный раствор) из расчета 10-30 мг/л и включают секундомер. В результате значительного возра тания скоростей потребления кислоро да и выделения микрофлорой активного ила двуокиси углерода кривые 02 и рН подвигаются в сторону (соот ве ственно) нулевого значения 0 и более кислых значений рН. Завершение потребления 0 и синх ронного с ним выделения двуокиси углерода регистрируется началом дви жения указателя в противоположную сторону и в этот момент секундомер останавливается. Внесение в образец микрофлоры в любой момент после начала дв иже:нйя указателя потенциометра в проти воположную сторону хотя бы 1 мг/л субстрата приводит к дополнительном потреблению кислорода и выделению двуокиси углерода,что-всегда сопровождается замедлением движения указ теля и.появлению на кривой 02 и рН ступенчатого изгиба. Эти данные сви детельствуют о действительном завер шении окисления внесенного ранее в количестве 10-30 мг/л субстрата и о исчерпанности. Исходя из времени, затраченного на потребление Q или подкисление , среды, расчитывают скорость (мг/л-ч окисление субстрата и скорость окис ления внесенного в контрольный образец субстрата принимают равной 100. Такие же измерения производят с образцами микрофлоры сразу и в интервале времени до i8 ч после воздействия и по изменению в скорости ;(ч) окисления оценивают степень воз действия. Приведенные примеры определения воздействия на фенолокисляюиою микрофлору структурных аналогов, корот коволнового излучения в области 25 нм, водных растворов тяжелых металлов, подогрева и .10 минутного кипячения иллюстрируются в большинстве случаев кривыми потребления 02 и рП. П р и м е р 1. Воздействие на окисление фенола предварительного внесения в образец микрофлоры 0-ксилола. Условия определения: концентрация активного ила по сухому веществу 2,07 г/л; расход воздуха на аэрацию 1,5 л/мин; t 30°C-Con5t. На фиг. 1 изображены кривые потребления кислорода, полученные с использованием анализатора растворенног9 кислорода типа ЭГ-152-003 и потенциометра ПСР-01 при скорости движения диаграммной ленты 60 мм/ч. В табл. 1 представлены значения скоростей окисления фенола в концентрации 10 и 30 мг/л до и после внесения в точке 3 60 мг/л 0-ксилола. Из данных табл. 1 следует, что окисление 30 мг/л фенола, внесенного в образец микрофлоры в точке 2 со скоростью, примерно в 1,5 раза меньшей скорости окисления 10. мг/л фенола (точка 1) вызвано ингибированием окисления фенола избытком субcTpaja. Окисление же 30 мг/л фенола (точка 5) со скоростью в 1,5 раза большей объясняется временным ингибированием окисления фенола в присутствии 0-ксилола. При определении воздействия на потребление Og предварительного внесения в виде эмульсии 500 мг/л 0-ксилола, кривая потребления кислорода в течение tO мин находится на уровне эндогенного дыхания несмотря на то, что 30 мг/л фенола вносят в образец микрофлоры через 2 мин после внесения 0-ксилола. Кислород на окисление фенола начинает потребляться с возрастающей скорсотью лишь спустя ЦО мин после внесения и в течение последующих 20 мин окисляется полностью. Обратимость воздействия предварительно добавленного О-ксилола на окисление фенола и отсутствие реакции микрофлоры на о-ксилол в условиях эксперимента позволяют допустить, что структуры, осуществляющие начальный метаболизм фенола, содержатся в клеточной стенке микроорганизмов или цитоплазматической мембране. Тогда обратимость воздействия о-ксилолa можно объяснить летучестью О-ксилола и непрочностью образовавшихся химических связей. Прим ер 2. Воздействие на окисление о-крезола предварительного внесения в. качестве структурного аналога анилина. Опыт 1: концентрация биомассы ми рофлоры 3 г/л; аэрация с расходом воздуха 1,5 л/мин; . Опыт кон центрация биомассы 2-2,8 г/л; аэрация 1 ,5 л/ мин; . На фиг. 2 и 3 изображены кривые потребления 02 до и после внесения в виде го водного раствора 10 мг/л анилина.. . Значения скоростей окисления 10 мг/л (л-крезола (табл.. 1) показывают, что в опыте 1 в присутствии 10 мг/л анилиза скорость уменьшается примерно в 10 раз, а в опыте 2 в раз. Определение воздействия анилина на окисление м-крезола показывает, что в отличие от О-ксилола анилин до суток ингибирует потребление кис лорода . П р и м е р 3. Определение возде ствия на микрофлору активного ила одночасового облучения в условиях аэрации бактерицидной лампой БУВ-30 и защитного действия сульфаииловой кислоты, не влияющей на окисление УГкрезола.. Концентрация подвергнутой воздей ствию КУФ микрофлоры 2,25 г/л; аэра ция 1,5 л/мин; температура при внесении субстратов 35°С. Колбы из кварцевого стекла с опыт образцами в течение 1 ч облучают открытой лампой БУВ-30 облучателя . На фиг. 4 изображены кривые not требления кислорода при внесении в образец микрофлоры м-крезола, бутано ла и ацетата натрия сразу после облучения (а), спустя k ч (б) и спустя 16 ч (в). На фиг. 5 представлены .кривые потребления 02 при окислении тех же субстратов образцом микрофлоры, в который до облучения вносят 150 мг/л сульфаниловой кислоты, сразу после облучения (а) и спустя 16 ч (б) по сравнению с контрольным образ цом через 16 ч (в). Результаты определения (табл. 1) показывают, что через 16 ч после облучения КУФ в области 25 нм скорость окисления субстратов уменьщает 0510 ся на от контроля, а в присутствии сульфаниловой кислоты - ма 10-28%. Пример). Определение воздействия на микрофлору, окисляющую J -крезол, тяжелых металлов (медь, серебро),которые вносят в виде водных растворов солей ОлЗОд. и из расчета 3 мг/л Ag. Контрольные и опытные образцы выдерживают до внесения субстрата в кислородных и бес илородных условиях. На фиг. 6 изображена динамика кривых р после внесения в точках 1 и 2 соответственно 10 и 30 крезола. Б табл. 2 приведены значения времени подкисления и расчетной скорости окисления w-крезола на следующий день после добавления в опытные образцы водных растворов солей металлов. Результаты определения показывают, что воздействие меди на окисление микрофлорой м-крезола более резко проявляется при выдерживании образца в бескислородных условиях, тогда как серебро во много раз снижает скорость окисления внесенного субстрата при предварительном выдерживании микрофлоры в кислородных условиях. После 16 ч выдерживания образца (б) в кислородных условиях прекращение на 1 ч аэрации удлиняет время окисления 10 и 30 мг/л w-крезола (фиг. 6, в). Образец 3 после 16 ч выдерживания в бескислородных условиях через 1 ч. аэрации окисляет м-крезол примерно с такой же скоростью (фиг. 6, и). При добавлении в точке Д 3 1 мг/л w-крезола движение указателя замедляется, что свидетельствует об исчерпанности внесенных в точке 2 31 мг/л A-крезол а. П р и м е р 5. Определение зависимости проявления бактерицидности меди от времени выдерживания образца в бескислородных условиях; концентрация микрофлоры - 1,82 г/л; аэрация 1 л/мин; С. Результаты определения в виде переснятых с диаграммной ленты кривых рН скрость движения ленты мм/ч) представлены на фиг. 7, а значения скоростей окисления в табл. 2. При 10 мин выдерживании микрофлоы в бескислородных условиях скорость кисления 10-30 мг/л м-крезола сниается примерно на 1/5; при 25 мин более, чем наполовину, а при 1 ч 15 мин - почти в 20 раз. П р и м е р 6. Определение воздействия на микрофлору активного ил растворов солей меди и серебра в за висимости от условий выдерживания концентрация биомассы 2 г/л; аэрация 1.л/мин; t 25°С). Результаты определения подтверждают (.фиг. 8; табл. 2), что при вне сении в образцы 3 мг/л Ag в виде водных растворов солей, бакт рицидность меди и серебра проявляет ся во взаимоисключающихся условиях. 8 бескислородных условиях зарегистрировано снижение скорости окисления крезола на 85 за счет меди, а в кислородных - на 92 в присутствии серебра. Пример. Определение зависимости бактерицидности водных растворов меди и серебра от. концентрации металлов (концентрация биомассы г/л; аэрация 1 л/мин; ). Через 16 ч после добавления в опытные образцы 1 и 3 мг/л растворов солей Си иДд определяют вре мя подкисления среды при внесении 10 и 30 мг/л ГА-крезола. Результаты определения приведены в табл. 3. Из табл. 3 следует ,что время под кисления среды при внесении 10 и ЗС мг/л м-крезола увеличивается поч ти в 10 раз при воздействии меди в бескислородных условиях и серебра в кислородных, а при увеличении кон центрации добавленных в виде водных растворов меди и серебра в 3 раза время подкисления увеличивается для меди в бескислородных условиях в 15 раз и для серебра в кислородных условиях в 11 раз, т.е. отмечено непропорциональное увеличению конце трации усиление воздействия на микр флору активного ила водных растворо солей меди и серебра. П р и м е р 8. Воздействие на вр мя подкисления среды подогрева микрофлоры активного ила в пределах 20-52 0. Подогрев аэрируемого образца до требуемого значения температуры осу ществляют на водяной бане и контролируют ртутным термометром. Сразу после подогрева в стаканчик с образ цом микрофлоры помещают датчик рНметра и изменение рН среды при внесении в образцы 10-30 мг/л м-крезол регистрируют (при автоматической коррекции показаний) на диаграмме потенциометра КПС-4. Для температуры 40 и 45°С применяются не только подогрев, но и выдерживание образцов при такой температуре в течение 5 мин. Условия определения: концентрация биомассы 2,Об г/л; аэрация 1л/мин. Результаты определения отображены на фиг. 9 в виде кривых рН, а в табл. 2 представлены значения времени подкисления и скорости окисления 10 и 30 мг/л гл-крезола при подогреве до 40, 5, 7, 8, 30 и . Определение воздействия на микрофлору активного ила подогрева показывает, что в условиях опыта имеет значение не только температура, до которой образец однократно подогревается, но и время выдерживания образцов при данной температуре. При 40°С 5 минутное выдерживание не отражается на времени подкисления. Выдерживание образце при 45°С в Течение 5 мин увеличивает время подкисления в 1,5-2 раза, что примерно, равнозначно подогреву образца до 48°С. П р и м е р 9. Определение воздейс твия на микрофлору активного, ила 10 минутного кипячения (концентрация биомассы 3,5б. г/л; расход воздуха на аэрацию 1,5 г/мин, t 30 С). По времени потребления кислорода контрольным образцом расчитывают скорости окисления внесенных в концентрации 10-30 мг ацетона, ацетата натрия и м-крезола (фиг. 10, табл.- 1, точки 1-8). После 10 минутного кипячения вдвое сконцентрированный по биомассе образец микрофлоры выдерживают 3 сут в бескислородных условиях при 30°С. При возобновлении аэрации, (фиг. 11, точка 1-30°С) через 1,5 ч аэрации кривая потребления 02устанавливается на нулевом значении содержания кислорода, т.е. весь растворяющийся кислород расходуется на окисление автолизированной биомассы. На 20 часу аэрации в точках 2, 3и 4 (фиг. 11, табл. 1) вносят aijeтат натрия, ацетон и м-крезол. Поскольку внесение ацетона не отразилось на потреблении кислорода, а ацетат натрия и м-крезол окислялись с меньшими скоростями, то результат воздействия следующий: реакция микрофлоры активного ила на исIточники углерода после кипячения изменяется.
Описываемый способ целесообразно использовать при оценке токсичности подаваемых на очистные сооружения сточных вод, а также вновь синтезируемых органических соединений. Дос таточно высокая чувствительность способа дает возможность определения степени воздействия на микрофлору активного ила различных химических и физических факторов внешней среды.
Использование данного способа позволяет интенсифицировать изучение воздействия на микрофлору активного ила сточных вод, содержащих токсичные компоненты, а инструментальный характер определения создает предпосылки для автоматизации контроля за содержанием в сточных водах токсичных примесей в допустимых пределах .
Т а б л и ц а 1
17
18
998505 Продолжение табл. 1
сэ сз
о CD I-- ил LA vO
- - СО Г-« r LA ОО
CD О
о сэ
СП
о
СЭ ,- CD СЭ ОО
ОО
ОЛ с .- .- Г
CTv
I- со
ОО ОО ОО
00
о о
о о
о о
чО
vO
чО
2
2 О
О
cvl
CS4
Ю
m
Формула изобретения
Способ определения степени воздействия на микрофлору активного ила физических и химических факторов внешней среды, предусматривающий контактирование подвергнутых воздействию факторов (опытных) и контрольных образцов микрофлоры с субстратом в условиях аэрации, фиксацию результатов окисления су15страта путем непрерывной регистрации изменения во времени показателей 02 и/или рН и сравнение продолжительности окисления субстрата по времени потребления кислорода и/или подкисления среды в контрольных и опытных образцах, отличающийся тем, что, с целью повышения точности определения, в качестве субстрата используют фенол или его оксипроизвод.ные при концентрации 10-30 мг/л. 2. Способ по п. 1, о т л и ч а (Эщ и и с я тем, что, с целью определения обратимости воздействия факторов внешней: среды на микрофлору активного ила, контактирование образ-i цов с субстратом,осуществляют как. сразу же после воздействия фактора,
так и в интервале до f(8 ч после воздействия. .
. Способ по п. 1,отличающ и и с я тем, что, с целью обеспечения определения степени воздействия факторов среды в зависимости от окислительно-восстановительных услогвий, часть образцов выде рживают перед контактированием с субстратом
8 условиях аэрации, а часть - в бескислородных условиях.
Исто« ники информации, принятые во внимание при экспертизе
0.5
iJv /V .A/V.
Й5Iff /«,5
1015
г.О2,5
Время, час Риг.З
5: .e ,5 ii:e ns
Ярем, we .«Pirt.
п
7S
I
П W 7J 7.1
и 75
7,f
Фиг. 6
DH
a
M
e.7
W 7J
7/ 93
751
8 «f
J
75
Фиг.д
%
/
