МЕМБРАНОСТАБИЛИЗИРУЮЩЕЕ И АНТИОКСИДАНТНОЕ ЛЕКАРСТВЕННОЕ СРЕДСТВО "РИКАВИТ" Российский патент 1994 года по МПК A61K31/00 A61K31/52 

Изобретение относится к медицине, а именно к фармакологии, кардиологии и гериатрии.

В настоящее время в качестве мембраностабилизирующих и антиоксидантных средств в медицине используют препараты, непосредственно влияющие на мембрану клеток миокарда и проводящую систему сердца, - хинидина сульфат, новокаинаамид, этиозин, аймолин, ксикаин.

Например: лекарственные препараты, применяемые при сердечных и респираторных заболеваниях, при усталости и обладающие антитоксической активностью (- Изобретение за рубежом, 1972, МКИ А 61 к, 27/00, Заявка Франции 2086138); фармацевтический препарат, содержащий производные ксантина. (- Изобретение за рубежом, 1980, МКИ А 61 к, 31/52, патент США 4225607); глютамивит - новый поливитаминный препарат с глутаминовой кислотой и ионами металлов (- Новые лекарственные препараты. - Экспресс-информация, 1982, N 12, с. 2 - 9).

Из используемых и описанных в литературе по составу ингредиентов наиболее близок к заявленному средству Рибоксин ("Новый метаболический препарат рибоксин - результаты клинического излучения". - Экспресс-информация, 1979, N 4, с. 3 - 9).

Однако эта группа средств характеризуется значительным количеством побочных и токсических эффектов, ограничивающих их применение, особенно у лиц пожилого и старческого возраста. Применение в отдельности таких биологических активных веществ, как рибоксин, витамины, аминокислоты, является недостаточно эффективным при использовании их в качестве мембраностабилизирующих и антиоксидантных средств для людей старших возрастных групп.

Целью изобретения является расширение арсенала фармакологических средств, используемых в качестве мембраностабилизаторов и антиоксидантов, обладающих низкой токсичностью, высокой фармакологической эффективностью, что дает возможность применения предлагаемого лекарственного средства людям пожилого и старческого возраста.

Поставленная цель достигается тем, что в лекарственное средство, содержащее рибоксин, дополнительно вводят биологически активные вещества: рибофлавин, пиридоксин, никотинамид, аскорбиновую и глутаминовую кислоты, калия хлорид, при следующих соотношениях компонентов, мас. % : Рибоксин 33,33 - 36,47 Рибофлавин 0,70 - 0,83 Пиридоксин 0,70 - 0,83
Аскорбиновая кислота 7,04 - 8,29
Глутаминовая кислота 33,33 - 36,47 Никотинамид 3,33 - 3,65 Калия хлорид 17,59 - 18,24
Использование с указанной целью комбинации ранее применявшихся веществ стало возможным в результате установленной авторами более выраженной фармакологической активности и низкой токсичности предлагаемого лекарственного средства, по сравнению с рибоксином, заключающийся в нормализации внутри-внеклеточного содержания электролитов, повышении активности мембраносвязанных ферментов, снижении содержания продуктов перекисного окисления липидов в тканях.

Описанное действие обнаружено в результате исследований, проведенных на животных. Заявленное средство было испытано на белых крысах-самках двух возрастных групп: молодые (6 - 8 мес. ) и стаpые (26 - 28 мес. ).

П р и м е р 1. Предлагаемое лекарственное средство обладает чрезвычайно низкой токсичностью и полной безвредностью LD₅₀ его при оральном введении больше 15 г/кг. Длительное (шестимесячное) ежедневное введение предлагаемого лекарственного средства в терапевтической дозе - 0,35 г/кг и в 5 раз превышающей терапевтическую дозу - 1,75 г/кг, при следующем содержании компонентов, г: Рибоксин 0,05 и 0,25
Аскорбиновая кислота 0,01 и 0,05
Глутаминовая кислота 0,05 и 0,25 Рибофлавин 0,001 и 0,005 Пиридоксин 0,001 и 0,005 Никотинамид 0,005 и 0,025 Калия хлорид 0,025 и 0,0125 не оказывало токсического влияния на биохимические и морфологические показатели крови и тканей крыс.
П р и м е р 2. Предложенное лекарственное средство, не оказывая существенного влияния на электролитный состав почек, миокарда и крови у молодых крыс, способствует повышению внутриклеточного содержания калия и снижению натрия у старых животных, при использовании доз 0,5; 1,0 и 1,5 гкг при следующем содержании компонентов, г: Рибоксин 0,07 - 0,014 - 0,21
Асборбиновая кислота 0,014 - 0,03 - 0,043
Глутаминовая кислота 0,07 - 0,14 - 0,21 Рибофлавин 0,0014 - 0,003 - 0,0043 Пиридоксин 0,0014 - 0,003 - 0,0043 Никотинамид 0,007 - 0,0014 - 0,021 Калия хлорид 0,036 - 0,07 - 0,11
П р и м е р 3. Курсовое (14-дневное) введение предлагаемого лекарственного средства в дозах, указанных в примере 2, повышает активность мембраносвязанных ферментов (анилин-n-гидроксилазы, амидопирин-N-деметилазы, цитохромоксидазы, сукцинатдегидрогеназы, Na⁺K⁺ и Ca²⁺ АТФ-аз и содержания цитохрома Р-450) в тканях молодых и старых животных. Полученные данные свидетельствуют о мембраностабилизирующем действии препарата.

П р и м е р 4. При изучении влияния комбинированного лекарственного средства на содержание продуктов перекисного окисления (дозы см. пример 2) показано снижение содержания гидроперекисей липидов у молодых и старых животных, у которых исходные данные были повышены. Полученные данные свидетельствуют о выраженном антиоксидантном действии.

П р и м е р 5. При сравнении эффективности предложенного лекарственного средства в дозах, указанных в примере 2, и рибоксина показано, что предлагаемый препарат обладает более выраженным фармакологическим действием как мембраностабилизирующее и антиоксидантное средство по сравнению с рибоксином.

Экспериментальные данные свидетельствуют о том, что предложенное лекарственное средство не обладает токсическими свойствами по сравнению с другими мембраностабилизирующими и антиаксидантными средствами, проявляет более выраженную фармакологическую активность. Особенно эффективным препарат оказался в опытах на старых животных.

Создание такого лекарственного средства расширяет арсенал средств воздействия на живой организм, способствует нормализации обменных процессов, измененных при различных заболеваниях, вредных воздействиях и старении.

Изучение острой и хронической токсичности изучаемого препарата.

Остpая токсичность препарата изучена в опытах на белых мышах. Установлено, что пероральное введение препарата в дозе 1500 мг/кг не вызывает гибели животных и не сказывается на их поведении и состоянии. Действие комбинированного препарата на организм при длительном введении изучено на белых крысах. Препарат вводили орально в двух дозах: 350 и 1750 мг/кг в течение 6 месяцев. Результаты проведенных исследований показали, что ежедневно оральное введение препарата в течение 6 месяцев не оказывало влияния на массу животных и состав периферийной крови. Не изменилось при этом функциональное состояние печени и почек подопытных животных. Полученные данные свидетельствуют о низкой токсичности и безвредности препарата.

Изучение фармакологической активности препарата.

Для оценки эффективности изучаемого препарата в качестве мембраностабилизирующего и антиоксидантного средства изучено влияние его на следующие показатели:
Активность мембраносвязанных ферментов (транспортных АТФ-аз, оксидаз смешанной функции);
внутри-внеклеточные перераспределения электролитов;
содержание продуктов перекисного окисления липидов (гидроперекисей, малонового диальдегида).

Исследования выполнены на 60 белых крысах-самках двух возрастных групп - молодые (6 - 7 мес. ) и старые (24 - 26 мес. ). Препарат вводили один раз в сутки орально в дозе 500 мг/кг в течение 20 дней. После окончания опыта животных забивали декапитацией. Определялась активность транспортных (Na⁺/K⁺) АТФ-аз и Са⁺ АТФ-аз мембран миокарда, почек и активность ферментов эндоплазматического ретикулума печени (n-гидроксилазы, N-деметилазы, цитохрома Р-450).

Микросомальную фракцию миокарда, содержащую мембраны саркоплазматического ретикулума и плазматические мембраны выделяли модифицированным методом Kidwal.

Для определения общей АТФ-азной активности состав инкубационной пробы был следующим: 2 ммоль NaCl - АТФ, 5 ммоль MgCl₂ ˙ 6H₂O, 140 ммоль NaCl, 14 ммоль КСl, 20 моль трис НСl. Объем пробы составлял 2 мл. Конечная концентрация белка в пробе составляла 2,5 - 3,0 мг.

Для определения Mg²⁺ АТФ-азы в пробы добавляли не КСl, а 10^-4 м строфантина. Активность Na⁺/K⁺ АТФ-азы определяли по разности между общей АТФ-азной активностью и активностью Mg²⁺ АТФ-азы. Пробы инкубировали в течение 15 мин при 37^оС.

Для определения Са²⁺ АТФ-азы состав инкубационной среды был следующей: 5 ммоль АТФ, 5 ммоль трис НСl, 0,1 моль СаСl₂, 5 ммоль MgCl₂.

АТФ-азную активность определяли по количеству образовавшегося в пробе неорганического фосфата (ммоль на 1 мг белка за 1 ч инкубации).

Мембраны эндоплазматичеcкого ретикулума выделяли по методу И. И. Kарузиной, А. А. Арчакова. Об активноcти N-деметилазы амидопирина судили по количеству образовавшегося формальдегида. Реакция протекает при участии цитохрома Р-450 в присутствии НАДФ˙ Н и кислорода. Образовавшийся формальдегид определяли методом Nash.

Осадок мембран цитоплазматической сети суспендировали для определения содержания цитохрома Р-450 в среде выделения трис НСl буфера (рН-7,4), а для определения n-гидроксилазной активности анилина - в 1,15% растворе KCl (рН-7,4).

Содержание цитохрома Р-450 измеряли на регистрирующем спектрофотометре фирмы "Perkin Elmer" (Англия) с расчетом по молярному коэффициенту экстинции.

Скорость анилин-n-гидроксилазы определяли по количеству образовавшегося пара-аминофенола.

Содержание электролитов (калия, натрия) в эритроцитах, плазме крови, миокарде и почках определяли на плазменном фотометре. Внутриклеточное содержание электролитов рассчитывали по формулам Benson a. a. (1965).

Гидроперекиси лидипов определяли с помощью гидроцианита аммония, малоновый диальдегид - по реакции с тиобарбитуровой кислотой. Содержание продуктов перекисного окисления липидов исследовали в микросомальной фракции печени.

Все результаты проведенных исследований подвергались статической обработке.

Возрастные изменения активности ферментов мембран эндоплазматического ретикула анилин-n-гидроксилазы и содержания цитохрома Р-450 у крыс и влияние на них изучаемого препарата представлены на табл. 1. Анализ результатов проведенных исследований (табл. 1) свидетельствует о достоверном снижении с возрастом активности анилин-n-гидроксилазы, N-деметилазы и незначительном уменьшении содержания цитохрома Р-450 у старых крыс по сравнению с молодыми, что согласуется с данными Cato et al. , Corrod, Bgird.

Как видно из данных, представленных на табл. 1, курсовое введение комплексного препарата повышает активность анилин-n-гидроксилазы, N-деметилазы и содержание цитохрома Р-450 в мембранах эндоплазматического ретикулума печени как у молодых, так и старых крыс по сравнению с контрольными животными.

Изучение активности мембраносвязанных ферментов миокардиальных клеток (Na⁺, K⁺ АТФ-азы и Са⁺ АТФ-азы) показало, что у старых животных она была достоверно ниже, чем у молодых (табл. 2), что согласуется с результатами ранее проведенных исследований.

Введение комбинированного препарата увеличивало активность Na⁺K⁺ - АТФ-азы плазматических мембран миокарда у старых крыс. Активность Са⁺⁺ АТФ-азы на фоне приема препарата достоверно повышалась у животных обеих возрастных групп.

Аналогичные данные получены при изучении влияния комбинированного препарата на активность Na/K АТФ-азы мембранной фракции почек у молодых и старых крыс (табл. 3).

Как видно из представленных в таблице данных, под влиянием курсового введения препарата повышается активность фермента в почках крыс обеих возрастных групп.

Таким образом, результаты данной серии исследований свидетельствуют о том, что изучаемый препарат повышает сниженную при старении активность мембраносвязанных ферментов (транспортных АТФ-аз и т. д. в органах крыс, что свидетельствует о мембраностабилизирующем действии препарата. Это подтверждается данными, полученными при изучении влияния препарата на внутри-внеклеточное распределение электролитов (калия, натрия). Известно (Л. П. Купраш, 1974), что в процессе старения изменяется электролитный состав тканей - уменьшается внутриклеточное содержание калия и увеличивается натрия. Одной из основных причин указанных изменений является возрастное изменение механизмов активного транспорта ионов через клеточную мембрану, обусловленные снижением активности мембраносвязанных транспортных ферментов.

Изучено влияние препарата на содержание электролитов (калия, натрия) в миокарде, почках, эритроцитах и плазме крови у молодых и старых крыс.

Установлено (табл. 4 , 5), что под влиянием комбинированного препарата в исследуемых органах старых крыс достоверно повышалась внутриклеточная концентрация калия и снижалась натрия, приближаясь к таковым у молодых животных.

Вместе с тем, изучаемый препарат не оказывал существенного влияния на электролитный состав почек, миокарда и крови у молодых крыс. Полученные данные подтверждают мембраностабилизирующее действие препарата.

Влияние препарата на содержание продуктов перекисного окисления липидов изучено в опытах на 20 крысах-самках 6 - 7 месяцев и 20 животных (крысах-самках) в возрасте 24 - 26 месяцев.

Препарат вводили по той же схеме, что и в предыдущих сериях опытов.

Результаты проведенных исследований показали (табл. 6), что у старых животных повышается интенсивность окисления липидов в тканях, о чем свидетельствует увеличение конечного продукта реакции - малонового диальдегида в микросомах печени у старых крыс.

Под влиянием комбинированного препарата достоверно снижалось содержание одного из начальных продуктов перекисного окисления липидов - гидроперекисей липидов в микросомах крыс обеих возрастных групп. Содержание конечного продукта реакции - малонового диальдегида-существенно не изменялось у молодых крыс и снизилось у старых животных, у которых исходные цифры были повышены.

Приведенные данные свидетельствуют о том, что изучаемый препарат обладает антиоксидантным действием.

Сравнительное изучение эффективности комбинированного препарата.

Влияние комбинированного препарата на активность транспортных АТФ-аз и электролитный состав тканей сравнивали с влиянием рибоксина на данные показатели. Препараты вводили орально в равных дозах (500 мг/кг) в течение 20 дней. Установлено (табл. 7), что курсовые введения комбинированного препарата достоверно повышают активность Na⁺K⁺ АТФ-азы в микросомальной фракции почек у крыс обеих возрастных групп. При введении рибоксина повышение активности фермента отмечалось только у старых животных и было менее значительным.

Под влиянием комбинированного препарата (табл. 8) достоверно увеличивалась концентрация внутриклеточного калия и снижалась натрия в тканях старых крыс, в то время как рибоксин не оказывал существенного влияния на изучаемые показатели.

При сравнительном изучении антиоксидантного действия использовали рибоксин, аскорбиновую кислоту, калия глутаминат и α-токоферол-ацетат, обладающий антиоксидантным действием.

Результаты проведенных исследований (табл. 9) показали, что комбинированный препарат достоверно снижает количество малонового диальдегида в микросомальной фракции печени старых крыс.

При введении калия глунтамината снижение малонового диальдегида уменьшилось, однако в меньшей степени, чем под влиянием комбинированного препарата.

Под влиянием рибоксина снижение малонового диальдегида существенно не изменялось.

Таким образом, результаты проведенного сравнительного исследования свидетельствуют о том, что комбинированный препарат обладает более выраженной фармакологической активностью как мебраностабилизирующее и антиоксидантное средство, чем другие препараты, относящиеся к естественным метаболитам (рибоксин, калия глутаминат, витамины).

Экспериментальное изучение комбинированного препарата, содержащего рибоксин, рибофлавин, пиридоксин, аскорбиновую кислоту, никотинамид и калия хлоpид показало, что препарат обладает очень низкой токсичностью (LD₅₀ при пероральном введении, на белых мышах больше 1,5 г/кг) и оказывает выраженный фармакологический эффект, особенно у старых животных.

Курсовое введение препарата повышает активность микросомальных мебраносвязанных ферментов в тканях экспериментальных животных.

Предложенное лекарственное средство способствует повышению внутриклеточного содержания калия и снижению натрия в миокарде, почках и крови старых крыс, не оказывая существенного влияния на электролитный состав тканей миокарда животных.

При изучении влияния комбинированного препарата на содержание продуктов перекисного окисления липидов установлено снижение содержания гидроперекисей липидов в микросомах печени животных обеих возрастных групп, получавших препарат, а также снижение содержания малонового диальдегида у старых крыс, исходные цифры которого были достоверно выше по сравнению с молодыми.

При изучении сравнительной эффективности комбинированного препарата и других естественных метаболитов: ( α -токоферол - ацетата, рибоксина, калия глутамината, аскорбиновой кислоты) обнаружена более высокая фармакологическая активность изучаемого препарата.

Полученные данные свидетельствуют о том, что комбинированный препарат обладает выраженным антиоксидантным и мембраностабилизирующим действием. (56) Новый метаболический препарат рибоксин. Результаты клинического изучения. Экспресс-информация, 1979, 4, c. 3-9.

Изобретение относится к медицине, в частности к фармакотерапии. Цель - повышения мембраностабилизирующего и антиоксидантного лечебного эффекта. Для этого предлагается лекарственное средство "Рикавит", содержащее в качестве действующих компонентов, г: рибоксин 0,1; глутаминовая кислота 0,1; аскорбиновая кислота 0,02; никотинамид 0,01; рибофлавин 0,002; пиридоксин 0,002; калия хлорид 0,05. Препарат может быть использован как в качестве монотерапии, так и в комплексном лечении, в частности при лечении сердечно-сосудистых заболеваний в общетерапевтической и гериартрической практике.

Мембраностабилизирующее и антиоксидантное лекарственное средство, содержащее рибоксин, отличающееся тем, что, с целью повышения лечебной эффективности и уменьшения побочных влияний, оно дополнительно содержит глутаминовую и аскорбиновую кислоту, никотинамид, рибофлавин, пиридоксин и калия хлорид при следующем содержании компонентов, г:
Рибоксин 0,1
Глутаминовая кислота 0,1
Аскорбиновая кислота 0,02
Никотинамид 0,01
Рибофлавин 0,002
Пиридоксин 0,002
Калия хлорид 0,05