СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МИКРОНОСИТЕЛЕЙ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК Российский патент 1994 года по МПК C12N5/00 

Изобретение относится к переработке отходов сырья животного происхождения, в частности к способам получения микроносителей биотехнологического назначения на основе коллагена, преимущественно для культивирования клеток.

Известен ряд способов получения микроносителей с использованием денатурированного коллагена (желатина).

Недостатком этих способов является применение желатина - ценного сырья для пищевой, фотопромышленности и некоторых других отраслей народного хозяйства. Кроме того, на отдельных этапах производства микроносителей используют дорогостоящие материалы и реагенты, например, ферменты и некоторые другие, что значительно удорожает стоимость готовой продукции.

Следует отметить также, что получаемый согласно указанным выше техническим решениям конечный продукт представляет собой разнокалиберные частицы чаще всего неправильной формы, что значительно снижает эффективность его использования по прямому назначению.

Наиболее близким к заявляемому является способ получения микроносителей, представляющих собой поперечносшитые, активированные глутаровым альдегидом желатиновые гранулы, поверхность которых дополнительно покрыта желатином (прототип).

Цель предлагаемого изобретения усовершенствование технологии получения и обеспечение высокого качества коллагеновых микроносителей.

Цель достигается тем, что в качестве исходного сырья для получения гранул используют недубленные коллагенсодержащие отходы кожевенного производства, которые подвергают щелочно-солевой обработке, нейтрализации и промывке до получения нейтральной коллагеновой массы, которую затем концентрируют до содержания белка в данном продукте 10-15% , нагревают до температуры 27-31^оС и впрыскивают под давлением через металлическое сопло диаметром 0,3-0,5 мм в масло, причем перемешивание образующейся при этом двухфазной смеси происходит за счет акустических мелкомасштабных вихрей, создаваемых низкочастотным ультразвуковым воздействием.

Проведенный научно-технический и научный поиск показал, что заявленная совокупность неизвестна, т. е. она соответствует критерию "Новизна".

Испытания способа показали соответствие заявленного критерию "промышленная применимость", а поскольку совокупность материальных действий позволяет получить микроносители более высоких качеств, то заявленное соответствует критерию "изобретательский уровень".

Способ осуществляют следующим образом.

Струю коллагеновой массы электризуют, для чего на корпус металлического сопла подают электрический потенциал того или иного знака. В результате струя легко распадается на сферические заряженные микрокапли размером 5-50 мкм, которые благодаря одноименному электрическому заряду взаимно отталкиваются и не образуют более крупных частиц. Взаимные отталкивания коллагеновых молекул внутри каждой микрокапли приводят к формированию пористой структуры, за счет чего существенно увеличивается эффективная поверхность, к которой могут прикрепляться клетки, молекулы ферментов и других веществ, требующие иммобилизации.

После инжектирования коллагеновой массы в масло и перемешивания смесь охлаждают до 4^оС, образовавшиеся гранулы обезжиривают бутанолом, задубливают глутаровым альдегидом, а затем на активированной глутаром поверхности гранул иммобилизуют коллаген посредством инкубирования микрочастиц в растворе с содержанием белка 0,4-0,8% при рН 4,8-5,4 в течение 3-4 ч при 24-27^оС. После этого частицы микроносителя подвергают серии последовательных обработок с целью отмывки от несвязавшегося коллагена, блокировки свободных альдегидных групп на поверхности гранул, а затем автоклавируют, после чего он пригоден для использования.

П р и м е р 1. Промытую под проточной водой гольевую спилковую обрезь измельчают, инкубируют в щелочно-солевом растворе в течение 48 ч, а затем нейтрализуют и промывают до полного удаления сульфатионов.

Полученную нейтральную вязкую коллагеновую массу концентрируют до содержания белка 10% , подогревают до 27^оС и под давлением выпрыскивают в вазелиновое масло через металлическое сопло с диаметром 0,3-0,5 мм, на корпус которого подают электрический потенциал величиной 16 кВ. Для перемешивания двухфазной смеси используют низкочастотное ультразвуковое воздействие частотой 22 кГц. При этом коллагеновая масса распадается на сферические пористые микрокапли одинакового заряда, которые после обезжиривания и задубливания обрабатывают раствором коллагена с содержанием белка 0,4% при рН 4,8, а затем отмывают забуференным физиологическим раствором, этаноламином и повторно физиологическим раствором, после чего стерилизуют автоклавированием.

Диаметр получаемых гранул 50 мкм, поверхность одной гранулы составляет 78,5˙ 10^-6 см², 1 мл гидратированных гранул такого размера обеспечивает 1200 см² поверхности для прикрепления клеток или других частиц.

П р и м е р 2. Все операции проводят аналогично примеру 1, но нейтральную коллагеновую массу концентрируют до содержания в ней белка 15,0% , подогревают до 29^оС, разбрызгивают в вазелиновое масло через сопло, на корпус которого подан электрический потенциал величиной 23 кВ. Перемешивание двухфазной смеси осуществляют за счет низкочастотного ультразвука, а обработку поверхности обезжиренных и задубленных гранул проводят раствором коллагена с содержанием белка 0,6% при рН 5,0.

Получаемые гранулы имеют сферическую форму, их диаметр 20 мкм, поверхность одной гранулы - 12,57 ˙ 10^-6 см², 1 мл гидратированных гранул такого размера обеспечивает 3016,8 см² поверхности для прикрепления и роста клеток.

П р и м е р 3. Все операции проводят аналогично примерам 1, 2, но нейтральную коллагеновую массу концентрируют до содержания в ней белка 20% , подогревают до 31^оС, разбрызгивают в вазелиновое масло через сопло, на корпус которого подают электрический потенциал величиной 30 кВ, перемешивание двухфазной смеси проводят с помощью ультрачастотного ультразвука, а обработку поверхности обезжиренных и задубленных гранул проводят 0,8% -ным раствором коллагена с рН 5,4.

Получаемые при этом гранулы имеют сферическую форму, диаметр 5 мкм, поверхность одной гранулы 0,78 ˙ 10^-6 см², 1 мл гидратированных гранул такого размера имеет общую поверхность 12000 см².

П р и м е р 4. Все операции проводят аналогично примерам 1-3, но нейтральную коллагеновую массу концентрируют до содержания в ней белка 8,0% , прогревают до 25^оС, разбрызгивают в вазелиновое масло через сопло, на корпус которого подан электрический потенциал величиной 13 кВ. Двухфазную смесь перемешивают с помощью низкочастотного ультразвука, а обработку поверхности обезжиренных и задубленных частиц проводят раствором коллагена с содержанием белка 0,3 при рН 4,5.

Получаемые гранулы имеют сферическую форму, диаметр 60 мкм, поверхность одной гранулы составляет 113,1˙ 10^-6 см², а 1 мл гидратированных гранул 999,8 см². Однако они не пригодны к использованию, так как не выдерживают стерилизации автоклавированием и теряют свою форму, вероятно, вследствие недостаточно высокой концентрации белка в нейтральной коллагеновой массе, из которой формируют гранулы.

П р и м е р 5. Все операции проводят аналогично примерам 1-3, но нейтральную коллагеновую массу концентрируют до содержания в ней белка 22% , прогревают до 32^оС, разбрызгивают в вазелиновое масло через сопло, на корпус которого подан электрический потенциал 32 кВ. Двухфазную смесь перемешивают с помощью низкочастотного ультразвука, а обработку поверхности обезжиренных и задубленных гранул проводят раствором коллагена с содержанием белка 0,9% при рН 5,5.

Получаемые гранулы имеют сферическую форму, диаметр их 2 мкм, поверхность одной гранулы 12,57 ˙ 10^-8, а 1 мл гидратированных гранул 29940 см².

Однако гранулы такого размера не удобны для практического использования.

Проверка полученных микроносителей на пригодность для выращивания на них перевиваемых культур клеток проведена на линии Таурус 1 (Т-1). Результаты опытов по оценке биологических свойств экспериментальных серий гранул, полученных согласно примерам 1-3, представлены в таблице.

Как видно из таблицы наилучшая адгезия для клеток линии Т-1, время образования монослоя, кратность прироста клеток и время их переживания наблюдается при использовании положительно заряженных коллагеновых микроносителей с диаметром частиц 20 мкм.

Использование предлагаемого способа получения микроносителей из мягких коллагенсодержащих отходов сырья животного происхождения обеспечивает по сравнению с существующими способами следующие преимущества:
- возможность замены ценного пищевого продукта желатина как сырья для наработки микроносителей на нативный коллаген, не только не уступающий, но и по ряду биологических свойств превосходящий этот белок;
- получение монодисперсных сферических гранул микроносителя за счет низкочастотной ультразвуковой обработки коллагеновой массы, впрыскиваемой в масло;
- создание на поверхности гранул в процессе их формирования из коллагеновой массы одноименного электрического заряда, что позволяет:
а) предотвратить слипание частиц микроносителя и образование гранул более крупного размера;
б) значительно увеличить "рабочую" поверхность гранул не только за счет увеличения их наружной поверхности путем уменьшения размера частиц, но и за счет создания пористой структуры;
в) ускорить в несколько раз и более качественно проводить такие технологические операции, как обезжиривание, задубливание, покрытие поверхности гранул коллагеном;
г) избирательно и эффективно иммобилизовать на них поверхностно-зависимые частицы, обладающие собственным зарядом, в том числе и клетки, а также прикреплять частицы к поверхности микроносителя тем или иным заряженным концом. (56) Авторское свидетельство СССР N 1124230, кл. G 01 N 33/50, 1982.

Использование: биотехнология. Сущность: из недубленых коллагенсодержащих отходов кожевенного производства получают нейтральную концентрированную коллагеновую массу, которую электризуют и выпрыскивают под давлением через металлическое сопло в вазелиновое масло. Образующуюся двухфазную смесь перемешивают с помощью низкочастотного ультразвука. В результате получают сферические монодисперсные частицы микроносителя с пористой структурой, несущие одноименный электрический заряд, которые обезжиривают, задубливают, отмывают, а на поверхности иммобилизуют коллаген. 1 табл.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МИКРОНОСИТЕЛЕЙ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК, включающий диспергирование раствора белка животного происхождения в вазелиновое масло с последующим получением микрогранул, их обезжириванием, иммобилизацией того же белка на поверхности микрогранул и их отмывкой, отличающийся тем, что в качестве белка животного происхождения используют коллагеновую массу с содержанием нативного белка 10 - 20% при 27 - 31^oС, при этом в процессе диспергирования частицам сообщают электрический заряд, а в масле возбуждают колебания ультразвуковой частоты, иммобилизацию белка осуществляют в растворе коллагена с содержанием белка 0,4 - 0,8% при рН 4,8 - 5,4.