Способ выделения фибронектина Советский патент 1984 года по МПК G01N33/50 C07K1/22 A61K38/39 

280 .

2МКВ2 7.0

0,5

1525

(Риг,

1C

N N9

ОО

35 Оиъеп,мл Изобретение относится к медицине в частности к прикладной медицинско) биохимии, Фибронектин представляет собой высокомолекулярньй белок плазмы крови и необходим для лечения обширных травм,- сепсиса, ожогов, последствий обильных кровопотеоь, острых кишечных инфекций. Известен способ выделения фибронектина с помощью хроматографии на ДЭАЭ-целл апозе криопреципитата сыворотки крови, заключающийся в том, что свежую кровь свертывают при 37°С и центрифугируют при 3000-4000 об/ми отделившуюся сыворотку выдерживают 10 - 12 ч при . По истечении этого срока выпадает бельй хлопьевидный осадок, который многократно отмывают физиологическим раствором и хроматографируют затем на ДЭАЭ-целлюлозе, отделяя: фибронектин от сопутствующих белков {. Указанная методика не дает возможности получить достаточно чистый ,препарат фибронектина, поскольку криопрецйпитат сыворотки содержит множество белков, плохо отделяющихся от фибронектина. Известен также способ выделения фибронектина из плазмы крови путем аффинной хроматографии на нерастворимом сорбенте, представляющем собой желатину, иммобилизованную на активированной бромцианом сефарозе с элюцией фибронектина буфером иди раствором аргинина. Метод основан на способности фибронектина специфически связываться с желатинойС23 Недостатками способа являются невысокие выход белка (60%) и чисто та продукта, а также контакт с. высо котоксичньм реагентом, каким являет ся бромциан, Р1спользуемь й для. активации матрицы сорбента. Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности и достигаем му результату является способ вьщеления фиброиектина из плазмы или сы воротки крови путем аффинной хромат графии на сорбенте, представляющем собой матрицу - активированную тиони хлоридом карбоксиметилцеллюлозу - с иммобилизованной желатиной-с элюцией 4,0-4,5 М раствором мочевины при р.Н 7,4-7,5 З. Способ характеризуется недостаточно высокими выходом и чистотой выделяемого фибронектина (90%), Цель изобретения - повышение выхода и чистоты целевого продукта. Указанная цель достигается тем, что по способу выделения фибронектина из плазмы крови путем аффинной хроматографии на сорбенте, представляющем собой матрицу с иммобилизованной желатиной с элюцией фибронектина раствором мочевины, в качестве сорбента используют обработанные раствором желатины, предварительно попереченосшитые, активированные глутаровым альдегидом желати- новые гранулы и осуществляют фибронектина раствором мочевины в градиенте концентрации 4-8М при рН 7,2-7,4, Вышеприведенная совокупность признаков способа обеспечивает более .полное сродство вьзделяемогр белка 1с афинным сорбентом, более эффективные условия элюции, что, в конечном итоге, обеспечивает лучшие, по сравнению с известным способом, характеристики процесса вьделения. В предлагаемом способе в качестве матрицы используют поперечносшитысжелатиновые гранулы, а лселатину иммо-билизуют на них путем инкубации ее 1%-ного раствора с гранулами в течение 1-1,5 ч при 37-39°С и рН 7,2-7,4 или в течение ночи при 4. Затем сорбент отмывают от несвязавшейся желатины збуференным физиологическим раствором рН 7,2-7,4 и блокируют свободные альдегидные группь путем инкубации гранул в растворах О,1М . лизина или 1М этаноламина. После отмывания гранул их инкубируют в 4М мочевине или 2М КЬг в течение 1- 1,5 ч при 37-39°С, снова отмывают забуференным физиологическим раствором рН 7,2-7,4 и используют для получения фибронектина из плазмы. Матрицу для предлагаемого сорбента, т.е. гранулы пспер1ечносшитой желатины, получают путем вливания 15 20%-ного раствора желатины в 0,1М цитратном буфере рН 5,0 при 85-90С в вазелиновое масло, нагретое до 75-80с, с дальнейцгим перемешиванием двухфазной смеси механической мешалкой при 1500-1700 об/мин и последующим охлаждением смеси до 4С. Образовавшиеся гранулы отдепяют путем декантированиЯ} промывают от масла тексаном или петролейиым эфиром при и обраба тывают сначала 0,5% раствором глутаро вого альдегида в течение 10-15 ч пр 4 С, а затем 5%-ным раствором глутаро вого альдегида в течение 2-3 ч при рН 5,0 и .Поперечносшитые, активированные глутаровым альдегидом желатино вые гранулы тщательно отмывают забуф ренным физиологическим раствором вН 7.2-7,-4. Вьзделение .фибронектина из плазмы проводят следуюпщм образом. После отмывания полученного сорбента (желатины на желатиновых грану лах) забуференным физиологическим раствором рН 7,2-7,4 на сорбент нан сят свежую или размороженную плазму в отношении 10 мл плазмы на 1 мл сор бента и инкубируют смесь в течение 1д5-2 ч при комнатной температуре. Сорбент промывают физиологическим раствором рН 7,2-7,4, чтобы удалить все несвязавшиеся белки плазмы, Элюдию фибронектина прЪводят градиентом 4-8М мочевины в буфере, рН 7,2-7,4, Полученный белок диализуют против физраствора рН 7,2-7,4, концентрируют до 10 мг/мл и хранят до использования в течение двух педель при 4 С, Более длительное время фибронектин следует хранить при -20°С. Общий выход фибронектина - до 97% от среднего содержания в плазме. Достигаемая -чистота 99%.. На фиг, 1 приведен график элюции фибронектина с сорбента; на фиг, 2 характеристика фибронектина на степень чистоты и гомогенности; на фиг, 3 - то же, иммунофореграмма. Пример , 20 г желатины в 100 мл 0,2 М цитратного буфера рН 5,0 нагревают до 85°С к вливают в 0,5 л вазелинового масла, нагретого до 80°С, Смесь, помещенную в баню с тающим льдом, интенсивно перемешивают пропеллерной мешалкой 15 мин при 1700 об/мин. Затем смесь отстаивают и отсасывают масло. Желатиновые грапулы трижды отмывают трехкратным объемом петролейного эфира или гексана при 4°С, затем заливают 200 мл 0,5% раствора глутарового альдегида в 0,1 М цитратном буфере рН 5,0 и инкубируют.10-15 ч при 4°С, После этого концентрацию глутарового альдегида доводят до 5% и инкубируют смесь 2-3 ч при 37°С. Цоперечносшитые желатиновые гранулы, активированные глутаровым альдегидом, многократно отмывают забуференным физиологическим раствором рН 7,2-7,4 и затем смешивают с равным объемом раствора желатины (10 мг/мл) в том же буфере. Смесь перемешивают в течение ночи при 4С или в течение 1,5ч при 37°С, Затем гранулы многократно отмывают от несвязавшегося белка забуференным физраствором и суспендируют в 200 мл 0,1 М лизина или Ш этаноламина в течение 2ч при 37С, После этого суспензию инкубируют 1,5 ч при 37°-С в 4м растворе мочевины, трижды отмывают пятью объемами забуференного физраствора рН 7,2-7,4 и используют для получения фибронектина из плазмы крови человека, 100 МП свежей или размороженной плазмы добавляют к 10 мл приготовленного сорбента и инкубируют смесь при комнатной температуре в течение 1,5 ч. Сорбент промывают забуфер-енным физиологическим раствором,чтобы удалить все несвязавшиеся белки плазмы, Элюцию фибронектина проводят градиентом 4-8М мочевины в .буфере рН 7,2-7,4, Полученный белок диализуют в течение 36 ч против забуференного физиологического раствора при рН 7,2-7,4, концентрируют до 10 мг/мл и хранят р,о Использования при 4 С в течение 12 дней или дольше при , Выход л97%. Таким образом, предлагаемый способ по сравнению с известным обеспечивает повышение выхода в среднем до 97%, Уровень исходного фибронектина в плазме подвержен резким колебаниям (180-600 мг/л), однако емкость сорбента такова, что позволяет за один шаг иммуносорбции произвести исчерпывающее извлечение фибронектина. Результаты вьщеления фибронектина приведены в табл, 1.

Таблица 1

СПОСОБ ВЬЩЕЛЕНИЯ .ФИБРОПЕКТИНА из плазмы крови путем аффинной хроматографии на сорбенте, представляющем собой матрицу с иммобилизованной желатиной с элюцией фибронектина раствором мочевины, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода и чистоты целевого продукта, в качестве сорбента используют обработанные раствором желатины, предварительно поперечносшитые, активированные глутаровым альдегидом желатиновые гранулы, а элюцию фибронектина осуществляют раствором, мочевины в градиенте концентрации 4-8 М при рН 7,2-7,4. СЛ

Вьщелепный по предлагаемому спо- 20 собу фибронектин (препарат) характеризуют на степень чистоты и гомогенности следующими методами: аналитическим ультрацентрифугированиам; диск-электрофорезом в полиакриламидном геле; иммунозлектрофорезом; детекцией эффекта на адгезию и распластывание клеток.

В результате в SDS-электрЬфорезе в полиакриламидном геле показана го- 30 могенность фибронектина, что согла- , суется с/данными Г2 (фиг. 2А). Чистота препарата 99%.

Аналитическое ультрацентрифугирование (фиг. 2В) в диапазоне 14-17 ед.з5 Сведберга (S) также свидетельствует об отсутствии загрязнения препарата иными макромолекулами..

На иммунофореграммё (сЬиг. 3), проявленной антисывороткой к сьшоро- о точным белкам человека (1) и моноспецифической антисывороткой к фибронектину (If), показана серологическая гомогенность фибронектина (НФ, 3,0 мг/мл) и отсутствие загрязнения 45 иными плазменными антигенами.

В табл. 2 приведены данные по биологической активности фибронектина (адгезии и распластыванию клеток на поверхности, покрытой коллагеном).

Т а б л и ц, а 2

Коллаген18 12

Коллаген, обработанный фибронектином 88 47

Данные говорят о том, что основные характеристики биоактивности фибронектина сЪхранны (повышение адгезии клеток на 70% и распластывание на 35%) по сравнению с контр олем.

Данные иммуноферментного анализа примесных белков в препаратах фибронектина, получтаных предлагаемым способом приведены в табл. 3.

ТаблицаЗ

1124230

8 Продолжение табл.3