СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СРЕДСТВА, ОБЛАДАЮЩЕГО АНТИТЕЛОСТИМУЛИРУЮЩЕЙ, МИТОГЕННОЙ И ИНТЕРФФЕРОНИНДУЦИРУЮЩЕЙ АКТИВНОСТЬЮ Российский патент 1994 года по МПК A61K35/70 A61K35/78 

Изобретение относится к химии высокомолекулярных полисахаридов, обладающий высокой антителообразующей, митогенной и интерферонидуцирующей активностями.

Целью изобретения является расширение арсенала биологически активных веществ широкого спектра действия.

Поставленная цель достигается тем, что проводят экстракцию культуры чайного гриба Saceharomycoda ludnigii кипящей водой при рН 4,0-6,0, отделяют осадок, кипятят надосадочную жидкость в течение 5-10 мин, ультрафильтруют на волокнистых фильтрах, отделяющих вещества с молекулярной массой более 60 Кдальтон и далее очищают на ультрафильтрах с молекулярной массой 100-300 КДальтон и лиофилизуют высокомолекулярный целевой продукт.

П р и м е р 1. Исходным сырьем для получения предлагаемого средства является культура чайного гриба класса Ascomycetes, рода Saccharomycoda, а именно Saccharomycoda ludwigii.

Культивирование гриба проводят в 1,0 л дистилированной воды при 20-24^оС с добавлением 100,0 г сахарозы, 10,0 мл экстракта чайного листа (2,0 г на 200,0 мл воды при 100^оС) и 3,0 мл концентрированной уксусной кислоты. Пласт культуры гриба, толщиной в 1,5-2,0 см, гомогенизируют и заливают кипящей водой в соотношении 1,5-2,0, затем с помощью 10% -ного раствора NaHCO₃ доводят значение рН до 4,0. При постоянном помешивании остужают и отжимают с помощью пресса. Сухой осадок отбрасывают, а полученный экстракт кипятят в течении 5 мин. До последующей очистки хранят при 4^оС в асептических условиях.

Для удаления термолабильных белков экстракт центрифугируют при 5000 об/мин в течение 10 мин. Очистку целевого продукта проводят в два этапа. На первом этапе для освобождения от низкомолекулярных веществ используют волокнистые фирмы Frezenius, позволяющие отделить фракцию с молекулярной массой более 60000 дальтон (фракция 1).

На втором этапе фракцию 1 подвергают ультрафильтрации на мембранном фильтре ХМ-100 фирмы Amicon с размером пор, позволяющим отделить высокомолекулярную фракцию с молекулярной массой более 100КДальтон (фракция 2). Фракцию 2, представляющую собой целевой продукт, лиофилизуют.

Выход целевого продукта по сухому остатку 10,0-12,0% .

П р и м е р 2. Культивирование гриба проводят по примеру 1. Пласт культуры толщиной 1,5-2,5 см гомогенизируют, заливают кипящей водой в соотношении 1: 1,5, затем доводят до рН 4,0 с помощью 10% -ного раствора NaHCO₃ и при постоянном помешивании проводят дополнительную экстракцию кипячением в течение 10 мин. Дальнейшее выделение проводят по примеру 1.

Выход продукта по сухому остатку 12,0-16,0% .

1 мл экстракта содержит 1,5-2,0 мг целевого продукта.

П р и м е р 3. Культивирование гриба проводят в 10,0 л дистилированной воды при 18-22^оС с добавлением 250,0 г глюкозы, 250,0 г сахарозы, экстракта чайного листа и 0,1 н. HCl до рН среды 4,0.

Пласт культуры гриба толщиной в 3,0-5,0 см гомогенизируют, заливают кипящей водой в соотношении 1: 2, затем доводят рН до 6,0 с помощью 0,1 н. NaOH. Дальнейшее выделение проводят по примеру 2.

Выход целевого продукта по сухому остатку 8,0-12,0% .

П р и м е р 4. Культивирование гриба проводят в 0,5 л дистилированной воды при 20-24^оС с добавлением 300,0 г сахарозы и экстракта чайного листа. Пласт культуры гриба толщиной 1,0-3,0 см гомогенизируют и заливают кипящей водой в соотношении 1: 1, затем доводят рН до 7,0 с помощью 0,1 н. NaOH. Дальнейшее выделение проводят по примеру 2.

Выход целевого продукта по сухому остатку 1,0-5,0% .

П р и м е р 5. Культивирование гриба проводят по примеру 1. Экстракцию и первый этап чистки проводят по примеру 2. На втором этапе фракцию 1 подвергают ультрафильтрации на мембранном фильтре ХМ-300 фирмы "Amicon" с размером пор, позволяющим отделить высокомолекулярную фракцию с молекулярной массой более 300 КДальтон. Фракцию, представляющую собой целевой продукт лиофилизируют.

Выход целевого продукта по сухому остатку 10-12% .

Характеристика целевого продукта.

Средство полученное по примерам 1-5, представляет собой гигроскопичный порошок от белого до слабого желто-коричневого цвета, растворимый в воде, физиологических средах, нерастворим в спирте, ацетоне, хлороформе, дает положительные реакции с фенолом, по Дише, дает отрицательные реакции по Лоури и с кумасе.

Средство полисахаридной природы с молекулярной массой более 300 КДальтон, обладающее антителостимулирующей, митогенной и интерферонидуцирующей активностями, не теряет своей биологической активности при кипячении в течение 20 мин. Раствор средства SML 1 мг в 1,0 мл дистилированной воды имеет рН 4,35-5,6 в зависимости от условий получения.

В УФ-спектре в диапазоне 240-400 нм имеет плечо 280-300 нм.

В спектре кругового дихроизма наблюдается отрицательный эффект Коттона в области 200-220 нм.

Элементный состав, ат. % :
Н - 56,5
С - 34,2
О - 9,3, из них 16% кислорода связано простой эфирной связью, 37% - спиртовой связью, 37% - карбонильной связью, около 10% - карбоксильной связью.

N - не обнаружен.

Обнаружены следовые количества Si и Ca.

При сравнении средства, полученного по примерам 1-5 в тесте стимуляции антителогенеза in vivo минимальными концентрациями, вызывающими полумаксимальный эффект, являются дозы от 0,01 до 0,1 мкг на мышь.

При подкожном способе введения антителостимулирующий эффект полученного средства значительно менее выражен.

Антителостимулирующее действие предлагаемого средства является рН-зависимым.

В норме митогенный эффект предлагаемого средства проявляется слабо. Доза, вызывающая полумаксимальный митогенный эффект для предлагаемого средства 25-50 мкг на 1 мл культуры клеток селезенки.

Предлагаемое средство помимо перечисленных эффектов обладает также интерферониндуцирующим и макрофаг-активирующим действием, проявляющимся в интервале низких доз от 0,01 до 1,0 мкг на мышь.

Биологическая активность препарата полученного по примерам 1-5 поясняется следующим.

П р и м е р 6. Средство, выделенное при рН 4,0 по примеру 1, взвешивают, разводят в физиологическом растворе и готовят ряд 10-кратных разведений от 200 до 0,02 мкг/мл. Биологическую активность тестируют в системе in vivo на мышах (СВАхС57В1/6)F1 самках массой 18-20 г.

Контрольным животным вводят внутрибрюшинно (в/б) в качестве тест-антигена эритроциты барана (ЭБ) в оптимальной дозе 1 х 10⁷ клеток.

Опытным животным также в/б одновременно с тест-антигеном вводят предлагаемое средство в разных дозах. На 4-е сутки методом Ерне (локальный гемолиз в геле) оценивают количество антителообразующих клеток (АОК) на селезенку.

Результаты приведены в табл. 1.

П р и м е р 7. Средство, полученное по примеру 3, при рН 6,0 разводят в физиологическом растворе и тестируют как в примере 6. Результаты представлены в табл. 2.

П р и м е р 8. Средство, полученное по примеру 3, при рН 6,0 тестируют как в примере 6 и сравнивают его действие при подкожном и внутрибрюшинном введении при использовании субоптимальной дозы тест-антигена ЭБ 5 х 10⁶.

Результаты приведены в табл. 3.

П р и м е р 9. Средство, приготовленное при рН 7,0 по примеру 4, разводят в физиологическом растворе и тестируют как в примере 6. Стимуляция антителообразования не выявляется.

П р и м е р 10. Средство, приготовленное по примерам 1 и 2, тестируют на присутствие митогенной активности, которую определяют по профилеративному ответу спленоцитов мышей линии СВА. Клетки инкубировались в среде RPMI с FCS. Концентрация спленоцитов 500000 в мл. Время культивирования спленоцитов с предлагаемым средством 72 ч. За 18 ч до окончания инкубации добавляли 1 μ Ci³1н1-тимидина в лунку.

Результаты экспериментов представлены в табл. 4.

П р и м е р 11. Средство, полученное по примеру 2, исследовали на активность в качестве индуктора интерферона. Исследование проводили на белых беспородных мышах массой 10-12 г. Титрование интерферона осуществляли общепринятым микрометодом на культуре клеток L-929. В качестве тест-вируса использовали 100 ТЦД50 вируса энцефаломиокардита мышей. За единицу интерферона принимали последнее разделение пробы, обеспечивающее 50% защиту клеток при полной деструкции монослоя в контроле. Результаты исследования приведены в табл. 5.

Таким образом, в результате проведенных исследований выявлена высокая антителообразующая активность предлагаемого средства, проявляющаяся в низких дозах (табл. 1 и 2). Стимулирующий эффект проявляется при внутрибрюшинном введении средства (табл. 3) и значительно менее выражен при подкожном введении.

Средство обладает митогенным эффектом, проявляющимся в дозах 1-100 мкг (табл. 4).

Интерферониндуцирующая активность предлагаемого средства проявляется у животных in vivo в двух диапазонах доз 10 и 0,01 мкг, при этом уровень интерферона увеличивается, начиная с 5 ч после введения, и сохраняется по меньшей мере 48 ч.

Использование: изобретение относится к медицине, а именно к химико-фармацевтической промышленности, и касается способа получения средства, обладающего антителостимулирующей, митогенной и интерферониндуцирующей активностью. Предложение является пионерным. Сущность изобретения заключается в экстракции культуры чайного гриба ( Sassharomycoda ludwigio ), кипящей водой при pH 4,0 - 6,0 в течение 5 - 10 мин, и ее ультрафильтрации на волокнистом фильтре, отделяющем вещества с мол. м. более 60 Кдальтон и дальнейшей очисткой фильтрата на ультрафильтре с мол. м. 100 - 300 КДальтон. Средство обладает высокой антителостимулирующей, митогенной и интерферониндуцирующей активностью. 5 табл.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СРЕДСТВА, ОБЛАДАЮЩЕГО АНТИТЕЛОСТИМУЛИРУЮЩЕЙ, МИТОГЕННОЙ И ИНТЕРФЕРОНИНДУЦИРУЮЩЕЙ АКТИВНОСТЬЮ путем экстракции культуры чайного гриба (Saccharomycoda ludwigii) кипящей водой при pH 4,0 - 6,0 в течение 5 - 10 мин, отделения осадка, кипячения надосадочной жидкости в течение 5 - 10 мин и ее ультрафильтрации на волокнистом фильтре, отделяющем вещества с мол. м. более 60 к-Дальтон, и дальнейшей очисткой фильтрата на ультрафильтрах, отделяющих вещества с мол. м. 100 - 300 кДальтон.