Штамм бактерий СоRYNевастеRIUм SереDоNIсUм - продуцент полисахарида, индуцирующего образование интерферона Советский патент 1992 года по МПК C12N1/20 C12P19/04 

Изобретение относится к микробиологии, а именно к штаммам микроорганизмов, используемых в микробиологической и медицинской промышленности для получения иммуномодуляторов, в частности полисахаридов, обладающих способностью индуцировать образование интерферона в клетках человека и животных.

Известен продуцент полисахарида Bacterium prodlgiosum, получившего название гфодигмозан, который проявляетинтер- ферониндуцирующее действие,

Выращивание указанного продуцента проводится на среде, содержащей дорогостоящие реактивы - мясо-пептонный бульон, мясо-пептонный агар. Стоимость 1 л среды для выращивания В. prodlglosum составляет 2 руб.

Для получения продигиозона густой смыв культуры В. prodlgiosum штамм К обрабатывают многократно 0,5 М раствором трихлоруксусной кислоты (ТХУ) при 4°С. Объединенные экстракты тщательно освобождают от взвешенных частиц на центрифуге при 10-12 тыс. об/мин и осаждают на холоду шестью объемами охлажденного этанола с добавлением насыщенного спиртового раствора уксуснокислого натрия из расчета 33 мл/л. После полного выпадения осадок отдекляют на центрифуге и подверо

СА

ю

гэют диализу в течение 3-сут в проточной водопроводной воде и 24 ч в дистиллированной воде, После диализа препарат подвергают лиофильной сушке. В нем обнаружены следующие моносахариды; глюкоза, галактоза, манноза. глкжозамин.

Продигиозан является токсичным, максимально переносимая доза в опытах на белых мышах составляла 0,125-5,0 мг/кг, ЛДбО равнялась 2-2,5 мг/кг, активность 16-64 ед. ,

Недостатками известного продуцента являются: выращивание продуцента осуществляется на дорогостоящих средах; низкая активность продигиозана; токсичность про- дигиозана.

Целью изобретения является получение нового штамма - продуцента полисахарида, проявляющего активность индуктора интерферона.

Новый штамм С. sepedonicum HMB 7694, обладающий указанными выше свойствами, выделен из больных клубней картофеля. Для этой цели часть пораженной ткани на границе с внешне здоровой тканью вырезают стерильным скальпелем, промывают в течение 15-20 мин несколькими порциями стерильной воды. Затем растительную ткань растирают в стерильной ступке с небольшим количеством стерильной воды и образующуюся гомогенную кашицу высевают петлей на поверхность агара на чашках Петри. Чашки помещают в термостат (температура 25 ± 3)°С. Питательными средами для выделения бактерий обычно служат: картофельный агар; картофельный агар + 1 % дрожжевого автолизата: агар картофельный + 1% глюкозы; мясо- пептонный агар.

Культуру хранят; а/в пробирках на косяках с картофельным агаром при комнатной температуре, б/в пробирках на косяках с картофельным агаром, поверхность которого заливают растительным маслом.

Состав среды картофельный агар: на 1 л дистиллированной воды 200 г картофеля, 0,5% хлористого натрия. 1,5-2,0% агара, рН 7,0-7.2.

Штамм С. sepedonicum ИМ8 7694 депонирован в коллекции культур Всесоюзного научно-исследовательского института антибиотиков Минмедпрома и имеет регистрационный номер 1857.

Штамм С. sepedonicum ВНИИА 1857 имеет следующие морфологические и биохимические признаки.

Культурально-морфологические свойства - хорошо растет на обычных питательных средах.

На картофельном агаре - колонии Kpyi лые, гладкие, приподнятые, блестящие, ела бо слизистые, желто-оранжевые.

На мясо-пептонном агаре - колонии

круглые, гладкие, более прозрачные, чем при росте на картофельном агаре, слабо слизистые, желтого цвета, со временем маслообразной консистенции.

При росте в мясо-пептонном бульоне культура растет умеренно, образует нежную пленку и небольшой осадок.

Культура растет в аэробных условиях, оптимальня температура роста (25 ± 3)°С, минимальная 3-4°С, максимальная 3031°С. рН: оптимальное 7,0 ± 0,2; растут в интервале рН от 6,7 до 7,4.

Физиолого-биохимические признаки. Культура не образует кислоту из глюкозы, мальтозы, мелецитозы, инулина, лактозы,

сахарозы, маннита, салицина, дульцитэ, сорбита. Не образует сероводород, индол, нитраты не редуцирует, молоко слабо пеп- тонизирует, не разжижает желатины.

Использует ацетат, сукцинат, не использует лактат и пропионат.

Факторы роста - биотин, никотиновая кислота, гистидин, пурин, пиримидин, мети- онин, аспарагин. Цистеин и другие аминокислоты могут ингибировать рост бактерий.

Штамм С. sepedonicum ИМВ 7694 при культивировании на жидкой синтетической среде, содержащей в качестве источника углерода глюкозу, а азота - хлористый аммоний, синтезирует полисахарид, обладающий способностью иидуцировэт0 образование интерферона в клетках человека и животных.

Безвредность. Штамм С. sepedonicum ИМВ 7694 не вирулентен, не токсичен для

теплокровных животных. Введение 24-часовой культуры С. sepedonicum ИМВ 7694 внутрибрюшинно, подкожно и перорально в дозах 5 и 10 млрд микробных клеток на 1 мышь, а также фильтратов среды роста

(после культивирования культуры на жидкой синтетической среде) не вызывало у животных патологического процесса, регистрируемого клинически или при макроскопическом изучении внутренних органов

животных.

Штамм 7694 С. sepedonicum не патогенен для теплокровных животных.

Выращиавние бактериальной массы С. sepedonicum ИМВ 7694 и получение полисахарида осуществляли следующим образом. Для получения инокулята используют 24-часовую культуру, выращенную на картофельном при(25 ±3)°С. Выращивание продуцента осуществляют в колбах обьеMOM 500 мл, содержащих 200 мл жидкой синтетической среды следующего состава, г/л: MgS04 0.2; ЫаэНРО 6,0; KH2PO i 3,0; NH-iCI 1,0; глюкоза 5,0.

Выращивание культуры продуцента осуществляют при (25 ± 3)°С п течение 35-41 ч, целевой продукт выделяют мягким щелочным гидролизом целых клеток.

Премер 1. Культуру С. sepedonlcum ИМВ 7694, хранящуюся на косяках с картофельным агаром, засевают на косяк с той же средой и выращивают в термостате при (25 ± 3)°С в течение 24 ч. Затем культуру смывают с косяков жидкой питательной средой описанного выше состава и засевают в колбы емкостью 500 мл, содержащие200 мл аналогичной питательной среды; выращивают на качалках (240 об/мин) в течение 31 ч. Клетки осаждают центрифугированием при 5000 об/мин в течение 20-25 мин, промывают физиологическим раствором и подвергают гидролизу в 5%-ном растворе КОН (100 мл на 10 г влажных клеток) в течение 1,5-2,0 ч. Гицролизат диализуют против водопроводной, а затем дистиллированной воды до нейтрального значения рН, центриф угиру- ют для осаждения неразрушенных клеток, а также загрязняющих компонентов клеточной стенки при 5000 об/мин в течение 20-25 мин, Полисахарид осаждают из надосадоч- ной жидкости добавлением 5-ти объемов спирта. Осадок полисахарида освобождают от липидов последовательной обработкой ацетоном, эфиром, а затем смесью хлороформа с метанолом (2:1) и подвергают ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-ТСК геле. Полисахарид, целевой продукт, элюи- руют 0,50 М раствором , рН 6,0, Фракции полисахарида собирают, диализу- ют против водопроводной, а затем дистиллированной воды, лиофильно высушивают.

Гомогенность полисахарида показана гель-фильтрацией на сефарозе 6В (фиг.1), В целевом продукте содержится 80 ±5% уг- леводоров.

Моносахаридный состав целевого продукта изучали методом газожидкостной хроматографии (фиг.2), а также 13С-ЯМР спектроскопии. Установлено, что полисахарид состоит из тетрасахаридных повторяющих звеньев, представленных остатками рамнозы (двумя) и остатками галактозы (двумя), к С4 и С6 которой присоединяется пи- ровиноградная кислота.

Молекулярная масса полисахарида, установленная методами гельхроматографии на сефарозе 6В, а также седиментации и диффузии, составляет 60 000.

Выход очищенного полисахарида составляет 4-5% сухой массы клегок.

Полученный полисахарид проверяют на интерферониндуцирующую активность.

Индукцию интерферона в опытах In

vitro проводили внесением в суспензию лейкоцитов периферической крови человека (5 106 клеток/мл)полисахарида в конечной концентрации 200 мкг) в пробе. Смесь

инкубируют при 37°С в течение 24 ч, затем центрифугируют, В опытах In vivo животным (мыши линии СВА с массой 18-20 г) внутри- брюшинно вводят полисахарид в дозе 10 и 100 мкг/мышь в 0,5 мл. Через 4 и 24 ч после

введения полисахарида мышь декапитиру- ют и собирают пул сывороток, получают спленоциты общепринятым методом путем разволокнения ткани селезенки. Ложный сывороточный интерферон получают, вводя животным вместо полисахарида алланто- исную жидкость. В полученном материале (сыворотки, суспензии спленоцитов, культу- ральная среда) определяют активность интерферона по способности подавлять

цитотоксическое действие вируса-индикатора (вирус везикулярного стоматита - ВВС), 100 тканевых цитопатогенных доз (ТЦД)мл. Учет результатов проводили через 48 ч. Зэ единицу активности принимают величины, обратные максимальному разведению интерферона, предотвращающему на 50% цитопатическое действие 100ТЦЦ ВВС в культуре перевиваемых человеческих лейкоцитов линии или культурами мышиных

фибробластов линии 1-929 соответственно

Тип интерферона определяют по инги- бированию активности интерферона специфическими моноклинальными антителами к препаратам у-и а-типам человеческого

интерферона.

В опытах in vitro интерферониндуциру- ющая активность полисахарида составила 1920 ± 580ИЕ50/МЛ.

При изучении интерфероногенной актив;:ости в опытах in vivo было установлено, что внутрибрюшинное введение его в дозе 0,5-5,0 мг/мг спустя 4 ч вызывает образование интерферона в селезенках и сыворотках крови мышей, При этом оказалось, что введение полисахарида в дозе 0,5 мг/кг вызывало продукцию интерферона гораздо более эффективнее по сравнению с другими исследованными дозами.

При сравнительном изучении интерфероногенной активности известных препаратов продигиозана установлено, что предлагаемый полисахарид более эффективен (табл.).

Предлагаемый полисахарид не является токсичным даже в дозе 40 мг/кг (ЛДбо продигиозана равна 2-3,5 мг/кг). не обладает побочными эффектами, Продигиозан вызывает повышение температуры тела примерно у 30% больных через 2-4 ч после инъекции до субфебриальных цифр.

Таким образом, предлагаемый нами штамм 7694 С. sepedonlcum является новым штаммом, продуцирующим полисахарид, являющийся активным индуктором у-интерферона.

Выращивание культуры продуцента более, чем в 10 раз дешевле выращивания В. prodiglosum.

Полисахарид в отличие от продипшзака является токсичным и не обладает побочными действиями.

Изобретение может быть использовано в микробиологической и медицинской промышленности, при этом не требуется дополнительных ассигнований для осуще- ствления технологических процессов выращивания продуцента и выделения из него полисахарида.

Интерфероногенная активность полисахарида Corynebacterium sepedonlcum ЛМВ 7694 и продигиозана Bacterium prodlgoosum приведена в таблице.

Формула изобретения

Штамм бактерий Coryaebacterium sepedonicum ВНИИА 1857 - продуцент полисахарида, индуцирующего образование

интерферона.

Использование: полисахарид может быть использован в профилактике и лечении опухолевых процессов, а также различных иммунодефицитных состояний. Сущность изобретения: Штамм Corynebacterlum sepedonicum ВНИИА 1857 является продуцентом полисахарида, индуцирующего образование интерферона с высокой активностью. Штамм Corynebacterlum sepedonicum выделен из клубней картофеля. При росте на жидкой синтетической среде, в которой в качестве источника азота используется хлористый аммоний, а углерода - глюкоза (стоимость 1 л среды составляет 16 коп), клетки синтезируют полисахарид, обладающий способностью индуцировать образование интерферона лейкоцитами периферической крови человека, а также культурами мышиных фибробластов. Полисахарид состоит из следующих моносахаридов: рамнозы и галактозы. Кислая природа полисахарида обусловлена присутствием пировИног- радной кислоты. 2 ил. 1 табл.

Аьдо

iy

1,110ф

0,8

Ofi

0,1

I li I

/ г j Ј s § 7