СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МИЕЛОПИДА Российский патент 1995 года по МПК A61K35/28 

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии и может быть использовано в производстве иммунологически активного препарата миелопида.

Описан способ получения миелопида, ранее известного как стимулятор антителопродуцентов, путем выделения клеток из костного мозга свиньи, их культивирования в питательной среде, отделения супернатанта центрифугированием, концентрирования и выделения целевого продукта гельхроматографией на колонке, заполненной сефадексом G-50. Фракции, элюированные в области выхода цитохрома G с молекулярной массой около 13000 Da, концентрируют лиофилизацией.

Известен также способ получения миелопида путем культивирования клеток костного мозга в питательной среде, отделения супернатанта центрифугированием, концентрирования, гельфильтрации концентрированного супернатанта на колонке с сефадексом G-25, отбора фракций с мол.массой 1000-2000 и обессоливание на колонке с сефадексом С-10. Готовый продукт высушивают лиофилизацией.

Недостатком известных способов является небольшой выход препарата (из 1 кг незачищенных костей, 1,0^.10¹⁰ клеток костного мозга получают 25-30 доз препарата) и его низкая удельная активность. Миелопид стандартизировали так, чтобы 1 доза препарата содержала 3 мг белка, определенного методом Лоури. Индекс стимуляции составлял не менее 1,6 при концентрации препарата 50 мкг/мл.

Цель изобретения повышение иммуностимулирующей активности миелопида.

Поставленная цель достигается тем, что клетки костного мозга свиней культивируют в питательной среде, супернатант отделяют центрифугированием, подвергают ультрафильтрации на мембранах с порогом проницаемости 10.000 Da при температуре от +4^оС до комнатной, затем концентрируют лиофилизацией, проводят гель-хроматографию на сефадексе G-25, отобранные фракции с молекулярной массой 600-3000 Da повторно концентрируют лиофилизацией.

Отличительным приреалом способа является то, что выделение целевого продукта проводят ультрафильтрацией на мембранах с порогом проницаемости 10.000 Da при температуре от +4^оС до комнатной.

Более подробно способ осуществляют следующим путем.

Костный мозг из реберных костей свиней после их измельчения вымывают встряхиванием в термостатируемом шейкере при 37^оС в течение 1 ч в бессывороточной питательной среде 199. Далее клетки отмывают двукратным центрифугированием и помещают в среду для культивирования. Среда для культивирования готовится на основе 199 среды. Культивирование осуществляют в термостатируемом шейкере или в роллерной установке при 37^оС в течение 20 ч. Супернатант отделяют от клеточной массы центрифугированием при температуре +4^оС со скоростью 8000 об/мин в течение 20 мин.

Полученный супернатант культуры клеток костного мозга подвергают ультрафильтрации на кассетах фирмы "Миллипор" с порогом проницаемости 10000 Da при температуре от +4^оС до комнатной и избыточном давлении на входе системы 0,5 атм. Полученный на выходе стерильный ультрафильтрат лиофилизируют при температуре (-30)-0^оС. Сухой лиофилизированный продукт растворяют в стерильной апирогенной воде, центрифугируют, осветленный концентрат подвергают микрофильтрации, а затем гель-хроматографии на колонке, заполненной сефадексом G-25, отобранные фракции с молекулярной массой 600-3000 Da повторно подвергают лиофилизации. Из 1 кг сырья (1,0х10¹⁰ клеток) получают 250-300 доз препарата.

Проверка заявленного технического решения на соответствие его критерию "Изобретательский уровень" показала, что ни в патентной ни в научно-технический литературе не обнаружено совокупности признаков, приведенной в формуле изобретения.

Ниже приводятся конкретные примеры исполнения способа и анализа биологических свойств миелопида.

П р и м е р 1. 25 кг зачищенных реберных костей свиней измельчают в стерильных условиях. К гомогенизату добавляют 3 литра стерильной 199 среды. Суспензию встряхивают на шейкере при 37^оС в течение 1 ч для вымывания клеток костного мозга. Фильтрацией отделяют содержащий клетки супернатант объемом 3 л. Клетки дважды отмывают центрифугированием 199 средой при температуре +4^оС. Полученные клетки объемом 50 мл (15-25^.10¹⁰) заливают 25 л и 199 среды, доводя концентрацию клеток до 10¹⁰ клеток/литр и инкубируют в течение 20 ч при 37^оС. Клетки отделяют центрифугированием при 5000 об/мин при температуре +4^оС. Супернатант объемом 25 л подвергают ультрафильтрации на мембранах фирмы "Millipor" проницаемостью 10.000 дальтон при давлении не более 0,5 атм и температуре +4^оС. Полученный фильтрат объемом 23 л лиофильно высушивают при температуре (-30^оС)-0^оС. Сухой продукт растворяют при +4^оС в 350 мл апирогенной стерильной воды в течение 30 мин при интенсивном перемешивании. Нерастворившийся осадок отделяют центрифугированием при 8000 об/мин при +4^оС в течение 20 мин. Супернатант объемом 300 мл стерильно фильтруют на фильтре с диаметром пор 0,2 мкм и наносят на колонку с сефадексом G-25 размером 10х100 см. Гель-хроматографию проводят в стерильных условиях при +4^оС, используя в качестве элюата 10 mМ фосфатный буфер рН 7,00, отбирая фракцию с мол. массой, соответствующей 2000 Da. Концентрацию миелопида в полученном элюате доводят до 0,1-0,2 мг/мл добавлением стерильного 10 mМ фосфатного буфера рН 7,0. Раствор миелопида стерильно фильтруют через фильтр с диаметром пор 0,2 мкм, разливают во флаконы по 3 мл и лиофильно высушивают при температуре (-30)-0^оС.

Выход продукта составляет 300 доз препарата с содержанием белка по Лоури 0,3-0,6 мг/дозу. Коэффициент стимуляции составляет при этом 1,9.

П р и м е р 2. Способ осуществляют аналогично описанному в примере 1, но проводят ультрафильтрацию на мембранах с порогом проницаемости 10000 Da при комнатной температуре.

Выход миелопида 350 доз (из 10¹⁰ клеток костного мозга) с коэффициентом стимуляции 1,8.

П р и м е р 3. Эффект стимуляции антителообразования оценивают на пике иммунного ответа к эритроцитам барана in vitro, добавляя тестируемый материал в культуру клеток лимфатических узлов, полученных от мышей на четвертые сутки после иммунизации.

Коэффициент стимуляции рассчитывают как отношение количества антителообразующих клеток (АОК) в культуре с тестируемым образцом к количеству АОК в контрольной культуре.

Антителостимулирующий эффект миелопида, полученного известным и предложенным способами, приведен в табл.1.

Из данных табл.1 следует, что миелопид, полученный предложенным способом, имеет в 100 раз большую удельную активность.

Антителостимулирующий эффект миелопида при разных температурах процесса ультрафильтрации приведен в табл.2.

Проведение процесса ультрафильтрации при температуре выше комнатной или ниже +4^оС приводит к снижению выхода и потере активности препарата.

Миелопид, полученный по предлагаемому способу, имеет в 100 раз большую удельную иммуностимулирующую активность, что позволяет снизить дозу вводимого препарата при лечении и из одного и того же количества клеток костного мозга получать в 10 раз больше доз.

Изобретение относится к медицине, а именно, к способу получения иммуномодулятора миелопида. Предложенный способ заключается в том, что клетки костного мозга свиньи культивируют в питательной среде, отделяют супернатант центрифугированием, последний подвергают ультрафильтрации на мембранах с порогом проницаемости 10.000 Да при температуре от +4°С до комнатной, затем концентрируют лиофилизацией, проводят гель-хроматографию на сефадексе G 25, отобранные фракции с молекулярной массой 600 3000 Д повторно концентрируют лиофилизацией. Предложенный способ по сравнению с известным, позволяет получить миелопид с большей иммуностимулирующей активностью, что влечет за собой снижение лечебной дозы препарата и увеличение числа доз, получаемых из одного и того же количества клеток костного мозга. 2 табл.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МИЕЛОПИДА путем приготовления суспензии клеток костного мозга свиньи, их инкубирования в питательной среде, отделения супернатанта с последующим выделением целевого продукта, отличающийся тем, что целевой продукт дополнительно очищают ультрафильтрацией на мембранах с порогом проницаемости 10 000 D а при температуре от +4^oС до комнатной и гельфильтрацией на сефадексе G 25, и отбирают фракцию с молекулярной массой 600 3 000 Dа.