СПОСОБ ИММОБИЛИЗАЦИИ КЛЕТОК МИКРООРГАНИЗМОВ В СОРБЕНТ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ОЧИСТКИ НЕФТЕЗАГРЯЗНЕНИЙ Российский патент 2011 года по МПК C12N11/00 C12N1/26 

Изобретение относится к области биотехнологии, создающей средства для очистки окружающей среды. Предлагается новый промышленный способ иммобилизации клеток микроорганизмов в сорбент, используемый для очистки нефтезагрязненных почв и акваторий. Применение биосорбента, получаемого заявляемым способом, позволяет осуществлять очистку больших пространств водной поверхности, болотистых участков и участков суши от последствий разливов нефтепродуктов, в том числе и тонких радужных пленок.

Биосорбент - это сорбент-носитель с иммобилизованными микроорганизмами нефтедеструкторами.

Сейчас в мире производится или используется для ликвидации разливов нефти около двух сотен различных сорбентов, которые подразделяются на: неорганические, природные органические, органоминеральные, а также синтетические. Такое большое количество различных видов сорбентов свидетельствует о неудовлетворенности потребителей качеством известных сорбентов и поиском новых видов, удовлетворяющих соотношению «цена-качество». Качество сорбентов определяется главным образом их емкостью по отношению к нефти, степенью гидрофобности (ненамокаемости в воде), плавучестью после сорбции нефти, возможностью десорбции нефти и регенерации или утилизации сорбента.

Существуют следующие способы иммобилизации биогента на сорбенте-носителе.

1. Механическое смещение сорбента и биоагента.

Недостаток данного способа в том, что при нанесении данного сорбента на поверхность воды происходит разделение сорбента и биоагента. Биосорбент, полученный таким способом, эффективен только для очистки почвы.

2. Близким к заявляемому способу является способ получения биопрепарата для очистки водной среды от загрязнения нефтепродуктами, описанный в патенте РФ №2255052 (13) С2 (51) 7 C02F 3/34, C12N 11/04, B01J 20/22, B01J 20/30, C12N 11/04, C12RE 01, C02F 3/34, C12N 11/04, B01J 20/22 «СПОСОБ ОЧИСТКИ ВОДНОЙ СРЕДЫ ОТ ЗАГРЯЗНЕНИЯ НЕФТЕПРОДУКТАМИ И БИОПРЕПАРАТ ДЛЯ ОЧИСТКИ ВОДНОЙ СРЕДЫ ОТ ЗАГРЯЗНЕНИЙ НЕФТЕПРОДУКТАМИ». Указанный в данном патенте способ получения биопрепарата заключается в том, что вещество носителя, вещество-фактор роста микроорганизмов и биомассу микроорганизмов-нефтедеструкторов, иммобилизованную посредством рассосредоточения биомассы микроорганизмов-нефтедеструкторов в массе вещества носителя с физическим соединением их с веществом носителя. В качестве вещества носителя применена композиция из Са-альгинатного геля, н-алканов с C₁₄-C₁₆ и вещества-фактора роста микроорганизмов, при этом физическое соединение микроорганизмов-нефтедеструкторов с веществом носителя осуществлено посредством образования капель из смеси суспензированной биомассы с ингредиентами композиции вещества носителя и полимеризации капель с образованием гранул в водном растворе, содержащем ионы Са. Для иммобилизации микроорганизмов-нефтедеструкторов посредством рассосредоточения биомассы микроорганизмов-нефтедеструкторов в массе вещества носителя с физическим соединением их с веществом носителя приготавливают 1% водную смесь с альгинатом натрия (например, в количестве 100 мл для упомянутого количества суспензии биомассы), тщательно ее перемешивают и выдерживают в течение 2÷3 часов для завершения абсорбции фрагментами альгината натрия. К полученной таким образом смеси с альгинатом натрия добавляют факторы роста, например кукурузный экстракт в количестве 10 г на 100 мл смеси. Смесь с альгинатом натрия и суспензированной биомассы в равных объемах смешивают посредством гомогенезатора в течение 2÷3 минут, далее посредством насоса нагнетают через насадку в зону воздействия воздушной струи, подаваемой в область эжектирования, например, для образования гранул от 0,18 до 0,55 мм со скоростью 0,002 м³/мин. Образующиеся при воздействии воздушной струи на струю смеси капли попадают в водный раствор, содержащий ионы Са (например, 2% водный раствор CaCL₂), где вследствие химического соединения ионов кальция с альгинатом натрия и полимеризации в процессе выдержки (например, в течение 30 мин) с образованием в каплях Са-альгинатного геля они приобретают свойства обособленного тела и становятся гранулами. При этом имеет место физическое соединение микроорганизмов-нефтедеструкторов с веществом гранул, а полученные таким образом гранулы являются носителями рассосредоточенной суспендированной биомассы иммобилизованных микроорганизмов-нефтедеструкторов и где в качестве вещества носителя применена композиция из Са-альгинатного геля, н-алканов с С14-С16 и вещества - фактора роста. Гранулы фильтруют, промывают и помещают в физиологический раствор.

Недостатком данного способа является то, что в результате его использования получен биопрепарат, который не является биосорбентом, имеет малый срок нахождения в водной среде - размокает и разлагается.

Существуют биопрепараты, где биоагент готовится в виде водно-масляной суспензии биоагента, что обеспечивает быстрый контакт биопрепарата с нефтепродуктами и жидкостями, обладающими олеофильными свойствами, например см. патент РФ №2180276 С1 от 2001.02.19, «ОЛЕОФИЛЬНЫЙ БИОПРЕПАРАТ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ОЧИСТКИ НЕФТЕЗАГРЯЗНЕННОЙ ПОЧВЫ». Цель вышеуказанного изобретения - создание на основе бактериальных сурфактантных комплексов эффективного экологически безопасного олеофильного биопрепарата, пригодного для ускорения естественного процесса биодеструкции нефтяных углеводородов в почве. Т.е. данный препарат предназначен только для использования очистки загрязненных почв, а для очистки нефтеразливов на акваториях данный препарат не предназначен, т.к. при попадании олеофильного препарата в воду он тонет.

3. Наиболее близким к заявляемому способу являются: Способ получения биосорбента, описанный в патенте RU (11) 2299181, (13) С2, (51) МПК C02F 3/34 (2006.01), C12N 1/26 (2006.01), C12R 1/77 (2006.01) C12R 1/645 (2006.01) «БИОСОРБЕНТ ДЛЯ ОЧИСТКИ ВОДНОЙ ПОВЕРХНОСТИ ОТ НЕФТИ И НЕФТЕПРОДУКТОВ» и аналогичный способ получения биосорбента» описанный в патенте RU (11)2318736, (13) С2, (51) МПК C02F 3/34 (2006.01), C12N 1/26 (2006.01) «БИОСОРБЕНТ ДЛЯ ОЧИСТКИ ВОДОЕМОВ ОТ НЕФТЕПРОДУКТОВ НА ОСНОВЕ ШТАММОВ БАКТЕРИЙ И ДРОЖЖЕВЫХ ГРИБОВ». Способ изготовления биосорбента, согласно RU (11) 2299181, (13) С2, (51) МПК C02F 3/34 (2006.01), C12N 1/26 (2006.01), C12R 1/77 (2006.01), C12R 1/645 (2006.01) «БИОСОРБЕНТ ДЛЯ ОЧИСТКИ ВОДНОЙ ПОВЕРХНОСТИ ОТ НЕФТИ И НЕФТЕПРОДУКТОВ», заключается в иммобилизации в гидрофобный сорбент нефти биомассы штаммов микромицета Fusarium lateritium НК-204 или Gliocladium deliquescens НК-205 или Gliocladium deliquescens НК-206 или консорциума этих штаммов, посредством обрастания мицелием грибов сорбента, помещенного на питательную среду. Далее полученный препарат сушат. Сорбент выполнен из гидрофобного сорбента нефти на основе торфа. Мицелий грибов составляет 20÷50% по сухому весу.

И аналогичный способ получения биосорбента, описанный в патенте RU (11) 2318736, (13) С2, (51) МПК C02F 3/34 (2006.01), C12N 1/26 (2006.01) «БИОСОРБЕНТ ДЛЯ ОЧИСТКИ ВОДОЕМОВ ОТ НЕФТЕПРОДУКТОВ НА ОСНОВЕ ШТАММОВ БАКТЕРИЙ И ДРОЖЖЕВЫХ ГРИБОВ». Данный способ получения биосорбента включает иммобилизацию на нефтяном гидрофобном сорбенте дрожжевых грибов Candida lipolytica, Candida guilliermondii, Pichia guilliermondii и культур бактерий Rhodococcus erythropolis, Arthrobacter sp. в количестве от 10 до 50 процентов (по сухому весу) посредством обрастания мицелием грибов сорбента с последующей сушкой на воздухе.

Недостатки вышеописанных способов получения биосорбентов:

- результатом использования этих способов является сорбент, у которого при обрастании основная микробная масса сосредотачивается на поверхности биосорбента и при нанесении такого биосорбента на поверхность нефтеразлива в воде, большая часть этого биоагента смывается с поверхности сорбента и работает как самостоятельный нефтедеструктор. В сорбенте, оставшемся без большей части микробной массы, сорбированная часть нефтепродукта утилизируется значительно медленнее, в связи с резким снижением концентрации микроорганизмов в биосорбенте.

- получение биосорбентов осуществлялись в лабораторных условиях в небольшом объеме, и эти способы не подходят для многотоннажного производства. Процесс получения вышеуказанного биосорбента прерывный, зависящий от времени обрастания сорбента грибами, которое колеблется от нескольких суток до месяца. Обрастание гидрофобного сорбента биомассой требует реакторов, в которых выдерживаются специальные условия - температура, влажность и т.д. и дополнительных сушильных камер размером в сотни квадратных метров. При этом равномерность распределения в массе сорбента дрожжевых грибов и микроорганизмов - нефтедеструкторов (далее по тексту - биоагентов) в объеме сорбента не обеспечивается.

Задача, стоящая перед разработчиками заявляемого способа, - разработать промышленно пригодный высокопроизводительный способ, обеспечивающий изготовление олеофильного биосорбента стабильно высокого качества, имеющего в своем составе биоагенты.

Технический результат от использования заявляемого изобретения - повышение качества очистки нефтезагрязнений за счет повышенного качества биосорбента, изготавливаемого по заявляемому способу, а именно - в биосорбенте выполняется более равномерное распределение биоагентов по всему объему сорбента при надежной фиксации биоагента на поверхности и внутри сорбента. При этом для производства сорбента по заявляемому способу, по сравнению с известными способами, уменьшаются размеры используемых производственных площадей и время производства сорбента (например, в камере объемом 0,5 м куб. объем выпускаемой продукции достигает 80 кг/час). Способ управляем, более экологичен, т.к. выполняется в камере.

Заявляется новый способ изготовления такого биосорбента, в котором имеется стабильно надежная фиксация биоагента внутри сорбента, при этом при попадании в воду биоагент не тонет и не вымывается из сорбента. За счет надежной фиксации биоагента такой биосорбент может одинаково хорошо использоваться как для очистки почв, так и для очистки воды при ликвидации и интенсивных загрязнений, и тонких радужных пленок.

В основу заявляемого способа положено свойство олеофильного сорбента сорбировать масло или нефть. При изготовлении биосорбента в закрытой камере в потоке воздуха смешивают находящиеся во взвешенном состоянии частицы сорбента с каплями аэрозоля, представляющими собой смесь олеофильной составляющей и культуральной жидкости с микробными клетками-нефтедеструкторами.

На сорбент, который обладает пористой структурой с размерами пор от 100 до 300 мкм, попадают капли аэрозоля, размер которых может быть от 15 до 25 мкм. Капли аэрозоля оседают на поверхности сорбента и проникают вовнутрь его пор. Размеры частиц сорбента могут лежать в диапазоне от 1-го до 3-х мм в диаметре. Размер различных микроорганизмов-нефтедеструкторов может быть от 0,9 до 15 мкм, что позволяет им находиться в составе капель аэрозоля и попадать в поры сорбента. При поглощении сорбентом биоагента частицы сорбента утяжеляются ненамного. Почти не уменьшается сорбционная способность биосорбента, по сравнению с исходным сорбентом.

- Заявляемый способ является управляемым за счет того, что процесс выполняется в камере в течение подобранного предварительно в ходе экспериментов времени, где потоки сорбента и эмульсии подаются с заданной интенсивностью, температурой, давлением.

- Выполнение смешивания в закрытой камере также позволяет обеспечить экологическую чистоту данного процесса.

- Способ экономичен и прост, не требует сложного оборудования и высоких затрат при массовом производстве. Смешивание аэрозолей может выполняться известными средствами - при помощи пневматических распылителей для сорбента и распылителя для жидкостей, соединенных с дозаторами сорбента и жидкости.

- Данный способ является универсальным для различных гидрофобных олеофильных сорбентов, т.к. может использоваться для иммобилизации любых нефтедеструктирующих биоагентов в различных гидрофобных олеофильных сорбентах, т.к. частицы сорбента имеют размер - 1÷3 мм в диаметре, а размер капель масляного или нефтяного аэрозоля 15÷25 мкм.

Описание способа

Способ иммобилизации клеток микроорганизмов в гидрофобный олеофильный сорбент, используемый для очистки нефтезагрязнений, заключается в смешивании двух аэрозолей до заданной степени насыщения сорбента биоагентом. Первый аэрозоль состоит из газовой среды, в которой во взвешенном состоянии находятся частицы сорбента. Второй аэрозоль состоит из газовой среды, в которой во взвешенном состоянии находится смесь или масла, или нефтепродукта и культуральной жидкости с биоагентом. Масляный или нефтяной аэрозоль содержит, соответственно, масляную или нефтяную основу, смешанную с культуральной жидкостью с микробными клетками-нефтедеструкторами с биотитром 10⁹-10¹⁰ КОЕ/мл, обеспечивающими разрушение нефтепродуктов, поглощенных в последующем биосорбентом.

В камере создают смесь из сорбентного и масляного или нефтяного, нетоксичного для используемых микроорганизмов (носителей биомассы штаммов микробных клеток-нефтедеструкторов), аэрозолей.

По определению «Аэрозоль - дисперсная система, состоящая из мелких твердых или жидких частиц, взвешенных в газовой среде (обычно в воздухе)». (См. - Википедия).

Для получения аэрозолей используется стандартное оборудование - распылители твердых и жидких веществ, а для задания необходимых объемов - дозаторы.

Частицы сорбента имеют размер - 1÷3 мм в диаметре.

Размер капель масляного или нефтяного аэрозоля 15÷25 мкм.

Капли масляного или нефтяного аэрозоля попадают на поверхность и в поры гидрофобного сорбента, обеспечивая быстрый контакт и внедрение микробных клеток в разветвленную структуру гидрофобного сорбента. В камере процесс иммобилизации микробных клеток, содержащихся в масле или в нефти, в частицы сорбента в количествах, обеспечивающих содержания биоагента, - не менее 10⁹ живых клеток на 1 г сорбента. Эта величина определена расчетно и обеспечивается в производстве посредством забора проб и последующего лабораторного контроля.

В качестве сорбента может быть использован любой гидрофобный олеофильный сорбент, например торфосорбент или органоминеральный сорбент.

Пример выполнения

Используя заявляемый способ, заявители наладили объем выпускаемой продукции до 80 кг/час в камере объемом 0,5 м³.

С применением заявляемого способа выпускается экологически чистый гидрофобный торфоминеральный нефтяной сорбент под названием "Биосорбонафт".

Для производства биосорбента в качестве сорбента-носителя миркоорганизмов был выбран гидрофобный торфяной сорбент - "Сорбонафт" - 99% (способ получения которого описан в патенте на изобретение РФ №2336125) и водно-масляная эмульсия, содержащая микроорганизмы-нефтедеструкторы - 1%.

В качестве штаммов, обеспечивающих разрушение нефтепродуктов - один или несколько штаммов микробных клеток ZOOGLOEA SP. 14H, ARTHROBACTER SP. 13H, ARTHROBACTER SP. 15H, BACILLUS SP. 3H, BACILLUS SP. 12 Н, ИСПОЛЬЗУЕМЫХ ДЛЯ РЕМЕДИАЦИИ ВОДОЕМОВ И ПОЧВ, ЗАГРЯЗНЕННЫХ НЕФТЬЮ И НЕФТЕПРОДУКТАМИ, ИЛИ АССОЦИАЦИЯ ШТАММОВ МИКРООРГАНИЗМОВ-ДЕСТРУКТОРОВ НА ИХ ОСНОВЕ (Патент на изобретение РФ №2266958).

В качестве носителя биомассы штаммов микробных клеток-нефтедеструкторов выбрано жидкое масло.

Также как и сорбент «Сорбонавт», сорбент "Биосорбонафт" имеет поглотительную способность сорбента по эталонному нефтепродукту 650%, размер частиц насыпного сорбента 1÷3,0 мм. Данный сорбент обладает пористой структурой, хорошо адсорбирует нефть (350-800%) и дизтопливо (300-350%). Однако у биосорбента есть преимущество перед сорбентом - обработка нефтяного пятна биосорбентом блокирует его дальнейшее распространение (эффект физико-химических бонов), что позволяет собрать более 90% этого загрязнителя, т.к. нефтепродукты являются пищей для микроорганизмов, в то время, как пятно, обработанное простым сорбентом может растекаться дальше после насыщения сорбента нефтепродуктами.

Биоразложение практически решает вопрос утилизации сорбентов после использования, что существенно упрощает их применение.

В другом варианте исполнения биосорбента в качестве носителя биомассы штаммов микробных клеток-нефтедеструкторов выбрана нефть Усинского месторождения.

В третьем варианте исполнения биосорбента в качестве сорбента выбран органоминеральный сорбент.

Заявляемый способ позволяет менять компоненты, используемые для получения биосорбента и получать требуемый биосорбент.

При сорбции нефтепродуктов в биосорбент собираемые нефтепродукты смешиваются с имеющимся внутри биосорбента маслом или имеющейся нефтью. Находящиеся внутри микробные клетки беспрепятственно перемещаются в среде масло-нефть или нефть-нефть, при этом часть микробных клеток попадает из сорбента на пятно разлитых нефтепродуктов и разрушает это пятно, находясь вне частицы баосорбента.

Расчетным путем определено, что биосорбент должен содержать не менее 1×10⁹ живых клеток в 1 г сорбента-носителя. Характеристики микробных клеток определены их паспортными данными. Определение степени насыщения сорбента микробными клетками за определенное время определяется при заборе проб и высевании этих клеток - по известным методикам перед началом серийного производства.

Если сорбент «Сорбонавт» после насыщения нефтепродуктами требует утилизации, то биосорбент, вобравший в себя максимальное количество нефтепродуктов, может опуститься на дно водоема. Имеющиеся внутри биосорбента биоагенты с большой вероятностью уничтожат отсорбированный нефтепродукт. Оставшись без питания, биоагенты погибнут, и на дне останется слой торфа, не нарушающий экологию Земли.

Биосорбенты, полученные по заявляемому способу, характеризуются высокой биодеструкционной активностью при ликвидации и интенсивных загрязнений, и тонких радужных пленок.

Изобретение относится к биотехнологии. Способ включает смешивание аэрозоля, включающего гидрофобный олеофильный сорбент, используемый для очистки нефтезагрязнений, с аэрозолем, включающим смесь или масла, или нефтепродукта и культуральной жидкости с микробными клетками-нефтедеструкторами. Полученный биосорбент поглощает и разлагает как большие разливы нефтепродуктов, так и тонкие радужные пленки. Способ позволяет получить биосорбент с равномерным распределением биоагентов по всему объему сорбента при надежной фиксации биоагента на поверхности и внутри сорбента. Вышесказанное позволяет использовать биосорбент как для очистки почв, так и для очистки воды. 5 з.п. ф-лы.

1. Способ иммобилизации клеток микроорганизмов в гидрофобный олеофильный сорбент, используемый для очистки нефтезагрязнений, заключающийся в смешивании в камере аэрозоля, включающего в себя сорбент, и аэрозоля, включающего смесь или масла, или нефтепродукта и культуральной жидкости с микробными клетками-нефтедеструкторами.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве сорбента используют торфяной сорбент.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что используют сорбент с размером частиц 1-3 мм в диаметре.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что используют культуральную жидкость с микробными клетками-нефтедеструкторами с титром 10⁹-10¹⁰ КОЕ/мл.

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что используют масляный аэрозоль с размером капель 15÷25 мкм.

6. Способ по п.1, отличающийся тем, что иммобилизацию продолжают до содержания микробных клеток в сорбенте не менее 10⁹ живых клеток на 1 г сорбента.