УСТРОЙСТВО ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ РЕПЛИК ЭЛЕКТРОФОРЕГРАММ Российский патент 1994 года по МПК G01N33/00 G01N27/26 B01D57/02 

Изобретение относится к устройствам для осуществления переноса фракций биополимеров из пористых носителей, например гелевых пластин, на сорбирующие мембраны и может быть использовано в области биологии, молекулярной генетики, медицины и в других подобных областях для получения, с целью тиражирования и последующего анализа, реплик электрофореграмм биополимеров после проведения их электрофоретического разделения на носителе.

Известны устройства для переноса фракций белков из пластин геля на нитроцеллюлозные мембраны за счет диффузии [1] или использования капиллярных сил [2] . Эти устройства крайне просты конструктивно, однако процесс переноса очень продолжителен и длится 36-48 ч в первом случае и 10-20 ч - во втором. Это существенный недостаток, ограничивающий применение этих устройств в практике анализа биополимеров.

Известно устройство [3] для переноса молекул биополимеров, в котором используется метод электрофоретической элюции фрагментов биополимеров, предварительно разделенных в пластинах полиакриламидного геля с применением известных устройств для проведения электрофореза исследуемого объекта в пористом носителе.

Устройство состоит из камеры переноса, представляющей собой емкость с буферным раствором, в которой установлены электроды, по меньшей мере одна перфорированная кассета со слоистой структурой, состоящей из носителя электрофореграммы, например пластины геля, сорбирующей мембраны и дренажной пластины из пористого материала, обеспечивающей контакт носителя с мембраной.

При подаче напряжения от источника постоянного тока на электроды в камере переноса обеспечивается однородное электрическое поле, обусловливающее электрофоретическое перемещение фракций биополимеров с носителя на сорбирующую мембрану, которая по окончании процесса переноса (обычно через 40-60 мин) извлекается из кассеты и может быть подвергнута обработке и анализу известными способами.

Однако устройства для проведения электроблоттинга (под таким названием известен описанный процесс) имеют достаточно сложную конструкцию.

Кроме того, сам процесс переноса вследствие его продолжительности не позволяет проводить экспресс-анализы и неблагоприятен с экологической точки зрения из-за необходимости использования больших количеств (до 5000 мл) буферного раствора.

Указанных недостатков частично лишены устройства [4, 5, 6], предназначенные для осуществления так называемого "полусухого" элекроблоттинга.

В этих устройствах в кассете, одновременно являющейся камерой переноса, слоистая структура, состоящая из тех же компонентов (носитель электрофореграммы, сорбирующая мембрана и смоченные буфером дренажные пластины), помещена между электродными пластинами. Работает устройство аналогично описанному.

Основным недостатком устройства для проведения "полусухого" электроблоттинга является длительность процесса переноса, составляющая 40-60 мин.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату является устройство [7] для получения реплик электрофореграмм, содержащее камеру переноса, имеющую опорный элемент, на рабочей поверхности которого расположена по меньшей мере одна слоистая структура, включающая в себя носитель электрофореграммы, сорбирующий элемент и аккумулятор элюирующей жидкости.

Слоистая структура формируется следующим образом: на рабочую поверхность опорного элемента, представляющую собой плоскую перфорированную пластину последовательно укладываются дренажная пластина, например, из пористого полиэтилена, увлажненная буфером сорбирующая мембрана, пластина геля-носитель электрофореграммы.

Сверху на образованную слоистую структуру устанавливается уплотняющая прокладка и крышка в виде рамки, образующая емкость, которая заполняется буферным раствором и является аккумулятором элюирующей жидкости.

Под перфорированной пластиной находится штуцер для подсоединения вакуумного насоса, при включении которого внутри камеры переноса создается пониженное, по сравнению с атмосферным, давление, способствующее процессу элюции молекул биополимеров на сорбирующую мембрану.

Процесс носит название вакуумного блоттинга.

Основной недостаток устройства для проведения вакуумного блоттинга заключается в длительности (30-60 мин) процесса переноса. Дальнейшее увеличение производительности устройства ограничено разностью давлений воздуха по обе стороны гелеевой пластины, которая не может быть более 1 кг/см².

Сущность изобретения состоит в том, что устройство снабжено приводом, обеспечивающим вращение камеры переноса, а рабочая поверхность опорного элемента выполнена цилиндрической и отстоит от оси вращения камеры на величину радиуса цилиндрической поверхности.

При вращении камеры переноса молекулы биополимеров под действием центробежных сил элюируются из гелевой пластины и сорбируются на мембране.

Цилиндрическая форма рабочей поверхности опорного элемента и равномерное удаление ее от оси вращения обеспечивают однородность поля центробежных сил в гелевой пластине. При этом величина центробежной силы, определяющая величину скорости элюирования молекул биополимеров из пластины геля, прямо пропорциональна расстоянию гелевой пластины от оси вращения камеры переноса и квадрату частоты вращения этой камеры вокруг указанной оси. Следовательно, время получения реплик электрофореграмм будет уменьшаться с увеличением центробежной силы.

При исследовании уровня техники заявителем не выявлены аналоги с признаками, обеспечивающими получение указанного результата.

Следовательно, предложенное техническое решение является новым и имеет изобретательский уровень.

На фиг.1 представлен вариант выполнения устройства, разрез; на фиг.2 - то же, вид сверху; на фиг.3 - поперечное сечение кассеты в сборе со слоистой структурой.

Устройство для получения реплик электрофореграмм (фиг.1 и 2) содержит корпус 1, в котором установлен электропривод 2, на оси 3 которого жестко закреплена камера 4 переноса с расположенными в зажимах 5 кассетами 6.

На рабочей поверхности 7 (фиг. 3) опорного элемента 8 (в показанном примере опорным элементом является крышка кассеты 6) уложена слоистая структура 9, состоящая из носителя фореграммы 10, сорбирующего элемента 11, аккумулятора 12 элюирующей жидкости и ее приемника 13. Аккумулятор 12 может, например, представлять собой пластину из поролона, смоченную элюирующей жидкостью, например дистиллированной водой, а приемник 13 состоять из нескольких слоев фильтрованной бумаги. Число кассет может быть различным. В данном примере число кассет равно четырем.

Устройство работает следующим образом. При подаче напряжения на электропривод 2 с пульта управления (не показан) камера переноса приводится во вращение с определенной частотой. При этом под действием центробежных сил фракции из носителя фореграммы 10 (например, пластины геля) вытесняются элюирующим раствором, поступающим из аккумулятора 12 и задерживаются сорбирующим элементом 11, представляющим собой, например, нитроцеллюлозную мембрану с определенной пористостью. Элюирующая жидкость, проходя через поры сорбирующего элемента 11, собирается в приемник 13. По окончании процесса переноса вращение камеры прекращают, мембрану извлекают из кассеты и обрабатывают известным методом.

На практике значение частоты и времени вращения камеры переноса определяют опытным путем в зависимости от пористости гелевой пластины, массы и размеров молекул фракций и других факторов. Например, для получения в течение 2 мин реплики электрофореграммы сыворотки крови в пластине полиакриламидного геля толщиной 2 мм оптимальная частота вращения составляла 150 мин^-1, а слоистая структура была удалена от центра вращения на 150 мм.

Источники информации, принятые во внимание при составлении описания
1. Bowen B., Steinberg J., Laemmli U.K., Weintraub H., Nucl.Acids Res, 1980, 8, pp. 1-9.

2. Southern E.M., J.Mol. Biol., 1975, 98, pp. 503-517.

3. Проспект фирмы "Hoefer Scientif. Instr." США, 1989.

4. Проспект фирмы "Bio-Rad", США, 1990.

5. Патент США N 4589965, кл. G 01 N 27/28, НКИ 204-182.5, 1986.

6. Патент США N 4622124, кл. G 01 N 27/28, НКИ 204-301, 1986.

7. Заявка ЕРВ N 0236153, кл. B 01 D 57/02, 1987.

Использование: в устройствах для осуществления переноса фракций биополимеров из пористых носителей, например гелевых пластин, на сорбирующие мембраны в области биологии, молекулярной генетики, медицины для получения с целью тиражирования и последующего анализа реплик электрофореграмм биополимеров после проведения их электрофоретического разделения на носителе. Сущность: устройство содержит камеру переноса, имеющую опорный элемент, на рабочей поверхности которого расположена, по меньшей мере, одна слоистая структура, включающая в себя носитель электрофореграмм, сорбирующий элемент и аккумулятор элюирующей жидкости, кроме того, устройство снабжено приводом, обеспечивающим вращение камеры переноса, а рабочая поверхность опорного элемента выполнена цилиндрической и отстоит от оси вращения камеры на величину радиуса цилиндрической поверхности. Технический результат - сокращение длительности процесса переноса. 2 з.п. ф-лы, 3 ил.

1. УСТРОЙСТВО ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ РЕПЛИК ЭЛЕКТРОФОРЕГРАММ, содержащее камеру переноса с опорным элементом, на рабочей поверхности которого расположена по меньшей мере одна слоистая структура, включающая в себя носитель электрофореграмм, сорбирующий элемент и аккумулятор элюирующей жидкости, отличающееся тем, что камера переноса снабжена приводом вращения, рабочая поверхность опорного элемента выполнена цилиндрической и отстоит от оси вращения камеры на величину радиуса цилиндрической поверхности. 2. Устройство по п.1, отличающееся тем, что рабочая поверхность опорного элемента образована внутренней стороной крышки кассеты, при этом корпус кассеты фиксирует слоистую структуру на указанной поверхности. 3. Устройство по п.2, отличающаяся тем, что кассета зафиксирована в камере переноса.