ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКИЙ ЧИП ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ В ОБЛАСТИ ЭЛЕКТРОФОРЕЗА Российский патент 2021 года по МПК C12H1/00 C12M1/00 C12N11/00 C12N9/00 C12Q1/68 G01N1/00 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

[0001] Настоящее изобретение в целом относится к электрофоретическим чипам и способам их использования, в частности к электрофоретическим чипам, содержащим углеродные матричные электроды, и к способам электрофоретического накопления, сепарации и/или обнаружения аналитов.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[0002] Электрофорез представляет собой способ, который использует относительно сильное электрическое поле, создаваемое между двумя противолежащими электродами, обычно размещаемыми в геле или в растворе, для перемещения или переноса представляющих интерес заряженных молекул или частиц. Напряженность Е поля, создаваемого между электродами с разноименными одинаковыми зарядами, может быть вычислена по следующей формуле:

Е=V/d

где d (в метрах) - расстояние между электродами, а V (в вольтах) - разность потенциалов между электродами. Таким образом, согласно приведенной выше формуле напряженности поля, чем меньше расстояние между электродами, тем сильнее электрическое поле при поддержании постоянной разности потенциалов.

[0003] Электрическое поле обычно находится в диапазоне от 5-20 В/см до 5 кВ/см. Поле постоянного тока (DC) или поле переменного тока (АС) могут быть приложены для накопления, сепарации и/или обнаружения аналита. В частности, гелевый электрофорез широко используют для сепарации, очистки или анализа биологических молекул, в частности их размера или концентрации. Примерами заряженных веществ, переносимых и анализируемых с помощью различных электрофоретических способов, являются не только нуклеиновые кислоты и протеины, но и клетки, а также микрочастицы и наночастицы.

[0004] Печать электродных материалов на основе печатных паст на подложке представляет собой относительно дешевый способ выполнения электродов и регулирования их свойств. Электродные матричные устройства ранее широко не применялись в области электрофореза. Печатные электроды ранее использовались во многих различных электроаналитических устройствах и флюидных чипах, использующих различные электрохимические способы для обнаружения аналитов в растворах. Эти электрохимические способы обычно основаны на реакциях редокс-типа, в которых молекулы аналита окисляются или восстанавливаются на электродной поверхности, и на измерении тока, который протекает через электрод и является пропорциональным концентрации аналита в растворе. Таким образом, в электрохимических способах, в которых электрический ток измеряют как функцию концентрации аналита, рабочие (чувствительные) электроды должны быть изготовлены из материалов, таких как платиновые или углеродные пасты, которые обладают высокой электроактивностью, т.е. материалов, которые способны усиливать окисление или восстановление конкретного аналита. Это объясняется тем, что электроаналитические или электрохимические области применения требуют использования электродных материалов, которые способны обеспечивать сильные токи в электродах и которые имеют поверхностные свойства, содействующие специфической реакции окисления/восстановления аналита.

[0005] Гелевый электрофорез, значительно отличающийся по своей природе от большинства электрохимических аналитических способов, широко используют в биотехнологиях, молекулярной биологии, биохимии, физической химии, медицине, фармацевтике, ветеринарии, нанотехнологиях и других областях в течение многих десятилетий. Молекулы, в частности крупные биомолекулы, такие как ДНК/РНК или протеины, требуют подачи сильных электрических полей для обеспечения эффективного переноса через транспортную среду (гель или раствор) и сепарации или концентрирования внутри гелевой матрицы. Следовательно, для их переноса, в частности через гелевую матрицу, необходимы сильные электрические поля.

[0006] Электрическое поле создают между двумя электродами, а именно анодом (заряжен положительно) и катодом (заряжен отрицательно), которые размещены в разных буферных емкостях и обращены к гелевой матрице, изготовленной с отрегулированной пористостью. Пробу молекул аналита вставляют или вносят пипеткой внутрь геля, при этом происходит сепарация этих молекул с течением времени по мере их перемещении через гелевую матрицу в соответствии с их специфической электрофоретической мобильностью. Электрофоретическая мобильность молекул зависит не только от заряда, размера и формы молекул, но также и от физико-химических свойств гелевой матрицы, таких как вязкость, диэлектрическая проницаемость, значение рН, солевой состав и размер пор гелевой матрицы. Существует большое количество известных конструкций электрофоретических устройств и их картриджей, включая, например, предварительно отлитые гели, встраиваемые внутрь одноразовых картриджей. Картриджи обычно изготавливают на основе электродов из платиновой проволоки или стержневых электродов на основе углерода, которые являются относительно дорогими.

[0007] В статье «Электрохимические характеристики изготовленных методом трафаретной печати и обычных электродов из углеродной пасты», авторы Фанджул Боладо (Fanjul Bolado) и др. (2008), журнал «Electrochimica Acta», выпуск 53 (10), 2008 год, стр. 3635-3642, сравнивается электроактивность обычных электродов из углеродной пасты и имеющихся в продаже углеродных электродов, изготовленных методом трафаретной печати и не подвергнутых предварительной обработке, в отношении некоторых редокс-пар. В этом контексте следует отметить, что электроактивность электродов для электрофореза отличается от электроактивности электродов для электрохимического анализа. Она определяется внутренними свойствами электродного материала. В частности, металлы или металлизированные поверхности способны легко осуществлять перенос электронов между редокс-молекулами или молекулами аналита в растворе с одной стороны и металлической электродной поверхностью с другой. Кроме того, для электроаналитических целей электродный материал должен показывать относительно высокую электронную проводимость и способность к переносу электронов внутри собственно материала гелевой матрицы.

[0008] Металлы показывают высокую способность к переносу электронов, поскольку они имеют высокую концентрацию свободных электронов в своей зоне проводимости. В отличие от металлов полупроводники могут и не иметь высокой концентрации свободных электронов в зоне проводимости. Следовательно, полупроводники обычно не создают сильного электрического тока, если они не легированы или не возбуждены термически или оптически. Тем не менее, поскольку для переноса электронов при электрофорезе слишком сильные электрические токи могут и не потребоваться, полупроводниковые добавки в печатные пасты могут эффективно способствовать процессам электрофореза.

[0009] Помимо полупроводников, таких как кремний и германий, многие оксиды металлов, такие как диоксид титана, оксид индия, оксиды железа и никеля, и сульфиды, теллуриды и селениды металлов, такие как сульфид кадмия и теллурид кадмия, показывают полупроводниковые свойства. Благодаря этому, полупроводниковые материалы и добавки к печатным пастам, изготовленные из этих материалов, показывают более высокое сопротивление на границе раздела электрод/электролит. В результате создаются более высокие напряжения на границе раздела электрод/электролит, и при этих высоких напряжениях повышается эффективность электрофоретического процесса, поскольку электрофоретический перенос крупных молекул через гелевую матрицу происходит более плавно при более высоких электрических полях. В этом случае сопротивление электродных материалов на основе паст легко может быть изменено путем изготовления пастовых смесей, которые содержат больше изоляционных и/или полупроводниковых добавок в пастовом составе.

[0010] Обычно во время процесса электрофореза на поверхностях электродов происходит гидролиз воды. Это приводит к тому, что на электродах интенсивно образуются пузырьки, которые способны интерферировать с электрическим током и вследствие этого мешать сепарации или накоплению аналита и скрывать оптические сигналы электрофоретической матрицы. Подавление электрохимического гидролиза воды на электродах и образования пузырьков возможно путем использования полупроводников или изоляционных материалов в дополнение к металлам. Такие композитные материалы содействуют другим электрохимическим реакциям, отличным от гидролиза воды. В статье «Электрохимическое окисление титановых поверхностей», автор Сиберт (Siebert) (1963), опубликованной в журнале электрохимического сообщества (Journal of the Electrochemical Society), выпуск 110 (1), 1963 год, стр. 65-72, было предложено использовать титан или добавки, содержащие титан (который по своей природе является полупроводником), для изготовления анодов, причем в результате окисления титана и образования диоксида титана на электродной поверхности происходит эффективное ингибирование гидролиза воды и образования пузырьков. Авторами настоящего изобретения было также показано, что, как описано в патенте US 7134542, использование в качестве добавки буферного электролита с восстановительным веществом, таким как альфа-тиоглицерол, обеспечивает возможность подавления выделения кислорода при положительных потенциалах.

[0011] В патенте US 6303015 описаны используемые в качестве катодов электроды из аморфного металлического стекла, содержащие композитные материалы с палладием или никелем, в которых выделение водорода подавляется на поверхности электродов благодаря тому, что водород мгновенно абсорбируется металлами с образованием гидридов металлов. В результате, как описано в статье «Выделение водорода и его поступление в палладий при высокой плотности тока», автор Сирсон (Searson) (1991), журнал «Acta Metallurgica et Materialia», выпуск 39 (11), 1991 год, стр. 2519-2525, гидролиз воды преодолевается за счет образования гидрида внутри металлической решетки. Другие типы реакций, которые происходят на электродной поверхности и способны подавлять, ингибировать или замещать расщепление воды на электродах, могут включать окисление углерода внутри углеродных паст с образованием оксида углерода или других продуктов окисления.

[0012] Использование электродов, изготовленных методом трафаретной печати, для электрохимического обнаружения в целом описано в патенте US 6878255 и в книге «Аналитическая электрохимия» (Analytical Electrochemistry), автор Дж. Вонг (J. Wang), изд. 2^А, издательство «Wiley», VHC, Нью-Йорк, 2000. В патенте ЕР 0352138 описано использование пастовых структур в изготовленных методом трафаретной печати электродах и/или чипах полоскового типа, с высокой проводимостью и электроактивностью поверхности, для электрохимического обнаружения различных аналитов, преимущественно для выявления глюкозы. В патенте US 7297248 и патенте US 8268604 раскрыты металлосодержащие пасты, которые в качестве катализаторов реакции могут содействовать встраиванию энзимов, таких как глюкооксидаза, в электродную поверхность для обеспечения возможности электрохимического обнаружения глюкозы. В патенте US 7479211 описаны способы изготовления печатных биодатчиков; согласно этим способам изготавливают электроды с использованием лазерной абляции металлических проводников на пластмассовых непроводящих поверхностях для электрохимического обнаружения глюкозы, холестерина, триглицеридов, лактата и билирубина. В US 8105477 показано использование электродов на основе углеродной пасты для электрохимического обнаружения нуклеиновых кислот.ЕР 2417305 относится к использованию резистивных углеродных паст в полосковых биодатчиках глюкозы, которые показывают различные сопротивления в зависимости от номиналов их резисторов и способны идентифицировать факт вставки полоски внутрь измерительного устройства.

[0013] Хотя многие электрохимические устройства были созданы с использованием вышеуказанных изготовленных методом трафаретной печати электродов на основе углеродной пасты, показывающих более высокие проводимость и электроактивность структур, электрофоретические устройства, которые используют электроды, изготовленные методом трафаретной печати, не были широко известны. В US 8268018 описано использование углеродных электродов, изготовленных методом трафаретной печати, для управления ионофоретической доставкой лекарственных препаратов через кожу, в качестве части портативного устройства. В US 6878255 и статье «Капиллярные электрофоретические чипы с тонкопленочными амперометрическими детекторами: сепарация и обнаружение гидразинных соединений», авторы Вонг (Wang) и др. (2000), журнал «Электроанализ» (Electroanalysis), выпуск 12 (9), 2000 год, стр. 691-694, раскрыто использование толстопленочных электродов, которые могут быть изготовлены с использованием методов трафаретной печати, для применения в области электрофореза, относящейся к микромасштабному капиллярному электрофорезу. Тем не менее, ни одно из электрофоретических устройств, раскрытых в уровне технике, не предусматривает встраивания электронных элементов внутрь электродных структур и модификации электродных композиций или их свойств в наслоенном состоянии для обеспечения регулирования тока и/или напряжения для улучшения (ди)электрофоретических процессов.

[0014] В обычных электрофоретических устройствах процесс сепарации и накопления осуществляют через гель с использованием постоянного тока, подаваемого от внешнего источника питания. Для преодоления сопротивления геля необходимо относительно высокое напряжение, составляющее приблизительно 50-200 В. Электроды, размещенные в буфере, обычно показывают низкое общее сопротивление, в особенности при использовании платиновых электродов, вследствие их высокой электроактивности. Каждый электрод имеет свой собственный провод и контакт с источником питания. Тем не менее, такие обычные электроды не способны управляемым образом повышать свое сопротивление в одном и том же буфере. Повышение сопротивления позволило бы повысить общее напряжение между рабочим электродом и противоэлектродом при одном и том же постоянном токе. В результате, по сравнению с обычными электродами, была бы обеспечена возможность переноса молекул через гель при намного более сильных электрических полях, но при том же самом токе.

[0015] Таким образом, уже давно существует потребность в разработке электрофоретических устройств на основе электродов, слоистые структуры и геометрическая форма которых образованы печатными пастами и которые содержат электронные элементы. Такие устройства способны значительно улучшать электрофоретические процессы и могут обеспечивать недорогую платформу для флюидных чипов и устройств, использующих различные электрофоретические и диэлектрофоретические процессы.

РАСКРЫТИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0016] В одном аспекте настоящего изобретения предложен электрофоретический чип, содержащий:

(a) непроводящую подложку, выполненную с возможностью поддержки элементов электрофоретического чипа;

(b) электродную структуру для проведения электрического тока через электрофоретический чип, напечатанную на непроводящей подложке и содержащую противоэлектрод и по меньшей мере один рабочий электрод, причем каждый электрод содержит:

(1) слой проводящей низкоомной пасты, напечатанный на непроводящей подложке;

(2) слой углеродной пасты, напечатанный на верхней поверхности слоя проводящей низкоомной пасты с обеспечением его полного или частичного покрытия;

(c) изоляционный слой диэлектрической пасты, размещенный на верхней поверхности электродной структуры с обеспечением ее покрытия, причем изоляционный слой диэлектрической пасты имеет по меньшей мере одно отверстие над противоэлектродом и по меньшей мере одно отверстие над указанным по меньшей мере одним рабочим электродом, что обеспечивает образование по меньшей мере одного адресного участка; и

(d) гелевую матрицу захвата молекул, расположенную на указанном по меньшей мере одном адресном участке с обеспечением его покрытия, что обеспечивает создание по меньшей мере одной гелевой островковой области.

[0017] В некоторых вариантах осуществления электрофоретический чип, раскрытый в данном документе, содержит один рабочий электрод и множество отверстий над указанным одним рабочим электродом. В частности, в таких вариантах осуществления все отверстия расположены на одинаковом расстоянии от противоэлектрода, что обеспечивает образование множества адресных участков на указанном одном рабочем электроде.

[0018] В других вариантах осуществления электрофоретический чип, раскрытый в данном документе, содержит два рабочих электрода и одно отверстие над каждым из указанных рабочих электродов. В частности, в таких вариантах осуществления все отверстия расположены на одинаковом расстоянии от противоэлектрода, что обеспечивает образование множества адресных участков. Такие электрофоретические чипы могут быть выполнены таким образом, чтобы указанные по меньшей мере два рабочих электрода были электрически соединены с контактной линией через соединительные области.

[0019] В еще одном аспекте настоящего изобретения предложено электрофоретическое устройство, содержащее вышеописанный электрофоретический чип, впускное и выпускное флюидные отверстия, флюидный привод и считыватель.

[0020] В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к способу электрофоретического накопления и обнаружения по меньшей мере одного аналита в растворе, включающему этапы, согласно которым: (i) наносят раствор на вышеописанные электрофоретическийц чип или электрофоретическое устройство; (ii) подают напряжение на электрофоретический чип, в результате чего происходит накопление молекул указанного по меньшей мере одного аналита на указанном по меньшей мере одном адресном участке; (iii) удаляют свободные или несвязанные молекулы указанного по меньшей мере одного аналита из раствора; и (iv) обнаруживают присутствие накопленных молекул указанного по меньшей мере одного аналита на указанном по меньшей мере одном адресном участке.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

[0021] Раскрытые варианты осуществления будут лучше понятны и более полно уяснены при прочтении нижеследующего подробного описания в сочетании с прилагаемыми чертежами. Чертежи, включенные в настоящее описание и описанные в нем, выполнены схематично и не ограничивают объем настоящего изобретения. Следует также отметить, что на чертежах размеры некоторых элементов могут быть увеличены и, следовательно, изображены не в масштабе для иллюстративных целей. Размеры и относительные размеры не обязательно соответствуют фактическим размерам при практической реализации настоящего изобретения.

[0022] На фиг. 1а показан покомпонентный вид электродной структуры электрофоретического чипа согласно настоящему изобретению, слой 23 низкоомной пасты и слой 24 углеродной пасты, которые напечатаны на непроводящей подложке 10.

[0023] На фиг. 1b схематично показан увеличенный вид двух пастовых слоев 23 и 24, напечатанных на непроводящей подложке 10.

[0024] На фиг. 2 схематично показан электрофоретический чип согласно настоящему изобретению, содержащий нижеследующие элементы: непроводящая подложку 10, впускное сквозное отверстие 11, выпускное сквозное отверстие 11', общую контактную линию 12, противоэлектрод 13, рабочие электроды или матрицу рабочих электродов 14, матрицу 15 рабочих электродов и слой 24 углеродной пасты.

[0025] На фиг. 3а-3с схематично показан электрофоретический чип согласно настоящему изобретению, содержащий нижеследующие дополнительные элементы: изоляционный слой 16 диэлектрической пасты, отверстия 17 над рабочими электродами, образующие адресные участки 19 на рабочих электродах, одно большое отверстие 18, выровненное с противоэлектродом и оставляющее участок противоэлектрода открытым для воздействия раствора.

[0026] На фиг. 4 схематично показан увеличенный вид матрицы рабочих электродов в электрофоретическом чипе согласно настоящему изобретению. Матрица рабочих электродов состоит из отдельных рабочих электродов 14 и общей контактной линии 12, соединяющей все рабочие электроды 14 в единую электродную матрицу. Область 27, в которой каждый отдельный рабочий электрод 14 соединен с контактной линией 12, определена как соединительная область.

[0027] На фиг. 5 схематично показан увеличенный вид конфигурации электрофоретического чипа согласно настоящему изобретению, содержащей резисторный (R) слой 25, который напечатан между каждым отдельным рабочим электродом 14 и общей контактной линией 12 в матрице рабочих электродов.

[0028] На фиг. 6а-6b схематично показана конфигурация электрофоретического чипа согласно настоящему изобретению. Толстый диэлектрический слой 20 напечатан в виде рамки по внешнему периметру чипа, после чего на нем размещен прозрачный лист 21 и таким образом создана флюидная камера или канал 22 для доставки испытуемого флюида к электродной структуре.

[0029] На фиг. 7а-7b схематично показан электрофоретический чип согласно настоящему изобретению, содержащий нагревательный слой 28 пасты с высокой проводимостью, напечатанный на нижней поверхности непроводящей подложки 10. В данной конфигурации непроводящая подложка 10 содержит сквозные отверстия 29, через которые нагревательный слой 28 пасты с высокой проводимостью проходит к его контактам 12', напечатанным на верхней поверхности непроводящей подложки 10.

[0030] На фиг. 7с схематично показан электрофоретический чип согласно настоящему изобретению, содержащий нагревательный слой 28 пасты с высокой проводимостью, напечатанный на верхней поверхности непроводящей подложки 10. Другими элементами чипа, показанными на данной фигуре, являются впускное сквозное отверстие 11, выпускное сквозное отверстие 11', противоэлектрод 13 и рабочие электроды 14.

[0031] На фиг. 8а-8b схематично показан трехмерный вид электрофоретического чипа согласно настоящему изобретению, показанного на предыдущих фигурах, причем каждый рабочий электрод покрыт гелевым островком 34, точечно нанесенным на его верхнюю поверхность.

[0032] На фиг. 9а-9с схематично показаны для сравнения друг с другом гелевое электрофоретическое устройство (фиг. 9а), электрофоретический чип уровня техники, имеющий сплошной гелевый слой 36 (фиг. 9b), и электрофоретический чип согласно настоящему изобретению, имеющий множество гелевых островков 34 (фиг. 9с).

[0033] На фиг. 10а схематично показан трехмерный вид электрофоретического чипа уровня техники с противоэлектродом 13 и множеством рабочих электродов 14, расположенных в одной плоскости и имеющих сплошной гелевый слой 36 на электродах. Данная фигура иллюстрирует электрофоретический перенос молекул 30 аналита от противоэлектрода 13 к матрице рабочих электродов 14 через сплошной гелевый слой 36 вдоль силовых линий 31 электрического поля, создаваемого при подаче напряжения на чип.

[0034] На фиг. 10b схематично показан трехмерный вид электрофоретического чипа согласно настоящему изобретению с противоэлектродом 13 и множеством рабочих электродов 14, расположенных в одной плоскости и имеющих гелевые островки 34, точечно нанесенные на электроды. Данная фигура иллюстрирует электрофоретический перенос молекул 30 и 32 аналита от противоэлектрода 13 к множеству рабочих электродов 14, на которые точечно нанесены гелевые островки 34, вдоль силовых линий 31 магнитного поля, создаваемого при подаче электрического поля на чип.

[0035] На фиг. 11a-11b схематично показан электрофоретический перенос молекул 30 мишени через жидкую или растворную среду 35 и через сплошной гелевый слой 36 соответственно.

[0036] На фиг. 12а схематично показан трехмерный вид рабочего электрода 14, который относится к электрофоретическому чипу уровня техники, показанному на фиг. 9b и фиг. 10а, и имеет сплошной гелевый слой 36 на этом электроде.

[0037] На фиг. 12b схематично показан трехмерный вид рабочего электрода 14, который относится к электрофоретическому чипу согласно настоящему изобретению, показанному на фиг. 9с и фиг. 10b, и имеет гелевый островок 34, точечно нанесенный на этот электрод.

[0038] Фиг. 12с соответствует фиг. 12а, и на нем схематично показан вид сбоку рабочего электрода 14, который относится к электрофоретическому чипу уровня техники, показанному на фиг. 9b и 10а, и имеет сплошной гелевый слой 36, нанесенный на этот электрод.

[0039] Фиг. 12d соответствует фиг. 12b, и на нем схематично показан вид сбоку рабочего электрода 14, который относится к электрофоретическому чипу согласно настоящему изобретению, показанному на фиг. 9с и фиг. 10b, и имеет гелевый островок 34, точечно нанесенный на этот электрод.

[0040] Фиг. 13а соответствует фиг. 9b, 10а, 12а и 12с, и на нем схематично показан электрофоретический перенос молекул 30 аналита от противоэлектрода 13 к рабочим электродам 14 через сплошной гелевый слой 36. Перенос молекул 30 происходит вдоль силовых линий 31 электрического поля, создаваемого при подаче напряжения на чип.

[0041] Фиг. 13b соответствует фиг. 9с, 10b, 12b и 12d, и на нем схематично показан электрофоретический перенос молекул 30 и 32 аналита от противоэлектрода 13 к рабочим электродам 14, на которые точечно нанесены гелевые островки 34. Перенос этих молекул происходит вдоль силовых линий 31 электрического поля, создаваемого при подаче напряжения на чип.

[0042] На фиг. 14 показаны результаты изготовления электродов и электрофоретического чипа с нанесенным слоем углеродной пасты согласно настоящему изобретению с точки зрения однородности резисторных слоев 25, которые показывают воспроизводимые значения сопротивления для каждого электрода в структуре. Три наносимых в виде слоя углеродных пасты разного состава были напечатаны с одинаковой геометрической формой, как показано на фиг. 2 и 6, и было проведено их испытание.

[0043] На фиг. 15 приведены обобщенные данные по автофлуоресценции примеров материалов для печатных чипов, в том числе диэлектрических паст, углеродных паст, серебряных паст и подложек, используемых для изготовления электрофоретического чипа согласно настоящему изобретению.

[0044] На фиг. 16 показана статистика и полученные количественные флуоресцентные данные относительно электрофоретического накопления последовательности ДНК-мишени 55-bp, обнаружения этой последовательности с помощью специфических комплементарных зондов, встроенных внутрь гидрогеля, покрывающего электроды электродной матрицы, и флуоресцентные изображения для каждого электродного пятна.

[0045] На фиг. 17 показаны флуоресцентные данные относительно электрофоретического накопления и обнаружения ПЦР-амплифицированной ДНК-мишени вируса MS2 на электрофоретическом чипе согласно настоящему изобретению.

[0046] На фиг. 18а-18b показаны примеры результатов анализов накопления и обнаружения специфической ДНК-последовательности на электрофоретическом чипе согласно настоящему изобретению.

[0047] На фиг. 18а показаны результаты анализа обнаружения и узнавания Leishmania major в сравнении с другими подвидами лейшмании, часто обнаруживаемыми у нескольких видов москитов.

[0048] На фиг. 18b показаны результаты анализа обнаружения и узнавания Legionella pneumoniale как часть результатов тройного анализа на домашнюю пневмонию.

ОСУЩЕСТВЛЕНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0049] В нижеследующем описании будут описаны различные аспекты настоящего изобретения. Для пояснительных целей описаны конкретные конфигурации и подробности для обеспечения исчерпывающего понимания настоящего изобретения. Тем не менее, специалистам в данной области техники должно быть также понятно, что настоящее изобретение может быть реализовано на практике без конкретных подробностей, представленных в данном документе. Кроме того, хорошо известные признаки могут быть опущены или упрощены с тем, чтобы не затруднять понимание настоящего изобретения. В нижеследующем подробном описании различных вариантов осуществления даны ссылки на сопроводительные чертежи, образующие часть описания и иллюстрирующие конкретные варианты, в которых может быть реализовано на практике настоящее изобретение. Понятно, что могут использоваться и другие варианты осуществления, и возможно внесение конструктивных изменений без выхода за рамки объема настоящего изобретения.

[0050] Терминология, используемая в данном документе, предназначена лишь для описания конкретных вариантов осуществления и не предназначена для ограничения настоящего изобретения. Термины «содержащий» и «содержит», используемые в формуле изобретения, не должны интерпретироваться как ограниченные теми членами, которые перечислены после них, и они не исключают других элементов или этапов. Они должны интерпретироваться как указывающие на присутствие признаков, целых чисел, этапов и/или компонентов, на которые они ссылаются, однако они не исключают присутствия и/или добавления одного или более других признаков, целых чисел, этапов или компонентов, или их групп. Таким образом, объем выражения «устройство, содержащее х и z» не должен ограничиваться устройствами, состоящими лишь из компонентов х и z. Кроме того, объем выражения «способ, включающий этапы х и z» не должен ограничиваться способами, состоящими лишь из этих этапов.

[0051] В контексте данного документа термин «приблизительно» или «примерно» означает: в пределах диапазона нормального допуска, принятого в данной области техники, например в пределах двух стандартных отклонений от среднего значения. В одном варианте осуществления термин «приблизительно» или «примерно» означает: в пределах 10% от названного численного значения, с которым использован данный термин, предпочтительно в пределах 5% от названного численного значения. Например, термин «приблизительно» или «примерно» может непосредственно быть понят как: в пределах 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5%, 0,1%, 0,05% или 0,01% от названного значения. В других вариантах осуществления термин «приблизительно» или «примерно» может означать более жесткий допуск на вариации, в зависимости, например, от использовавшейся методики экспериментального исследования. Указанные вариации конкретного значения понятны специалистам и находятся в рамках контекста настоящего изобретения. В качестве иллюстрации, диапазон «от приблизительно 1 до приблизительно 5» должен интерпретироваться как включающий не только приведенные явным образом значения от приблизительно 1 до приблизительно 5, но также и отдельные значения и поддиапазоны в пределах приведенного диапазона. Таким образом, в данный численный диапазон включены численные значения, такие как 2, 3 и 4, и поддиапазоны, например от 1 до 3, от 2 до 4 и от 3 до 5, а также, по отдельности, 1, 2, 3, 4, 5 или 6. Тот же самый принцип применим к диапазонам, для которых приведено лишь одно численное значение, такое как минимальное или максимальное. Если из контекста однозначно не следует иное, то все численные значения, приведенные в данном документе, модифицированы термином «приблизительно» или «примерно». Другие сходные термины, такие как «по существу», «в целом», «вплоть до» и т.п. должны пониматься как модифицирующие термин или значение таким образом, что последние не являются абсолютными. Такие термины будут определяться конкретной ситуацией и терминами, которые они модифицируют и которые понятны специалистами в данной области техники. Сюда входит по меньше мере величина ожидаемой экспериментальной ошибки, технической ошибки и инструментальной ошибки для данного эксперимента, методики или инструмента, используемых для измерения значения.

[0052] В контексте данного документа термин «и/или» включает любые комбинации одной или более из связанных перечисленных позиций.

[0053] Если не определено иное, то все термины (включая технические и научные термины), используемые в данном документе, имеют то же самое значение, в котором их обычно понимают специалисты с обычной квалификацией в области техники, к которой относится настоящее изобретение. Понятно также, что термины, такие как те, которые определены в общераспространенных словарях, должны интерпретироваться как имеющие значение, которое соответствует их значению в контексте настоящего описания и надлежащей области техники, и не должны интерпретироваться в идеализированном или чрезмерно формальном смысле, если это не определено однозначным образом в данном документе. Хорошо известные функции и конструкции могут не быть подробно описаны в целях краткости и/или понятности.

[0054] Следует понимать, что если элемент определен как «находящийся на», «прикрепленный к», «соединенный с», «связанный с», «контактирующий с» и т.п. применительно к другому элементу, то он может быть непосредственно находиться на, быть прикрепленным к, быть соединенным с, быть связанным с или контактировать с указанным другим элементом, либо также могут присутствовать промежуточные элементы. В отличие от этого, если элемент определен, например, как «находящийся непосредственно на», «непосредственно прикрепленный к», «непосредственно соединенный с», «непосредственно связанный с» или «непосредственно контактирующий с» применительно к другому элементу, то промежуточные элементы отсутствуют. Специалистам в данной области техники должно быть также понятно, что конструкция или признак, которые определены как размещенные «смежно» с другим признаком, могут иметь участки, которые лежат поверх или ниже смежного признака.

[0055] В одном аспекте настоящего изобретения предложен электрофоретический чип, содержащий:

(a) непроводящую подложку, выполненную с возможностью поддержки элементов электрофоретического чипа;

(b) электродную структуру для проведения электрического тока через электрофоретический чип, напечатанную на непроводящей подложке и содержащую противоэлектрод и по меньшей мере один рабочий электрод, причем каждый электрод содержит:

(1) слой проводящей низкоомной пасты, напечатанный на непроводящей подложке;

(2) слой углеродной пасты, напечатанный на верхней поверхности слоя проводящей низкоомной пасты с обеспечением его полного или частичного покрытия;

(c) изоляционный слой диэлектрической пасты, размещенный на верхней поверхности электродной структуры с обеспечением ее покрытия, причем изоляционный слой диэлектрической пасты имеет по меньшей мере одно отверстие над противоэлектродом и по меньшей мере одно отверстие над указанным по меньшей мере одним рабочим электродом, что обеспечивает образование по меньшей мере одного адресного участка; и

(d) гелевую матрицу захвата молекул, точечно нанесенную на указанный по меньшей мере один адресный участок с обеспечением его покрытия, что обеспечивает создание по меньшей мере одной островковой гелевой области.

[0056] «Электрофоретический чип» в настоящем изобретении представляет собой электронную схему или группу электронных схем, напечатанных на подложке и используемых для электрофореза. В электрофоретических устройствах на гелевой основе, используемых в настоящее время, обычно применяются лишь двухэлектродные системы и один монолитный гель для сепарации молекул. В таких устройствах сплошные гели нанесены на рабочие электроды, на которых происходит накопление аналита, в то время как противоэлектроды не покрыты гелем. В отличие от этого, гель, используемый в электрофоретическом чипе, раскрытом в данном документе, и именуемый также «гелевой матрицей захвата молекул», точечно нанесен на каждый рабочий электрод, более конкретно - на каждый из адресных участков, образованных на указанных рабочих электродах, причем каждая нанесенная точка именуется «гелевым островком» или «гелевой островковой областью». В отличие от электрофоретических чипов, известных в настоящее время, гелевые островки, точечно нанесенные на электроды, не соединены и не образуют монолитный блок, как это имеет место в гелевых электрофоретических устройствах, известных в настоящее время.

[0057] В некоторых вариантах осуществления электрофоретический чип согласно настоящему изобретению содержит один рабочий электрод и множество отверстий над указанным одним рабочим электродом. В частности, в таких вариантах осуществления все отверстия расположены на равном расстоянии от противоэлектрода, что обеспечивает образование множество адресных участков на одном рабочем электроде.

[0058] В других вариантах осуществления электрофоретический чип согласно настоящему изобретению содержит по меньшей мере два, т.е. два или более, рабочих электродов и одно отверстие над каждым из указанных рабочих электродов. В конкретных подобных вариантах осуществления все отверстия расположены на равном расстоянии от противоэлектрода, что обеспечивает образование множества адресных участков. Такие электрофоретические чипы могут быть выполнены таким образом, чтобы по меньшей мере два рабочих электрода были электрически соединены с контактной линией через соединительные области. В конкретных подобных вариантах осуществления каждая из соединительных областей электрически соединяет по меньшей мере два рабочих электрода, а контактная линия содержит резисторный слой, напечатанный на непроводящей подложке в виде перемычки между каждым из указанных рабочих электродов и контактной линией. В некоторых подобных вариантах осуществления поверхностное сопротивление резисторного слоя находится в диапазоне от 0,05 до 1×10⁷ Ом/мм². В других подобных вариантах осуществления резисторный слой содержит добавку из натуральной смолы или синтетического полимера.

[0059] Примеры синтетических полимерных добавок включают, без ограничения, акриловые смолы, алкидные смолы, целлюлозные смолы, смолы, модифицированные резиной, кетоновые смолы, смолы из сополимера стирола и малеинового ангидрида, полиэфирные смолы, фенолформальдегидные смолы, меламинформальдегидные смолы, мочевиноформальдегидные смолы, гидрокарбоновые смолы, фенольные смолы, эпоксидные смолы, фумаровые смолы, полиуретановые смолы, не содержащие изоцианата, поливинилбутиральные смолы, полиамидные смолы, тефлоновые смолы и нафионовые смолы.

[0060] В некоторых вариантах осуществления электрофоретический чип согласно настоящему изобретению имеет множество адресных участков. Такие электрофоретические чипы содержат либо один рабочий электрод и множество отверстий, при необходимости расположенных на равном расстоянии от противоэлектрода над указанным одним рабочим электродом, либо по меньшей мере два рабочих электрода и по одному отверстию над каждым из указанных рабочих электродов, причем все эти отверстия расположены на равном расстоянии от противоэлектрода, согласно одному из вышеописанных вариантов осуществления. В конкретных подобных вариантах осуществления множество адресных участков расположены на равном расстоянии от противоэлектрода, при этом все эти адресные участки выполнены таким образом, что при подаче напряжения на электрофоретический чип они принимают приблизительно равные и однородные электрические токи.

[0061] Как будет подробно описано ниже, фраза «равные и однородные электрические токи» в контексте данного документа означает, что все рабочие электроды на всех адресных участках принимают приблизительно равные электрические токи с одинаковой плотностью тока, однородно распределенные по поверхности каждого электрода.

[0062] В некоторых вариантах осуществления электрофоретический чип согласно настоящему изобретению имеет множество адресных участков, которые при подаче напряжения на электрофоретический чип принимают приблизительно равные и однородные электрические токи, а гелевая матрица имеет по меньшей мере две гелевых островковых области, причем смежные гелевые островковые области не находятся в контакте непосредственно друг с другом.

[0063] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предложен электрофоретический чип согласно любому из вышеописанных вариантов осуществления, в котором гелевая матрица способна захватывать или накапливать молекулы на адресных участках. В других вариантах осуществления настоящего изобретения предложен электрофоретический чип согласно любому из вышеописанных вариантов осуществления, в котором по меньшей мере одна гелевая островковая область при подаче напряжения на электрофоретический чип способна содействовать электрофоретическому переносу молекул. В некоторых конкретных подобных вариантах осуществления гелевая матрица содержит пористую полимерную структуру, пленкообразующую решетку, протеиновую смесь, например фотоформуемую протеиновую смесь, полупроницаемую твердую пленку или газопроницаемую мембрану, функционализируемую химическими функциональными группами, способными образовывать соединительный слой. В более конкретных подобных вариантах осуществления гелевая матрица также содержит по меньшей мере один отдельный слой.

[0064] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предложен электрофоретический чип согласно любому из вышеописанных вариантов осуществления, также содержащий захватные молекулы, присоединенные к матрице или встроенные внутрь нее, либо присоединенные к слою углеродной пасты указанного по меньшей мере одного рабочего электрода на адресном участке, причем захватные молекулы способны связываться с аналитом, т.е. молекулами мишени.

[0065] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предложен электрофоретический чип согласно любому из вышеописанных вариантов осуществления, в котором гелевая матрица также содержит по меньшей мере один отдельный слой.

[0066] В некоторых конкретных подобных вариантах осуществления отдельный слой представляет собой соединительный слой для присоединения захватных молекул, способных связываться с молекулами мишени, например соединительный слой, содержащий функциональные группы или химические компоненты для связывания непосредственно с молекулами мишени или для связывания с захватными молекулами и, таким образом, для непрямого связывания с молекулами мишени. Конкретные подобные соединительные слои могут содержать стрептавидиновый химический компонент, причем захватные молекулы представляют собой биотинилированные молекулы.

[0067] В других конкретных подобных вариантах осуществления отдельный слой содержит супрамолекулярный полимер, который представляет собой полимер, чьи мономерные звенья удерживаются вместе за счет высоконаправленных и двухсторонних нековалентных взаимодействий, таких как водородная связь, π-π-взаимодействие, металлокоординационное взаимодействие и взаимодействие матрица-примесь. Примеры супрамолекулярных полимеров включают, без ограничения, двухвалентные поли(изобутилены) (PIB) с барбитуровой кислотой, функционализированной в голове и хвосте, полиимид со складчатостью в полипептидной цепи и цепи с пирениловыми концевыми группами, супрамолекулярные полимеры на основе циклодекстрина, ротаксаны, уреидо-пиримидиноновый квадрупольный комплекс, комплекс на основе ферроцен-β-циклодекстрина, металло-супрамолекулярные амфифильные блок-сополимеры и самовосстанавливающиеся супрамолекулярные полимеры с контролем рН, содержащие координационные комплексы, такие как моно-, би- и трикатехол-Fe³⁺. В некоторых конкретных подобных вариантах осуществления супрамолекулярный полимер представляет собой каликсарен.

[0068] В других конкретных подобных вариантах осуществления отдельный слой представляет собой проницаемый слой, способный связываться с молекулами мишени. Такой проницаемый слой может содержать места для связывания с захватными молекулами, способными связываться с молекулами мишени, что позволяет ему действовать как накопительный слой для молекул мишени.

[0069] Термин «захватные молекулы» в контексте данного документа относится к молекулам, способным захватывать молекулы мишени или аналиты за счет либо ковалентного, либо нековалентного связывания. Согласно настоящему изобретению, конкретные захватные молекулы представляют собой те, которые являются специфическими для конкретной молекулярной узнаваемой группы указанных молекул мишени.

[0070] В контексте данного документа термины «аналит», «молекулы аналита», «мишень» и «молекулы мишени» являются полностью эквивалентными и взаимозаменяемыми и определяют молекулы или вещества, чья (био)химическая структура идентифицируется и/или чьи (био)химические, (био)физические и/или спектральные свойства измеряются. Примеры молекул мишени включают, без ограничения, заряженные макромолекулы и микро- и наноразмерные структуры, такие как протеины, энзимы, односпиральные ДНК, односпиральные РНК, двуспиральные ДНК, двуспиральные РНК, рецепторы, аптамеры, антитела, антигены, другие клетки, ДНК или ДНК/РНК генома человека или животного, взятые из микроорганизмов, включая бактерии и вирусы, мицеллы, везикулы, экзосомы, молекулярные сборки, такие наношарики ДНК, и наноматериалы, такие как углеродные нанотрубки или наночастицы.

[0071] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предложен электрофоретический чип согласно любому из вышеописанных вариантов осуществления, в котором диаметр по меньшей мере одной гелевой островковой области находится в диапазоне от 1 нм до 1 см, в зависимости от размеров электрода и от способа применения электрофореза, а высота указанной по меньшей мере одной гелевой островковой области находится в диапазоне от 1 нм до 1 мм. Диаметр гелевой островковой области предпочтительно находится в диапазоне 50-500 микрон, и высота гелевой островковой области предпочтительно находится в диапазоне 5-500 микрон.

[0072] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предложен электрофоретический чип согласно любому из вышеописанных вариантов осуществления, в котором слой углеродной пасты имеет перенапряжение для выделения водорода, составляющее менее -0,07 В. В конкретных подобных вариантах осуществления слой углеродной пасты также содержит частицы металла, такого как цинк, железо, никель, палладий, свинец или ртуть.

[0073] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предложен электрофоретический чип согласно любому из вышеописанных вариантов осуществления, в котором слой углеродной пасты имеет перенапряжение для выделения кислорода, составляющее более +0,77 В. В конкретных подобных вариантах осуществления слой углеродной пасты также содержит частицы металла, такого как титан, палладий или золото, оксида указанного металла или их комбинацию.

[0074] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предложен электрофоретический чип согласно любому из вышеописанных вариантов осуществления, в котором по меньшей мере одно отверстие над противоэлектродом образует адресный участок на противоэлектроде.

[0075] Электрофоретический чип согласно любому из вышеописанных вариантов осуществления может также содержать нагревательный слой пасты с высокой проводимостью, напечатанный на нижней поверхности непроводящей подложки, при этом, например, непроводящая подложка содержит отверстия, через которые нагревательный слой пасты с высокой проводимостью проходит на верхнюю поверхность непроводящей подложки, или нагревательный слой пасты с высокой проводимостью не находится в контакте с электродной структурой и отделен от нее посредством непроводящей подложки. В качестве альтернативы, электрофоретический чип может также содержать нагревательный слой пасты с высокой проводимостью, напечатанный на верхней поверхности непроводящей подложки и не находящийся в контакте с электродной структурой.

[0076] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предложен электрофоретический чип согласно любому из вышеописанных вариантов осуществления, в котором слой проводящей низкоомной пасты представляет собой слой серебряной пасты.

[0077] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предложен электрофоретический чип согласно любому из вышеописанных вариантов осуществления, также содержащий толстый изоляционный слой диэлектрика или присоединенную перфорированную подложку, размещенную на верхней поверхности электрофоретического чипа, и крышку для покрытия указанного диэлектрика или присоединенной перфорированной подложки, причем указанный диэлектрик или присоединенная перфорированная подложка содержат функциональную флюидную камеру или канал.

[0078] В еще одном аспекте настоящего изобретения предложено электрофоретическое устройство, содержащее электрофоретический чип, раскрытый в любом из вышеописанных вариантов осуществления, впускное и выпускное флюидные отверстия, флюидный привод и считыватель.

[0079] Еще один аспект настоящего изобретения относится к способу электрофоретического накопления и обнаружения по меньшей мере одного аналита в растворе, включающему этапы, на которых: (i) наносят раствор либо на электрофоретический чип, раскрытый в любом из вышеописанных вариантов осуществления, либо на вышеописанное электрофоретическое устройство; (ii) подают напряжение на электрофоретический чип, в результате чего происходит накопление молекул указанного по меньшей мере одного аналита на указанном по меньшей мере одном адресном участке; (iii) удаляют свободные (не связанные) молекулы указанного по меньшей мере одного аналита из раствора; и (iv) обнаруживают присутствие накопленных молекул указанного по меньшей мере одного аналита на указанном по меньшей мере одном адресном участке.

[0080] В некоторых вариантах осуществления способ согласно настоящему изобретению также включает этап, на котором нагревают раствор с использованием нагревательного слоя пасты с высокой проводимостью в электрофоретическом чипе. Нагрев раствора может быть осуществлен до, после или одновременно с любым из этапов способа.

[0081] В некоторых вариантах осуществления напряжение, подаваемое на электрофоретический чип на этапе (ii) способа, находится в диапазоне 2-3000 В. В конкретных вариантах осуществления подаваемое напряжение находится в диапазоне 5-500 В, предпочтительно в диапазоне 5-50 В.

[0082] В некоторых вариантах осуществления этап удаления свободных молекул аналита из раствора (этап (iii)) осуществляют путем подачи промывочных буферов, имеющих разное содержание соли, путем приложения инверсной полярности к электрофоретическому устройству или путем нагрева раствора.

[0083] В некоторых вариантах осуществления этап обнаружения связывания с аналитом (этап (iv)) осуществляют с помощью оптических, электрохимических или радиоизотопных способов.

[0084] В некоторых вариантах осуществления подачу напряжения на электрофоретический чип осуществляют на любом из этапов способа, снижая таким образом неспецифическое связывание с молекулами аналита или содействуя осуществлению указанных этапов способа. В некоторых конкретных подобных вариантах осуществления подачу напряжения осуществляют в периодическом режиме с инверсией полярности или в режиме постоянного тока или переменного тока с различной продолжительностью подачи. В других конкретных подобных вариантах осуществления подачу напряжения осуществляют с использованием режима наложения переменного тока на постоянный ток, включая прямоугольные, синусоидальные и треугольные сигналы.

[0085] На фиг. 1а и 1b показаны покомпонентный и увеличенный виды электродной структуры электрофоретического чипа согласно настоящему изобретению. Электродная структура содержит слой 23 проводящей низкоомной пасты и слой 24 углеродной пасты, причем слой 23 проводящей низкоомной пасты напечатан непосредственно на непроводящей подложке 10 чипа, а слой 24 углеродной пасты напечатан на верхней поверхности слоя 23 проводящей низкоомной пасты, и таким образом создана конечная электродная структура. Слой 24 углеродной пасты определяет сопротивление электродной структуры, определяя таким образом напряжение и электрическое поле, прикладываемые в (ди)электрофоретическом процессе.

[0086] Как схематично показано на фиг. 2, пример электродной структуры электрофоретического чипа согласно настоящему изобретению содержит матрицу 15 рабочих электродов 14, общую контактную линию 12, соединяющую все рабочие электроды 14 в единую матрицу 15, и противоэлектрод 13. Подложка 10 имеет впускное отверстие 11 и выпускное отверстие 11' для ввода и вывода жидких растворов из чипа, как будет подробно описано ниже. Электродная конфигурация, показанная на фиг. 2, обеспечивает значительное улучшение электрофоретического переноса и управления им. Это достигается благодаря симметричному геометрическому расположению электродов в электродной матрице, и таким образом обеспечиваются равные и однородные токи на всех рабочих электродах.

[0087] В электрофоретическом чипе согласно настоящему изобретению устранен ряд ограничений, и он нацелен на преодоление ряда проблем, характерных для известных в настоящее время электрофоретических чипов, как будет описано ниже.

[0088] Первая проблема, решенная с помощью настоящего изобретения, состоит в том, каким образом обеспечить равные токи на всех рабочих электродах в электродной матрице, используемой для электрофореза, и в том, каким образом обеспечить однородное распределение этих токов по поверхности каждого рабочего электрода в электродной матрице. Термин «равные» относится к электрическим токам, измеряемым в Амперах, и определяет установившиеся токи, имеющие равную величину электрического заряда, протекающего на каждый рабочий электрод в единицу времени. Термин «однородные» относится к распределению тока по заданной электродной поверхности. Однородное распределение тока может считаться одним из показателей качества электрода. Однородное распределение тока по поверхности рабочих электродов определяется формой и размерами электродов и материалом электродов. Однородное распределение тока не изменяется во время разрядки и значительно упрощает измерения. Как указано выше, термин «равные и однородные электрические токи» в контексте данного документа означает, что все рабочие электроды на всех адресных участках принимают приблизительно равные электрические токи с одной и той же плотностью тока, которая однородно распределена по электродной проверхности. Равные токи, принимаемые всеми рабочими электродами, и однородное распределение указанных токов по поверхности каждого из указанных электродов, обеспечивают возможность фактически неуправляемой работы чипа.

[0089] Благодаря наличию слоя проводящей низкоомной пасты и минимальному падению напряжения в схеме, электроны поступают по существу поровну на все рабочие электроды электрофоретического чипа согласно настоящему изобретению, и в результате этого электрические токи, подаваемые на все рабочие электроды, приблизительно равны. Для обеспечения равных токов на всех рабочих электродах, эти электроды должны быть симметрично расположены в пространстве относительно противоэлектрода, и их адресные участки должны быть расположены на равном расстоянии от противоэлектрода. Кроме того, для получения однородного распределения тока, электроды должны быть изготовлены из одинакового материала и они должны иметь одинаковую форму и размеры, в частности пространственную геометрическую форму и толщину. Равные токи определяются также сопротивлением раствора электролита между рабочими электродами и противоэлектродом.

[0090] Вышеописанная конфигурация электродной матрицы не требует отдельного контакта с каждым рабочим электродом матрицы, и все рабочие электроды могут быть соединены с помощью лишь одной контактной линии. Таким образом, структура матрицы рабочих электродов со относительно низким сопротивлением и высокой проводимостью в электрофоретическом чипе согласно настоящему изобретению обеспечивает протекание равных и однородных токов во все рабочие электроды указанной матрицы. Как указано выше, это означает, что падение напряжения на всей контактной линии в слое проводящей низкоомной пасты является очень низким. Результатом этого является отсутствие значительной разности между электрическими токами, протекающими во все электроды по контактной линии, согласно закону Ома при одном и том же сопротивлении.

[0091] Геометрическая конструкция электродной структуры обеспечивает однородное распределение электрического поля между противоэлектродом и всеми рабочими электродами, открытыми к противоэлектроду при одном и том же взаимном геометрическом расположении. Эта геометрическая конструкция будет способна обеспечивать однородное поле в растворе по горизонтали между рабочими электродами и противоэлектродом и над ними, также известное как однородная «рассеивающая способность».

[0092] На фиг. 1a, 1b и 2 показана схематичная компоновка, в которой вся матрица рабочих электродов и противоэлектрод расположены в одной плоскости, в то время как в обычных компоновках рабочие электроды обращены непосредственно к противоэлектроду своими сторонами с наибольшей площадью поверхности. Геометрическая и пространственная компоновка электродов, показанная на данных фигурах, является иллюстративной и не должна рассматриваться как ограничивающая. Специалисты в данной области техники смогут выявлять геометрические конфигурации, отличные от плоских, но при сохранении однородной «рассеивающей способности» между рабочими электродами и противоэлектродом. Например, геометрическая и пространственная компоновка электродов может быть прямоугольной, треугольной, круглой, спиральной, в виде параллельно свитых спиралей, фрактальной и т.п. В конкретном варианте осуществления электроды имеют плоскую геометрическую форму. Поскольку все рабочие электроды имеют одинаковую геометрическую форму, обеспечивается однородное распределение тока. Для проведения приблизительно одинакового электрического тока все рабочие электроды в электродной матрице расположены симметрично и на одинаковом расстоянии, определяемом как «электродный зазор», от противоэлектрода.

[0093] Вторая проблема, решенная с помощью настоящего изобретения, состоит в том, каким образом обеспечить эффективный электрофоретический перенос на поверхности электродов. Как показано в данном документе, она решена путем создания слоистой структуры электродов (путем печати слоя углеродной пасты на слое проводящей низкоомной пасты), выполненной с возможностью показа более высокого сопротивления на поверхности, открытой к раствору электролита. В обычных электрофоретических чипах электродные поверхности имеют высокую проводимость и не показывают высокого электрического сопротивления. Следовательно, такие чипы не создают электрических напряжений, превышающих те, которые ожидаются от электрохимических реакций, происходящих на их поверхности. В отличие от этого, электрофоретические чипы со слоистой структурой согласно настоящему изобретению способны осуществлять электрофоретическое накопление и/или сепарацию аналитов однородно на каждом электроде, но при более сильных электрических полях, и, следовательно, они способны обеспечивать более эффективный электрофоретический процесс.

[0094] Кроме того, электрофоретический чип согласно настоящему изобретению изготовлен путем печати паст с разными удельными сопротивлениями таким образом, что послойная печать паст обеспечивает одинаковое распределение тока на всех электродах электродной матрицы, а также оптимизацию приложенного электрического поля на всех электродах для улучшения и ускорения электрофоретического процесса.

[0095] На фиг. 3а-3с схематично показан электрофоретический чип согласно настоящему изобретению, который также содержит изоляционный слой 16 диэлектрической пасты. После того, как электродная структура, содержащая слой низкоомной пасты и слой углеродной пасты, напечатана на непроводящей подложке, на той же самой непроводящей подложке поверх указанной электродной структуры напечатан изоляционный слой 16 диэлектрической пасты таким образом, что он изолирует основную часть поверхности электродной структуры от раствора. Изоляционный слой 16 диэлектрической пасты имеет несколько отверстий 17, каждое из которых выровнено с отдельным рабочим электродом матрицы рабочих электродов, и одно относительно большое отверстие 18, выровненное с противоэлектродом, с результате чего созданы адресные участки 19, на каждом из которых рабочие электроды и часть противоэлектрода открыты для раствора. Таким образом, «адресные участки» определяются конкретными отверстиями в диэлектрическом изоляционном слое на электродной поверхности, и на них электроды или их участки открыты для раствора. В то время как рабочие электроды доступны через адресные участки 19, на которых они открыты для испытуемого раствора, общий противоэлектрод (или по меньшей мере его часть) доступен через отверстие 18.

[0096] Слой проводящей низкоомной пасты выполнен с возможностью передачи электрического тока от внешнего источника питания через всю электродную структуру электрофоретического чипа в направлении отверстий 17 в диэлектрическом слое 16, которые образуют адресные участки 19. При этом ток протекает вертикально вверх в и через слой углеродной пасты, который имеет более высокое сопротивление, чем слой проводящей пасты, и выполнен с возможностью создания более высоких напряжений на электродных поверхностях, открытых для испытуемого раствора на адресных участках 19. Таким образом обеспечивается возможность того, чтобы ток достигал всех адресных участков 19 по существу одновременно (по сравнению с ситуацией, когда используется один слой пасты на основе углерода), для осуществления контакта с раствором либо непосредственно, либо через гель, для содействия электрофоретическим процессам в среде и дополнительного ограничения падения напряжения в цепи. Следовательно, токи, протекающие через слой проводящей низкоомной пасты ко всем адресным участкам, будут приблизительно равны (поскольку падение напряжения на этом слое минимально).

[0097] Если электрический ток, принимаемый всеми рабочими электродами в единицу времени, отрегулирован, т.е., установлен, и сделан постоянным с использованием определенной геометрической формы, конфигурации и материала электродов, как это имеет место в электрофоретическом чипе, раскрытом в данном документе, то электрофоретический перенос становится прямо пропорциональным этому току, приближаясь к закону Фарадея, который действует во многих электрохимических и электроаналитических областях применения. Закон Фарадея описывает количественный перенос молекул и других заряженных частиц при приложении электрического поля и утверждает, что электрический ток пропорционален количеству переносимых заряженных частиц. Поскольку во время электрофореза более крупные молекулы или заряженные вещества, например микро- и наночастицы, переносятся под действием электрического поля одновременно с ионами в растворе, их перенос определяется их электрофоретической мобильностью и может замедляться гелевой матрицей. В растворах перенос более крупных молекул является намного более медленным, чем перенос ионов, и требует значительно более сильных электрических полей для эффективного электрофореза.

[0098] Непроводящая подложка 10 может быть изготовлена из различных материалов на основе одного или более компонентов, включая пластмассу, резину, кремний с непроводящим слоем диоксида кремния, стекло, керамику, термоактивные смолы, термопластичные смолы или любые плоские непроводящие подложки, пригодные для массового производства и контроля размеров слоистых структур. Подходящие термопластичные смолы могут включать ацеталевые смолы, акриловые смолы, такие как метилакрилат, целлюлозные смолы, такие как этилцеллюлоза, ацетат целлюлозы, пропионат целлюлозы, ацетобутират целлюлозы, нитрат целлюлозы, хлорсодержащие простые полиэфиры; нейлон, полиэтилен, полипропилен, полистирол; стироловые смеси, такие как сополимеры акрилонитрила и стирола и сополимеры акрилонитрила и бутадиена, полихлоротрифторэтилен, поликарбонаты и виниловые полимеры и сополимеры, такие как винилацетат, виниловый спирт, винилбутират, винилхлорид, сополимер винилхлорида и винилацетата, винилиденхлорид и винилформаль. Подходящие термоактивные смолы включают алкилфталат, фуран, меламинформальдегид, полиакриловые сложные эфиры, фенолформальдегид и сополимер фенола и фурфураля, по отдельности или в смеси с сополимером бутадиена и акрилонитрила или сополимерами акрилонитрила, бутадиена и стирола, силиконы, мочевиноформальдегиды, эпоксидные смолы, полиимиды, алкиловые смолы, глицерилфталаты и сложные полиэфиры.

[0099] Электрофоретический чип согласно настоящему изобретению может быть изготовлен методом «трафаретной печати», согласно которому печатную пасту наносят непосредственно на поверхность подложки (трафарета) с использованием шаблона, который задает конечный рисунок печатной электронной схемы. Этот рисунок литографическим методом переносят на трафарет таким образом, чтобы области отсутствия печати были закрыты и указанный трафарет служил бы в качестве шаблона. Этот шаблон предварительно задает области, которые будут сделаны непроницаемыми для пасты в результате закрытия трафарета. Пасту наносят на трафарет таким образом, чтобы она прошла через незакрытые области и достигла подложки. Для каждой печатной электронной схемы изготавливают отдельный шаблон и повторяют процесс. В качестве альтернативы, электрофоретический чип может быть выполнен путем 3D-печати, напечатан путем струйной печати или напечатан с помощью любой другой подходящей технологии печати.

[0100] Электрофоретический чип согласно настоящему изобретению также может содержать необязательный эталонный электрод. Такой электрод может быть полезен, если указанный электрофоретический чип используется также в качестве электроаналитического устройства. В этом случае слоистая электродная структура из паст может сочетать в себе электрофоретические признаки и электроактивные электроаналитические признаки электродов. В случае, если электрофоретический чип соединен с другой камерой с помощью другого электрофоретического чипа или его электродной матрицы, первый из вышеуказанных будет служить в качестве чувствительного чипа, который будет содержать пасту, способствующую применению в электроаналитических областях или при электрохимическом обнаружении. Эталонные электроды обычно используются в большинстве электрохимических технологий, применяемых для обнаружения аналита на электродной проверхности. Таким образом, эталонный электрод может быть встроен как неотъемлемая часть электрофоретического чипа, например, с использованием паст, содержащих материалы для эталонного электрода, таких как пасты, содержащие серебро/хлорид серебра, или он может быть размещен в электрофоретическом устройстве, содержащем электрофоретический чип согласно настоящему изобретению, и соединен с ним.

[0101] Слой 23 проводящей низкоомной пасты может быть изготовлен из паст, содержащих металлические элементы, которые показывают низкое удельное сопротивление, такие как серебро, золото, алюминий, никель, бронза, железо, олово, платина и свинец. Слой 24 углеродной пасты с высоким сопротивлением фактически изготавливают из углеродной пасты, которая также может содержать добавки, такие как изоляционные наполнители (например, тефлоноподобные частицы или полимерные частицы), которые значительно снижают удельную проводимость слоя углеродной пасты, полупроводящие частицы оксида титана или сходные металлические частицы с высокими перенапряжениями для выделения водорода и кислорода, и другие соответствующие материалы, которые способны минимизировать выделение кислорода/водорода. Материалы, показывающие высокие перенапряжения для выделения кислорода и/или водорода, будут минимизировать электролиз воды на электродах в растворе и, следовательно, минимизировать образование пузырьков в воде. В качестве альтернативы, в слое углеродной пасты могут использоваться материалы, способные вызывать электрохимические реакции, отличные от электролиза воды, например, но без ограничения, диоксид титана, применяемый для анодов, или гидриды палладия, применяемые для катодов.

[0102] В конкретном варианте осуществления слой углеродной пасты состоит по существу из углерода и металлических частиц с высокими перенапряжениями для выделения водорода и кислорода. Таким образом, материалы, используемые для изготовления пастовых составов для применения в области электрофореза, выбираются из следующих:

(i) каталитически пассивные металлы или оксиды (смеси металлов или их оксидов, комбинации оксидов или гидроксидов, таких как оксиды/гидроксиды никеля или сходные с ними), которые подавляют выделение кислорода/водорода во время электролиза воды;

(ii) металлы, способные захватывать/абсорбировать газы (например, палладий и никель для водорода); (iii) полупроводящие металлы или металлические частицы, показывающие полупроводящие свойства и требующие высоких напряжений для инициирования электролиза воды; или (iv) материалы, которые содействуют реакциям, отличным от гидролиза воды.

[0103] Термин «перенапряжение», используемый по всему настоящему описанию, относится к перенапряжению активации, перенапряжению реакции или перенапряжению концентрации, включая перенапряжение образования пузырьков. Следует отметить, что термин «непроводящий» не обязательно должен интерпретироваться как обладающий высоким перенапряжением для выделения кислорода и водорода. Настоящая заявка нацелена на минимизацию указанного выделения во время накопления нужных частиц аналита из водных растворов. Во всех случаях, когда осуществляется электролиз раствора, происходит образование пузырьков кислорода или водорода при превышении перенапряжений электродных материалов. Металлы, такие как палладий и никель, а также металлостекла, такие как комбинации сплавов на основе циркония, меди, алюминия и никеля, осуществляют абсорбцию и не допускают выделения больших количеств водорода и, следовательно, они способны модифицировать или минимизировать выделение водорода.

[0104] В качестве альтернативы, в пастовых составах могут использоваться металлы, способные инициировать реакции, отличные от выделения кислорода, например титан, который способен образовывать толстый слой оксида титана (полупроводник) на металлической поверхности титана при подаче высоких положительных напряжений. Иначе говоря, смешение титана с углеродной пастой обеспечивает возможность дополнительного контроля и минимизации выделения кислорода и водорода во время электрофоретического накопления или в других (ди)электрофоретических областях применения. Таким образом, в конкретном варианте осуществления слой углеродной пасты содержит углерод и металл, выбранный из ртути, платины, палладия, никеля и титана.

[0105] На фиг. 4 показан увеличенный вид матрицы рабочих электродов в электрофоретическом чипе согласно настоящему изобретению. Матрица рабочих электродов содержит отдельные рабочие электроды 14 и общую контактную линию 12, соединяющую все рабочие электроды в единую электродную матрицу. Каждый отдельный рабочий электрод определен как «рабочая область», в то время как область, в которой этот отдельный рабочий электрод соединен с контактной линией 12, определена как «соединительная область» 27 для каждого конкретного рабочего электрода 14. Таким образом, слой 23 проводящей низкоомной пасты в матрице рабочих электродов напечатан в виде заданной структуры, образующей по меньшей мере одну рабочую область и по меньшей мере одну соединительную область 27.

[0106] В некоторых вариантах осуществления каждый отдельный рабочий электрод в матрице рабочих электродов содержит слой пасты с высоким сопротивлением, такой как слой углеродной пасты, между рабочей областью и соединительной областью. Этот слой имеет более высокое сопротивление, чем слой углеродной пасты, и по существу действует как электрический резистор. Потому данный слой пасты с высоким сопротивлением определен в данном документе как «резисторный слой». На фиг. 5 показан увеличенный вид подобной конфигурации электрофоретического чипа согласно настоящему изобретению, содержащей резисторный слой углеродной пасты (или «резисторный слой») 25, напечатанный между каждым отдельным рабочим электродом (рабочей областью) 14 и соединительной областью 27 в матрице рабочих электродов. Резисторный слой 25 напечатан на подложке 10, действует как встроенный резистор известного или нужного номинала и значительно повышает напряжение на электрофоретическом чипе, поддерживая при этом постоянный ток на адресных участках 19. В еще одном варианте осуществления слой 23 проводящей низкоомной пасты в рабочем электроде 14 напечатан в виде заданной структуры, образующей по меньшей мере одну рабочую область и по меньшей мере одну соединительную область 27, и резисторный слой 25 соединяет в качестве перемычки каждый из рабочих электродов 14 с соединительной областью 27.

[0107] В конкретном варианте осуществления резисторный слой 25 имеет поверхностное удельное сопротивление вплоть до величины, которая в 10 раз выше, чем у слоя 24 углеродной пасты. Как указывалось выше, поверхностное сопротивление резисторного слоя 25 может находиться, например, в диапазоне 0,05-1×10⁷ Ом/мм², более конкретно в диапазоне 50-500 Ом/мм². В некоторых вариантах осуществления, благодаря использованию резисторного слоя, обеспечивается возможность подачи на электрофоретический чип напряжения 2-500 В. Благодаря подаче такого относительно высокого напряжения к электрофоретическому чипу согласно настоящему изобретению, обеспечивается возможность более быстрого переноса и накопления аналитов на участках доступа, а также улучшенной сепарации аналитов.

[0108] Резисторный слой 25 может быть изготовлен из паст, показывающих высокое поверхностное сопротивление, таких как углеродные пасты типа DuPont, например DuPont 5067 и DuPont BQ221, или вновь смешанные пасты, которые показывают еще более высокое удельное сопротивление. Сопротивление таких углеродных паст будет зависеть также от геометрической формы электродов. Таким образом, благодаря увеличению их длины (например, до нескольких миллиметров, в зависимости от фактической геометрической формы электродов), или увеличению их толщины (например, в диапазоне 0,1-0,5 мм), будет обеспечено дополнительное регулирование номиналов резистора.

[0109] Электрофоретический чип согласно настоящему изобретению также может содержать толстый изоляционный слой диэлектрика или присоединенную перфорированную подложку, размещенную на верхней поверхности указанного электрофоретического чипа, и крышку для покрытия указанного диэлектрика или присоединенной перфорированной подложки, причем указанные диэлектрик или присоединенная перфорированная подложка содержат функциональную флюидную камеру или канал.

[0110] На фиг. 6а-6b показана конфигурация электрофоретического чипа согласно настоящему изобретению, который также содержит толстый изоляционный слой диэлектрика или присоединенный перфорированный материал (диэлектрический слой) 20, размещенный на верхней поверхности электрофоретического чипа. Толстый диэлектрический слой 20 напечатан в виде рамки по внешнему периметру электрофоретического чипа или вокруг матрицы электродов и затем на нем размещен прозрачный лист 21, в результате чего создана флюидная или микрофлюидная камера или канал 22 для доставки испытуемого флюида к электродной структуре. Фактически, диэлектрический слой 20 образует границы флюидной камеры или канала 22. Испытуемые жидкие растворы поступают во флюидную камеру или канал 22 через впускное отверстие 11 и выходят из камеры через выпускное отверстие 11' (показано на фиг. 2). Прозрачный лист 21, размещенный на верней поверхности флюидной камеры или канала 22, служит в качестве крышки и обеспечивает возможность измерения оптических сигналов (флуоресцентных, люминесцентных и т.п.) или осуществления любой оптической визуализации внутренней области флюидной камеры или канала 22.

[0111] Электродные структуры электрофоретического чипа, раскрытые в данном документе, могут быть изготовлены в трех конфигурациях. В первой конфигурации низкоомные пастовые линии (проводящие линии, например линии из серебряной пасты) размещены на непроводящей подложке. В этой первой конфигурации осуществлена печать углеродной пасты с тем же сопротивлением, что и описанное выше, на верхней поверхности проводящих линий. Во второй конфигурации все проводящие линии покрыты новым слоем углеродной пасты с еще более высоким сопротивлением и с вышеуказанными необязательными добавками, предотвращающими любые побочные электроактивные реакции на электродной поверхности (и таким образом минимизирующие выделение кислорода и водорода). Резисторная углеродная паста, заполняющая лишь пространство между каждым отдельным рабочим электродом (рабочей областью) и контактной линией (соединительной областью), при отсутствии нижележащей низкоомной пасты, может быть такой же, что и углеродная паста, напечатанная на верхней поверхности низкоомной пасты. В данном конкретном случае необходимы лишь два слоя углеродной пасты, поскольку слой углеродной пасты фактически служит как в качестве резисторной пасты, так и в качестве диэлектрического слоя. В третьей конфигурации дополнительный (третий) слой углеродной пасты, напечатанный на верхней поверхности существующего слоя углеродной пасты, используется в качестве резисторного слоя, но это будет аналогично размещению диэлектрической пасты (изолятора) в качестве третьего слоя.

[0112] Во время нормальной работы электрофоретического чипа согласно настоящему изобретению, молекулы аналита, имеющие заданный заряд, притягиваются к адресным участкам на рабочих электродах. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одно отверстие над противоэлектродом может образовывать дополнительную адресную область. Поскольку отрицательный заряд противоэлектрода противоположен положительному заряду рабочего электрода, адресные участки на противоэлектроде будут притягивать молекулы аналита, имеющие противоположный заряд относительно тех молекул аналита, сепарация которых была изначально запланирована. Соответственно, одинаковые адресные участки на противоэлектроде могут также использоваться для притягивания по меньшей мере еще одного аналита, имеющего противоположный заряд относительно первого аналита, и таким образом обеспечивается возможность сепарации и испытания по меньшей мере двух разных аналитов с помощью одного электрофоретического чипа. В качестве альтернативы, адресные участки на противоэлектроде могут активироваться путем инверсии полярности подаваемого напряжения, при этом рабочие электроды становятся противоэлектродами, и наоборот. В некоторых вариантах осуществления инверсия полярности используется для электронного смывания аналита, накопленного на рабочих электродах, и/или для неспецифического связывания на специфических зондах в накопительном гелевом островковом слое.

[0113] В некоторых вариантах осуществления непроводящая подложка также содержит нагревательный слой пасты с высокой проводимостью, напечатанный на нижней поверхности непроводящей подложки, как показано на фиг. 7а-7b. В данной конфигурации непроводящая подложка содержит сквозные отверстия 29, через которые нагревательный слой 28 пасты с высокой проводимостью проходит к своим контактам 12', напечатанным на верхней поверхности непроводящей подложки. Иначе говоря, сквозные отверстия 29 используются для выведения электрических контактов 12' нагревательного слоя на верхнюю поверхность непроводящей подложки. Таким образом обеспечивается возможность простого контакта нагревательного слоя 28 с источником питания с верхней стороны непроводящей подложки и исключается необходимость в дополнительных электрических контактах на нижней поверхности чипа.

[0114] Нагревательный слой 28 пасты с высокой проводимостью осуществляет нагрев чипа и флюидной камеры, расположенной с противоположной стороны чипа поверх всей области непроводящей подложки, где расположены нагревательные проводники извилистой формы. Это способствует удалению основной части неспецифично связанных аналитов и, следовательно, снижению фонового шума и повышению специфичности и чувствительности электрофоретического способа согласно настоящему изобретению. В конкретном варианте осуществления нагревательный слой 28 не находится в контакте с проводящим слоем 23 или со слоем 24 углеродной пасты, т.е. он отделен от них непроводящей подложкой и не имеет электрической связи с ними.

[0115] При активации нагревательного слоя 28 температура испытуемого раствора повышается, в результате чего обеспечивается возможность улучшения переноса аналитов в растворе к адресным участкам 19 или возможность температурного удаления неспецифических аналитов, таких как неспецифично связанные ДНК (в процессе обнаружения ДНК), вымывание которых возможно при высоких температурах.

[0116] В некоторых вариантах осуществления нагревательный слой 28 может быть выполнен из паст на серебряной основе. Он также может быть выполнен из паст, имеющих физические свойства, идентичные или сходные с физическим свойствами слоя проводящей низкоомной пасты в электродной структуре. Нагревательный слой 28 может быть выполнен в виде как толстой, так и тонкой пленки. Толстые пленки обычно печатаются, в отличие от тонких пленок, которые часто наносятся с помощью процесса осаждения из паровой фазы. Тонкопленочный нагревательный элемент имеет высокое электрическое сопротивление благодаря своему крайне тонкому поперечному сечению и природе нагревательного материала. Нагревательный слой может быть изготовлен, например, из следующих материалов: керамика, такая как керамика с положительным температурным коэффициентом, металлокерамика (кермет), полимеры, такие как Kapton® (гибкая и легкая тонкая пленка из органического полиимидного полимера с высокой диэлектрической способностью) и силиконовая резина. Помимо паст на основе керамики, для изготовления нагревательных элементов также могут применяться полимерные системы, что обеспечивает возможность высокой гибкости при выборе подложек. Печатные толстопленочные полимерные нагреватели содержат низкоомные печатные полимеры с серебром или углеродом в качестве наполнителя, действующие в качестве нагревательных дорожек. Проводящие частицы, такие как серебро и углерод, находятся во взвешенном состоянии внутри полимерного связующего.

[0117] В некоторых вариантах осуществления, вместо или вместе с нагревательным слоем 28 могут использоваться нагревательные средства других типов, такие как внешний нагреватель (катушка, нагреватель Kapton® или сходные с ними). В еще одном варианте осуществления сквозные отверстия 29 могут использоваться для изготовления электрофоретических чипов с многослойными структурами, а именно не путем одной лишь печати на непроводящей подложке, но также и печати двух, трех или более слоев, отделенных друг от друга посредством, например, изоляционного или диэлектрического слоя, причем каждый конкретный печатный слой переходит в следующий слой или открыт к нему через такие сквозные отверстия. Таким образом, например, нагревательный слой может быть встроен в третий слой четырехслойной структуры, причем контакты нагревательного слоя выведены на верхнюю поверхность через сквозные отверстия. В этом случае матрица углеродных электродов может быть размещена в первом слое, при необходимости покрытом гелевой матрицей, например, для электрофоретических целей. Тогда во втором слое будут находиться электроды на основе углерода для электронных целей, в то время как в четвертом слое могут быть размещены различные датчики и/или матрицы управления.

[0118] В альтернативной конфигурации, показанной на фиг. 7с, нагревательный слой 28 с высокой проводимостью напечатан на верхней поверхности непроводящей подложки 10 и не находится в контакте с электродной структурой.

[0119] Гелевая матрица захвата молекул точечно нанесена лишь на адресные участки 19, как показано на фиг. 8а-8b, так что смежные точки на гелевой матрице не находятся в контакте друг с другом. Эта конфигурация матричных точек, определенных в данном документе как «гелевые островковые области», обеспечивает возможность переноса молекул аналита к электродам, в отличие от известных в настоящее время электрофоретических устройств, имеющих сплошной или монолитный гелевый слой, который покрывает всю поверхность электродов. Поскольку данная конфигурация включает поверхности раздела гель-раствор-гель (GSG), она обеспечивает возможность содействия образованию множества точек или зон накопления молекул при горизонтальном перемещении молекул, как это имеет место при гелевом электрофорезе. Преимущества данной конфигурации перечислены ниже.

[0120] Как указывалось выше, данная гелевая матрица может быть изготовлена из различных материалов, таких как пористые полимерные структуры, пленкообразующие решетки, протеиновые смеси, такие как фотоформуемые протеиновые смеси, полупроницаемые тонкие пленки, газопроницаемые мембраны, функционализированные химическими группами, для образования соединительного слоя, покрытий и т.п. Адресные участки могут связываться с различными аналитами за счет, например, физической абсорбции на поверхности, ковалентного связывания с поверхностью через функциональные группы и/или перекрестно-сшивающее вещество и поддерживаемые пленки. Это будет более подробно описано ниже.

[0121] Электрофоретические устройства на гелевой основе, известные из уровня техники, используют лишь электродные системы со сплошным гелевым слоем для сепарации молекул. Эти электрофоретические устройства схематично показаны на фиг. 9а, 9b и 10а и проведено их сравнение с электрофоретическим чипом согласно настоящему изобретению, показанным на фиг. 9с и 10b. В отличие от гелевых электрофоретических устройств, известных в настоящее время, электрофоретический чип, раскрытый в данном документе, имеет гелевую матрицу захвата молекул, точечно нанесенную на или покрывающую по меньшей мере один адресный участок, в результате чего создана по меньшей мере одна гелевая островковая область.

[0122] На фиг. 9а-9с схематично сравниваются электрофоретическое устройство на гелевой основе, известное в настоящее время (см. фиг. 9а-9b), имеющее сплошной гелевый слой 36 на электродах, и электрофоретический чип согласно настоящему изобретению, который имеет состоящую из гелевых островков 34 гелевую матрицу захвата молекул на электродах (см. фиг. 9с). Как показано на фиг. 9с, гелевые островки 34 точечно нанесены на все рабочие электроды матрицы, на которых происходит накопление аналита, в то время как противоэлектрод 13 не покрыт гелем. Геометрическая форма в данном случае значительно отличается от той, которая имеет место в известных в настоящее время чипах, и она обеспечивает возможность значительно улучшения сбора аналита и его переноса между противоэлектродом и рабочими электродами. Молекулы аналита переносятся вдоль силовых линий 31, создаваемых при подаче напряжения на устройство, как показано на фиг. 9а-9с и 10а-10b. Эти силовые линии отличаются в устройствах, известных в настоящее время, и в электрофоретическом чипе согласно настоящему изобретению, как будет описано ниже.

[0123] Как показано на фиг. 9а и 9b, в электрофоретических устройствах, известных в настоящее время, вся электродная матрица покрыта сплошным гидрогелем 36, образующим монолитный слой, в котором перенос аналита сильно замедляется. В отличие от этого, в электрофоретическом чипе согласно настоящему изобретению (см. фиг. 8а-8b и фиг. 9с) гелевые островки точечно нанесены непосредственно на все рабочие электроды, покрывая лишь поверхность этих электродов и выступая внутрь раствора на толщину гелевого островка, которая обычно составляет 5-500 мкм, более предпочтительно 30-150 мкм. Гелевые островки, используемые в электрофоретическом чипе согласно настоящему изобретению, не соединены и не образуют монолитный слой, как это имеет место в стандартном гелевом электрофорезе и в электрофоретических устройствах, известных в настоящее время. Благодаря этому, испытуемый раствор 37, показанный на фиг. 9с между электродами электрофоретического чипа согласно настоящему изобретению находится под действием локализованного электрического поля, и молекулы аналита между электродами (и, в частности, на их поверхностях) в результате этого перемещаются через раствор, а не через гель, как это имеет место в известных в настоящее время электрофоретических устройствах, показанных на фиг. 9а и 9b. Поскольку перенос через раствор происходит намного быстрее, чем через гель, общее накопление в электрофоретическом чипе согласно настоящему изобретению является намного более эффективным. Испытуемый раствор 37, показанный на фиг. 9с, обычно имеет толщину приблизительно 0,1-1,0 мм.

[0124] Электроды в электрофоретическом чипе согласно настоящему изобретению предпочтительно расположены в одной горизонтальной плоскости. Благодаря этому, силовые линии 31 электрического поля (см. фиг. 9с) проходят через испытуемый раствор 37 внутрь гелевых островков 34. Иначе говоря, силовые линии 31 электрического поля на рабочих электродах 14, которые накапливают молекулы аналита, направлены к рабочим электродам и проходят от противоэлектрода чрез весь объем раствора над каждым рабочим электродом электродной матрицы. Таким образом, на все рабочие электроды электродной матрицы воздействует однородное и сильное поле (благодаря слоистой электродной структуре) и, следовательно, сбор из объема раствора над всеми рабочими электродами матрицы происходит одинаковым образом.

[0125] На фиг. 10а и 10b показаны трехмерные виды электрофоретического устройства, известного в настоящее время, и электрофоретического чипа, раскрытого в данном документе, соответственно. Известная конфигурация, имеющая сплошной гелевый слой на электродах и показанная на фиг. 10а, сравнивается с электрофоретическим чипом согласно настоящему изобретению, показанным на фиг. 10b и имеющим гелевые островки, расположенные на рабочих электродах электродной матрицы. Осуществляется перенос одинаковых молекул 30 и 32 аналита на разные расстояния к электродам через гель. Молекулы 30 и 32, показанные на фиг. 10b, становятся чувствительными к электрическому полю и притягиваются вдоль силовых линий 31 электрического поля в направлении рабочих электродов 14 электрофоретического чипа согласно настоящему изобретению.

[0126] В этой связи следует отметить, что сплошные жирные стрелки фактически показывают перемещение и/или перенос молекул аналита. Таким образом, линии 31, показанные на фиг. 10а-10b, представляют собой силовые линии электрического поля, схематично характеризующие его посредством комбинации местоположения и формы этих силовых линий. Тем не менее, направление и длина этих силовых линий относятся лишь к переносу молекул аналита. Следовательно, указанные стрелки на фиг. 10а являются более короткими при прохождении через гель, где перенос молекул аналита является значительно более медленным или менее эффективным, чем через раствор. Это пояснено на фиг. 11a-11b, схематично иллюстрирующих электрофоретический перенос молекул 30 через жидкую среду 35 и через пористую гелевую матрицу 36 соответственно. Пористая гелевая матрица 36 замедляет перенос по сравнению с переносом в жидкости. На фиг. 11b показан медленный, длинный и извилистый путь молекул 30 через гелевую матрицу, в то время как на фиг. 11а показан прямой, более простой и более быстрый перенос через жидкую или растворную среду.

[0127] При подаче напряжения на известное в настоящее время электрофоретическое устройство или на электрофоретический чип, раскрытый в данном документе, между противоэлектродом 13 и каждым из рабочих электродов 14 создается электрическое поле с силовыми линиями 31, как показано на фиг. 10а-10b. Молекулы 30 и 32 аналита, например нуклеиновых кислот, притягиваются вдоль силовых линий 31 к рабочим электродам 14. Если эти молекулы 30 и 32 аналита заряжены отрицательно, то рабочие электроды 14 должны быть заряжены положительно для накопления молекул 30 и 32 на поверхности рабочих электродов. В целом, направление электрического поля представляет собой направление силы, которая будет действовать на положительный заряд. Следовательно, стрелки силовых линий 31 направлены от плюса к минусу.

[0128] Слоистая структура и резистивные свойства углеродных паст, используемых для печати рабочих электродов или резисторного слоя 25 (показан на фиг. 5) в электрофоретическом чипе согласно настоящему изобретению, обеспечивают возможность создания относительно высокого напряжения между противоэлектродом 13 и рабочими электродами 14. Чем выше это создаваемое напряжение, тем быстрее перенос молекул и тем более эффективным является процесс накопления молекул 30, 32 аналита внутри матрицы гелевых островков. Проникновение и захват молекул аналита в электрофоретическом чипе, раскрытом в данном документе, происходят не через всю структуру геля, как это имеет место в известных в настоящее время устройствах, а ближе к поверхности гелевых островков, потенциально на уровне 10%-50% высоты гелевых островковых областей, в зависимости от продолжительности приложения напряжения.

[0129] Помимо подаваемого напряжения, параметры, которые управляют электрофоретическим чипом согласно настоящему изобретению, включают геометрическую форму электродов, геометрическую форму точечно нанесенных или осажденных гелевых островков, расстояние d между противоэлектродом 13 и рабочими электродами 14 и расстояние w между рабочими электродами. Длина линий и размер стрелок, которые показывают направление и локальную скорость молекул переносимого аналита, зависят от местонахождения или расстояния от электродов в среде, через которую перемещается аналит.

[0130] На фиг. 12а и 12с (соответствующих фиг. 9b и 10а) показаны трехмерный вид и вид сбоку рабочих электродов в электрофоретическом устройстве, имеющем сплошной слой 36 геля, нанесенный на электроды. На фиг. 12b и 12d (соответствующих фиг. 9с и 10b) показаны трехмерный вид и вид сбоку рабочего электрода в электрофоретическом чипе согласно настоящему изобретению, имеющем гелевый островок 34 на рабочем электроде. Эти две пары фигур служат для сравнения между двумя указанными электрофоретическими чипами по эффективности электрофоретического накопления аналита в объемном растворе 37. Сравнение осуществлено путем схематичного показа соответствующих областей 46 (в известном в настоящее время устройстве) и 47 (в электрофоретическом чипе, раскрытом в данном документе) сбора аналита.

[0131] Термин «объемный раствор», используемый в данном документе применительно к испытуемому раствору 37, относится ко всему испытуемому раствору в целом для того, чтобы отличить его от меньшего объема раствора вблизи электродной поверхности. В предположении, что объемный раствор 37 образует жидкий «слой» молекул аналита над электродаит внутри флюидного канала 22, связанного с электрофоретическим чипом согласно настоящему изобретению (см. фиг. 6b), толщина этого слоя раствора будет равна высоте 38 флюидного канала. Это объясняется той простой причиной, что флюидный канал изготовлен из тонкого листа или рамки, полностью заполненной объемным раствором 37. В целях сравнения, та же самая высота 38 флюидного канала предполагается для известного в настоящее время электрофоретического устройства. Термин «область сбора» используется в данном документе для проведения различия между объемным раствором и той его частью, из которой производится сбор молекул аналита. Как видно на фиг. 12a-12d, область 46 сбора в электрофоретическом устройстве, имеющем сплошной гель, сильно отличается от области 47 сбора в электрофоретическом чипе, имеющем гелевые островки, раскрытые в данном документе, что ведет к значительному различию в эффективности электрофоретического накопления, как будет подробно описано ниже.

[0132] В конфигурации со сплошным гелевым слоем, показанной на фиг. 12а и 12с, поверхностная область гелевой матрицы 36, где происходит сбор молекул аналита, схематично показана в виде круглой плоской поверхности 44 (в случае, если электрод имеет круглую форму). В электрофоретическом чипе согласно настоящему изобретению поверхностная область гелевого островка схематично показана на фиг. 12b и 12d в виде полусферической поверхности 45. Причина круглой формы поверхностной области сбора будет пояснена ниже. Таким образом, в то время как в конфигурации чипа со сплошным гелем, показанной на фиг. 12а и 12с, молекулы аналита накапливаются на поверхности плоского сплошного геля, например в пределах приблизительно 10% толщины геля относительно его поверхности 44, в конфигурации с гелевыми островками накопление происходит по существу на полусферической поверхности 45 точечно нанесенного гелевого островка 34, например, в пределах той же самой глубины, составляющей приблизительно 10% толщины геля относительно его поверхности.

[0133] Как показано на фиг. 12a-12d, фактический объем объемного раствора, из которого производится сбор молекул аналита, относится к областям 46 и 47 сбора и зависит от геометрической формы и объема сплошного геля или гелевого островка. В конфигурации с гелевым островком, показанной на фиг. 12b и 12d, объемный раствор 37 полностью «охватывает» рабочий электрод 14 (окружает его со всех сторон), и сбор происходит на полусферической поверхности 45 гелевого островка. В отличие от этого, в конфигурации со сплошным гелем, показанной на фиг. 12а и 12с, сбор из объемного раствора 37 происходит лишь в области над гелевым слоем, нанесенным на рабочий электрод. Следовательно, область 47 сбора в конфигурации с гелевыми островками намного больше, чем область 46 сбора в конфигурации со сплошным гелем. Данный факт становится еще более очевидным, если визуально сравнить эти области сбора, показанные на фиг. 12a-12d. В конфигурации со сплошным гелем, показанной на фиг. 12а и 12с, сплошной гель 36 покрывает электроды в виде слоя. Электрическое поле, создаваемое в результате подачи напряжения, в этом случае действует прямо вверх от круглой электродной поверхности через гель 36 и образует виртуальный столб, в результате чего сбор на круглой поверхности 44 гелевого слоя происходит лишь на границе раздела гель/раствор. В отличие от этого, в конфигурации с гелевыми островками, показанной на фиг. 12b и 12d, область 47 сбора по существу окружает электрод и полусферу гелевого островка, и таким образом значительно увеличена площадь поверхности, на которую воздействует электрическое поле.

[0134] Таким образом, при тех же самых диаметрах электродов и расстояниях d и w между электродами, которые показаны на фиг. 10b, и при той же самой высоте 38 флюидного канала, электрофоретический чип согласно настоящему изобретению лишь благодаря геометрической форме геля обеспечивает возможность накопления вдвое большего количества испытуемого аналита, чем электрофоретические чипы, известные в настоящее время. Например, в конфигурации со сплошным гелем круглая поверхностная область 44, где происходит сбор, имеет площадь πr², где r - радиус электрода, в то время как в конфигурации с гелевым островком полусферическая поверхность 45, где происходит сбор, имеет площадь 2πr². Следовательно, область 45 в два раза больше, чем область 44, при одном и том же радиусе круглого электрода. Тот же самый результат получается при сравнении объемов. Это наглядно объясняет значительно большее накопление молекул аналита в конфгурации с гелевыми островками по сравнению с конфигурацией со сплошным гелем вследствие только их геометрической формы, при том, что все другие параметры остаются теми же самыми.

[0135] Применение нанометрических электродов, имеющих нанометрические гелевые островковые области, может быть полезным при управляемой или активируемой с помощью электрофореза самосборке наноэлементов. Кроме того, электрофоретический чип согласно настоящему изобретению с точечно нанесенными гелевыми островками обладает преимуществом над электрофоретическим устройством со сплошным гелем, благодаря вертикальному радиальному электрофоретическому перемещению молекул аналита и их нисходящему накоплению в множестве гелевых островков.

[0136] На фиг. 13а и 13b сравнивается вид сбоку известного в настоящее время электрофоретического устройства (фиг. 13а) с видом сбоку электрофоретического чипа согласно настоящему изобретению (фиг. 13b). Обе конфигурации имеют (отрицательный) противоэлектрод 13 и матрицу рабочих электродов 14, расположенных в одной плоскости. Все рабочие электроды имеют одинаковый диаметр 41. Известная конфигурация, имеющая сплошной гелевый слой на электродах, сравнивается с электрофоретическим чипом согласно настоящему изобретению, имеющим гелевые островки, размещенные на рабочих электродах, как показано на фиг. 13b. Предполагается, что высота 38 флюидного канала в обоих случаях одинакова, с тем, чтобы было возможно сравнение эффективности электрофоретического переноса и накопления молекул аналита. Над каждым рабочим электродом происходит перенос молекул 30 аналита (например, отрицательно заряженных молекул аналита) из объемного раствора 37 в направлении положительно заряженного рабочего электрода 14. Как описано выше, объем объемного раствора 37 над каждым рабочим электродом 14 может определяться диаметром или размерами рабочих электродов и высотой 38 флюидного канала.

[0137] Поскольку толщина 39 объемного гелевого слоя в конфигурации, показанной на фиг. 13а, может составлять значительную часть высоты 38 флюидного канала, объем области 46 сбора в этом случае может быть определен как математическое произведение следующих параметров:

толщины 42 объемного слоя 37 раствора над гелевым слоем 36,

ширины 40 флюидного канала, внутри которого создано эффективное электрическое поле вокруг электродов, и

диаметра 41 электрода в предположении, что электрод имеет круглую форму, или любого другого размера некруглого электрода.

[0138] В случае конфигурации на основе гелевых островков, показанной на фиг. 13b, объем области 47 сбора, из которой осуществляется сбор и накопление аналита на рабочем электроде 14, может быть определен как математическое произведение следующих парамтров:

высоты 38 флюидной камеры,

ширины 40 флюидного канала и

диаметра 41 электрода в предположении, что этот электрод имеет круглую форму, или любого другого размера некруглого электрода.

Объем гелевых островков (или полусферических столбиков), даже если он мал, должен быть затем вычтен из вышеуказанного вычисленного объема для получения фактического объема области 47 сбора, из которой осуществляется сбор и накопление аналита на рабочих электродах.

[0139] Таким образом, сравнение лишь геометрических форм показывает, что объем раствора аналита, из которого осуществляется накопление аналита на рабочих электродах, составляет больше в электрофоретическом чипе согласно настоящему изобретению. Тонкие флюидные каналы, имеющие высоту 38, сравнимую с высотой 43 столбиковых гелевых островков, обеспечивают возможность высокоэффективного сбора аналита на рабочем электроде 14. Это подтверждается тем известным фактом, что более сильное электрическое поле и более быстрый перенос молекул имеют место на более близком расстоянии от электродов (вблизи электродной поверхности или непосредственно между противоэлектродом 13 и рабочим электродом 14). Сбор молекул 30 аналита и их перенос происходят из объема испытуемого раствора 37 в направлении каждого рабочего электрода 14. Следовательно, сбор и перенос молекул 32 аналита (см. фиг. 13b), находящихся или вблизи электродов, или между ними, происходят с намного большими скоростями, чем в случае молекул 30 аналита, о которых пойдет речь ниже.

[0140] Вышеупомянутая известная из уровня техники конструкция электрофоретических плоских матричных чипов основана на очень тонком (примерно 5-10 мкм) сплошном гелевом слое. Существующая в уровне техники тенденция в конструировании состоит в еще большем утонении гелевого слоя для легкого удаления (смыва) неспецифично связанных молекул, включая флуоресцентные репортеры. Исходя из приведенного выше анализа, рекомендуемая толщина или высота флюидного канала для таких чипов должна составлять приблизительно 20-50 мкм. Однако такой крайне малый размер канала может привести к очень серьезным проблемам при переносе флюида через крайне малый флюидный канал, и могут потребоваться очень высокие давления для переноса раствора аналита через флюидное устройство. Такие высокие давления способны негативно повлиять на стабильность сплошного геля и потенциально выдавить его с чипа. В отличие от этого, точечно нанесенные гелевые островки в электрофоретическом чипе согласно настоящему изобретению имеют крайне малый объем, но являются более толстыми (имеющими толщину островков приблизительно 5-500 мкм, что больше диаметра электрода) по сравнению со сплошным гелем, и вследствие этого они выступают внутрь флюидного канала и эффективно захватывают в нем молекулы аналита.

[0141] Как отмечалось выше, перенос молекул аналита быстрее происходит через жидкость, чем через гелевую матрицу, где он замедляется под действием пор и зависит от их рамера в гелевой матрице. Хорошо известно, что чем больше молекула, тем медленнее происходит ее перенос через электрофоретическую гелевую матрицу. Как указывалось выше, в случае конфигурации со сплошным гелем сбор молекул аналита происходит лишь на круглой плоской поверхности 44 сплошного гелевого слоя над электродами. В предположении, что высота 38 флюидного канала является постоянной в обеих конфигурациях, показанных на фиг. 13а-13b, объем испытуемого раствора, из которого молекулы аналита вытягиваются и переносятся в направлении геля и рабочих электродов, составляет намного меньше, чем в случае конфигурации с гелевыми островками (сравните объемы 46 и 47 на фиг. 13а и 13b соответственно). При выборе очень малой высоты 38 флюидного канала, например высоты, равной удвоенному диаметру рабочего электрода 14, отношение объема 47 к объему 46 раствора, как пояснялось выше, ставится равным приблизительно 4:1. Это дополнительно показывает, что в конфигурации с гелевыми островками в электрофоретическом чипе согласно настоящему изобретению, объем испытуемого раствора, который адресуется в область над каждым электродом, может составлять по меньшей мере в четыре раза больше, чем в конфигурации со сплошным гелевым слоем. Разумеется, для непосредственного сравнения накопления молекул аналита на основе объема раствора, который адресуется в область над каждым электродом и из которого молекулы аналита вытягиваются в направлении каждого рабочего электрода, все геометрические формы и электрические параметры должны поддерживаться одинаковыми в обоих случаях.

[0142] На фиг. 13а-13b показано еще одно преимущество электрофоретического чипа, раскрытого в данном документе; оно относится к накоплению аналита из раствора. На фиг. 13а показаны силовые линии 31, а также с помощью стрелок показан перенос молекул 30 аналита в конфигурации со сплошным гелевым слоем согласно настоящему изобретению. Эти стрелки показывают эффективные перенос и накопление, происходящие, главным образом, вертикально вниз из области непосредственно над электродом и его сплошной гелевой матрицей 36. Как указывалось выше, длина стрелок 31, представляющих электрическое поле, показывает локальные скорости переноса молекул аналита. В сплошном геле эти стрелки становятся намного короче, показывая замедление переноса молекул 30 аналита. В частности, эти стрелки 31 становятся очень короткими непосредственно между противоэлектродом 13 и рабочим электродом 14 в конфигурации со сплошным гелем, показанной на фиг.13а, что указывает на неэффективный перенос или даже на его отсутствие. В таких случаях, если расстояние переноса является очень коротким, самое сильное электрическое поле определяется лишь расстоянием между электродами. В результате горизонтальный и нисходящий перенос с боковой стороны электрода будет невозможен ввиду отсутствия раствора в области, которая покрыта гелем.

[0143] В отличие от этого, в конфигурации с гелевыми островками, показанной на фиг. 13b, перенос молекул аналита из указанной области, т.е. с боковых сторон рабочих электродов, в окрестность электродной плоскости будет намного более быстрым вследствие более сильного электрического поля вокруг. Накопление из данной области является намного более быстрым и более эффективным, чем из области раствора, находящейся по вертикали над электродом или гелевой матрицей. Фактически, молекулы аналита вытягиваются из объема раствора над данной областью и быстро восполняются, поскольку фактический перенос происходит лишь через жидкость. Поэтому гелевая островковая матрица 34 точечно нанесена таким образом, что диаметр островка составляет лишь ненамного больше, чем диаметр электрода. Он может быть больше, чем диаметр электрода, на величину, находящуюся в диапазоне 10%-30%. Толщина точечно нанесенного полусферического гелевого островка должна на величину до 2-3 раз превышать диаметр электрода. Следовательно, толщина гелевого островка с боковой стороны электрода составляет приблизительно в 2-3 раза меньше, чем над электродом, и вследствие этого электрическое поле, действующее с боковой стороны электрода, является намного более сильным. В отличие от этого, в конфигурации со сплошным гелевым слоем накопление с верхней стороны (над электродами) происходит, начиная с расстояния, которое равно толщине геля; тем не менее, электрическое поле на этом расстоянии ставится относительно слабым, и перенос значительно уменьшается.

[0144] В некоторых вариантах осуществления молекулы аналита над электродной структурой и над гелевыми островками в электрофоретическом чипе согласно настоящему изобретению могут быть обнаружены с использованием флуоресцентных методов. Флуоресцентное обнаружение может быть осуществлено вертикально из области над чипом, причем накопленные молекулы аналита визуализируются с использованием флуоресцентно помеченного репортера, который присоединяется к захваченным молекулам аналита. Хорошо известно, что флуоресцентное обнаружение объединяет все сигналы в гелевой матрице. Поскольку накопление аналита с использованием электрофоретического чипа согласно настоящему изобретению происходит на большей площади поверхности, представляющей собой полусферическую поверхность, но приблизительно при таком же радиусе электродов, что и в конфигурации со сплошным гелевым слоем, флуоресцентный сигнал от электрофоретического чипа согласно настоящему изобретению является значительно более интенсивным, чем от сплошного геля. Таким образом, обеспечивается возможность улучшения измеряемой флуоресценции от электрофоретического чипа, раскрытого в данном документе, благодаря нижеследующему:

1) Большей площади поверхности гелевых островков по сравнению с конфигурацией со сплошным гелевым слоем;

2) Большему объему раствора аналита, который адресуется в область над каждым рабочим электродом и из которого этот аналит притягивается в направлении рабочего электрода; и

3) Более сильным электрическим полям и более эффективному переносу молекул аналита в островковых гелевых областях, в частности, с боковой стороны в окрестность электродной плоскости, окруженную самым сильным электрическим полем.

[0145] Гелевые островки могут быть точечно нанесены вручную или с помощью роботизированного устройства точечного нанесения, например путем точечного нанесения с помощью контактного штыря или точечного нанесения с помощью распылителя, либо любого другого способа нанесения гелей и/или матриц с объемами в диапазоне приблизительно 10-200 нл. В еще одном варианте осуществления гелевые островки могут быть выполнены в форме высоких цилиндров, которые выступают внутрь испытуемого раствора аналита и высота которых приближается к высоте 38 флюидного канала, что повышает эффективность накопления. Гелевая матрица, имеющая цилиндрическую форму или сходную геометрическую форму, улучшающую сбор аналитов, может быть получена с помощью способов микроформования. Толщина флюидного канала в этом варианте осуществления не должна превышать 5 × d (пятикратного расстояния между электродами или от них).

[0146] В еще одном варианте осуществления множество подложек с множеством электродных матриц, напечатанных на разных подложках, могут образовывать двухсторонние электрофоретические электродные матрицы или множественные камеры с наложенными в вертикальном направлении электродными структурами, возможно соединенными через флюидные каналы для электрофоретического накопления или сепарации разных целевых аналитов в соответствующих разных камерах или флюидных ячейках. В конкретном варианте осуществления два взаимно противолежащих электрофоретических чипа, имеющих гелевые островки, выступающие внутрь испытуемого раствора, могут быть объединены в электрофоретическое устройство с сэндвич-структурой для улучшения переноса, сбора и накопления аналита на обоих этих электрофоретических чипах. Обнаружение молекул аналита на обоих чипах может осуществляться электрохимическим или спектроскопическом способом.

[0147] В еще одном варианте осуществления электрофоретический чип согласно настоящему изобретению может содержать высокие трехмерные электроды, имеющие цилиндрическую форму, напечатанные на подложке с помощью углеродных паст и выступающие внутрь испытуемого раствора. В этом случае гелевые островки могут покрывать поверхность трехмерных электродов, повторяя их форму. Преимущество такой конфигурации состоит в том, что гелевые островки однородно распределены по каждому электроду и обеспечивают возможность высокоэффективного сбора на всей электродной поверхности. Эта конфигурация обеспечивает возможность дополнительного улучшения распределения электрического поля на всем протяжении флюидных каналов и, как следствие, возможность улучшения накопления молекул аналита из испытуемого раствора путем регулирования формы и размера трехмерных электродов.

[0148] Электрофоретический чип согласно настоящему изобретению может использоваться в сочетании с пост-аналитическими способами для обнаружения аналитов, накопленных на электродах электрофоретической электродной матрицы. Эти постаналитические способы могут представлять собой спектроскопические способы, например различные флуоресцентные способы, способы, основанные на рамановском рассеянии, или способы, основанные на поверхностном плазмонном резонансе, для обнаружения сигналов, специфических для конкретного целевого аналита. Тем не менее, другие постаналитические методы, включая электрохимическое обнаружение, также могут применяться в сочетании со способом согласно настоящему изобретению.

ПРИМЕРЫ ПРАКТИЧЕСКОГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Пример 1. Контроль и повышение электрического поля на электродных матрицах со слоями углеродной пасты с разным удельным сопротивлением

[0149] Проводящий слой 23, слой 24 углеродной пасты и резисторный слой 25 с разной поверхностной удельной проводимостью были нанесены с такой геометрической формой и размерами, которые показаны на фиг. 2 и 6. Низкосолевой буферный электролит, используемый для электрофоретического накопления и адресации аналитов, например ДНК, на электродной матрице и содержащий 50 ммоль гистидина, был нанесен в каждом отдельном эксперименте на четыре рабочих электрода и противоэлектрод между ними, так что геометрическая форма покрывающей жидкости относительно электродов сохранялась постоянной в каждом эксперименте. Был подан постоянный ток 0,5 мА с помощью источника постоянного тока на электродные контакты для определения напряжения, которое было необходимо для прохождения этого тока через слоистые структуры из углеродных паст и обусловлено удельным сопротивлением электродов, зависящим от используемых материалов, их состава и сопротивлений или перенапряжений, на поверхности раздела электрод-электролит. Поскольку электродные реакции на поверхности были одинаковыми во всех экспериментах, указанное напряжение определялось, главным образом, составом и структурой электродов. Основными пастами, использовавшимися в данном примере, были пасты, приобретенные у компаний DuPont (США), Henkel (США) и CMI (Creative Materials Inc., США).

Таблица 1. Контроль электрического поля в электрофоретическом процессе на электродной матрице с использованием слоев углеродной пасты и их смесей в качестве электродных материалов

[0150] В Таблице 1 наглядно показаны результаты контроля электрического поля для разных составов и/или слоев электродных структур на углеродных пастах. При сохранении постоянного тока через раствор над электродной матрицей, одинаковой геометрической форме электродов и одном и том же добавляемом электролите напряжение, необходимое для возбуждения указанного тока, повысилось приблизительно в пять раз. Следовательно, электрическое поле, определяемое путем деления приложенного напряжения на расстояние между электродами, также повысится в пять раз. Никакой металлический электрод не смог бы создать столь сильное поле, и наши эксперименты показали, что когда в сходной геометрической конфигурации использовался платиновый электрод, напряжение между рабочим электродом и противоэлектродом при одном и том же электролите составило приблизительно 2,6 В. Таким образом, похоже, что гидролиз воды является преобладающей реакцией. Однако на углеродных электродах он дополнительно подавляется. Следовательно, основное различие между осуществлением электрофоретического процесса с помощью электрофоретического чипа согласно настоящему изобретению и с помощью обычных электрофоретических устройств, использующих платиновые электроды, состоит том, что электрофоретический процесс в электрофоретическом устройстве мгновенного действия управляется и осуществляется при значительно (в пять раз) более высоком электрическом поле по сравнению со случаем, когда применяются металлические электроды.

[0151] Как отмечалось выше, общая величина переноса заряженных частиц в растворе, применительно к переносу ионов и заряженного аналита, соответствует общему току, проходящему через раствор. Однако ионы, имея малый диметр, являются более легкими и быстрыми, чем большие молекулы, и, следовательно, они вносят значительно больший вклад в общий ток, чем перенос аналита. При условии повышенного подаваемого напряжения перенос больших молекул ускоряется, и эти молекулы будут быстрее перемещаться не только через гелевую матрицу, которая значительно тормозит их перенос, но также и через раствор. Как раскрыто в настоящей заявке, молекулы могут накапливаться в гидрогелевых островках, точечно нанесенных на каждый рабочий электрод. Следовательно, улучшается перенос как через раствор, так и через гели.

[0152] Напряжение и/или электрическое поле могут варьироваться либо путем комбинирования свойств пасты, таких как состав пасты, ее геометрическая форма и расположение в электродной матричной структуре, либо путем объединения паст с разной удельной проводимостью в одном составе, например объединения углеродных паст DuPont 7082 с пастами DuPont 5028 на основе серебра и диэлектрическими пастами DuPont 3571. Кроме того, это может быть осуществлено путем изготовления некоторых заказных смесей с точно определенным поверхностным удельным сопротивлением и получения требуемых и контролируемых значений электрического поля. Пример 2. Изготовление электродных матриц с контролируемыми резистивными структурами

[0153] Были изготовлены электродные матрицы в соответствии с конструкциями, показанными на фиг. 2 и 6. В частности, был напечатан резисторный слой 25 с использованием модифицированных паст таким образом, чтобы каждый электрод имел повышенное сопротивление по сравнению с другими вариантами. Для успешного изготовления устройства критичным является обеспечение того, чтобы резистивные свойства каждого электрода были воспрозводимыми, и того, чтобы данный способ обеспечивал воспроизводимый и потенциально поддающийся количественной оценке перенос и накопление аналитов на электродной матрице. С этой целью было измерено сопротивление в сухом состоянии после изготовления электродной матрицы.

[0154] На фиг. 14 показаны результаты изготовления наслоенных электродов из углеродной пасты и электрофоретического чипа согласно настоящему изобретению с точки зрения однородности резисторного слоя 25, который показывает воспроизводимые значения сопротивления для каждого электрода в структуре. Были изготовлены и испытаны три слоистых структуры из углеродной пасты с одинаковой геометрической формой, как показано на фиг. 2 и 6. Было измерено сопротивление с помощью промышленного универсального измерительного прибора, такого как Fluke 87; с этой целью в начале электродных дорожек были выполнены контакты и осуществлялось касание прибором электродной поверхности из углеродной пасты.

[0155] Электродные матрицы, имеющие сопротивление 5 Ом и 500 Ом, имели составы электродной пасты, сходные с теми, которые показаны в Таблице 1 для Экспериментов 1 и 2. Электродная матрица, имеющая сопротивление 1500 Ом, была сходна по конструкции с той, которая использовалась в Эксперименте 3, показанном в Таблице 1, однако используемая паста была модифицирована таким образом, чтобы она показывала поверхностное сопротивление приблизительно 100000 Ом/мм². Следует отметить, что измеренное поверхностное сопротивление не соответствует поверхностному удельному сопротивлению резисторного слоя 25 по той простой причине, что значение поверхностного сопротивления, как и в металлических проводниках, определяется геометрическими параметрами, т.е. площадью поверхности (ширина × длина) и толщиной слоя. Ток, протекающий во время измерений, представляет собой постоянный ток. Эксперимент показывает однородное распределение тока по всему проводящему слою 23.

[0156] Данный эксперимент был нацелен на изготовление электрофоретических электродов согласно настоящему изобретению, которые показывали бы сопротивление 5 Ом, 500 Ом и 1500 Ом вдоль наслоенной пастовой дорожки рабочего электрода. На фиг. 14 показаны данные, полученные с использованием этих трех конфигураций. Стандартная ошибка измерения сопротивления для 50 протестированных электродов на каждой электродной матрице составила 7,9%, 4,4% и 12,1% соответственно для резистивных паст с сопротивлением 5 Ом, 500 Ом и 1500 Ом, расположенных в электродной структуре чипа, изготовленной методом трафаретной печати, вблизи каждого рабочего электрода. Полученные результаты показывают хорошую воспроизводимость результатов измерения для протестированных чипов согласно настоящему изобретению, изготовленных методом трафаретной печати.

Пример 3. Испытание оптических свойств электрофоретических чипов на основе печатной углеродной пасты

[0157] Электрофоретический чип согласно настоящему изобретению может использовать оптическое обнаружение и идентификацию аналитов. В данном примере гелевые островки на основе полиакриламида точечно нанесены с помощью роботизированного устройства точечного нанесения на каждый электрод для улучшения захвата, накопления и флуоресцентного сигнала на электродной матрице, измеряемых после электрофореза.

[0158] Следовательно, печатные пасты (и все компоненты электрофоретического чипа, включая подложки), предпочтительно и желательно должны быть изготовлены в черном цвете (что не всегда возможно) для минимизации фоновой флуоресценции. В частности, компоненты электродной структуры согласно настоящему изобретению, основанные на диэлектрических пастах, имеют тенденцию к более интенсивной автофлуоресценции, чем черные пасты на основе углерода.

[0159] На фиг. 15 приведены обобщенные данные по автофлуоресценции примеров печатных материалов для чипа, включая диэлектрические пасты, углеродные пасты, серебряные пасты и подложки, используемые при изготовлении электродного чипа методом трафаретной печати согласно настоящему изобретению. Эти данные были получены с помощью портативного устройства записи флуоресценции внутри системы обнаружения ДНК для молекулярной диагностики, содержащей фильтры для камеры и для красной светодиодной подсветки. Обнаруживалась и измерялась красная флуоресцентная эмиссия.

[0160] Данные на фиг. 15 показывают пример подложки, которая показала крайне интенсивную автофлуоресценцию с интенсивностью эмиссии приблизительно в восемь раз выше, чем в любой из паст. Также приведены в качестве примеров данные по широкому спектру материалов, включая диэлектрические пасты, углеродные пасты и проводящие серебряные пасты, которые были изготовлены и показали довольно удовлетворительный низкий флуоресцентный фон (за исключением вышеуказанной подложки РЕ 7373 из сложного полиэфира).

Пример 4. Электрофоретическое накопление молекул ДНК и флуоресцентное обнаружение специфической последовательности ДНК на электродной матрице

[0161] Молекулы аналита, например большие заряженные биомолекулы, такие как последовательности ДНК и РНК, или протеины могут накапливаться на электродной матрице и обнаруживаться с помощью зондовых олигонуклеотидов специфического захвата, встроенных внутрь гелевых островков, точечно нанесенных на верхнюю поверхность каждого электрода электродной матрицы согласно настоящему изобретению. 35-bp биотинилированный захватный зонд был разработан как комплементарный к 5-bp ДНК-мишени. Флуоресцентно меченный красный репортер Су5 имел последовательность, комплементарную к мишени, так что была обеспечена возможность обнаружения мишени, при ее специфическом захвате на матрице гелевых островков, с помощью флуоресцентной спектроскопии. Также были изготовлены некомплементарные захватные зонды, и они адресовались участкам, предназначенным лишь для контроля специфичности связывания мишени со специфическими зондами.

[0162] Данный эксперимент осуществлялся с использованием изготовленного методом трафаретной печати электродного матричного чипа, конструкция и состав которого описаны применительно к Эксперименту 2 в Таблице 1 (другие конфигурации показали похожие положительные результаты). На каждый электрод был точечно нанесен (бис)акриламидный гидрогель в количестве 30 нл и производилась сушка при УФ-освещении в течение 10 секунд. Электродная матрица была промыта 50 ммоль гистидином, высушена и использовалась в эксперименте. Биотинилированные захватные зонды (при концентрации 1 мкмоль) были нанесены в количестве приблизительно 100-200 нл на каждый гелевый островок, и дополнительно осуществлялось осаждение за счет диффузии внутри гидрогеля в течение 15 минут. Был собран электрофоретический чип согласно настоящему изобретению, после чего внутрь флюидной ячейки устройства был введен раствор ДНК-мишени (приблизительно 200 мкл). В этом эксперименте диапазон концентрации ДНК-мишени составлял 0,1-100 нмоль.

[0163] Адресация целевого аналита производилась при постоянном токе 0,8 мА в течение 2 минут. Неспецифично связанные молекулы мишени были смыты путем трех промывок в низкосолевом буферном фосфате (50 ммоль буферный фосфат, рН 7). Затем электродная матрица была освещена в течение 2 секунд (время экспозиции) с помощью красных светодиодов с установленными на них узкополосными красными фильтрами, после чего осуществлялось обнаружение с помощью камеры, имеющей узкополосный эмиссионный фильтр, соответствующий эмиссии из флуоресцентного красителя Су5. Полученные данные об интенсивности флуоресценции были проанализированы с помощью программного обеспечения Image J.

[0164] На фиг. 16 показаны статистика и полученные количественные флуоресцентные данные относительно электрофоретического накопления последовательности ДНК-мишени 55-bp, обнаружения этой последовательности с помощью специфических комплементарных зондов, встроенных внутрь гидрогеля, покрывающего электроды электродной матрицы, и флуоресцентные изображения для каждого электродного пятна. Статистическая оценка полученных данных показывает стандартную ошибку приблизительно 15% по интенсивности флуоресценции, что считается очень хорошим статистическим показателем при измерении интенсивности флуоресценции. Таким образом, изготовление слоистых пастовых структур для электродных матриц, резисторных паст и электрофоретических чипов в целом, а также анализ характеристик чипа согласно настоящему изобретению выглядят в высокой степени воспроизводимыми.

Пример 5. Накопление молекул ДНК на электрофоретическом чипе и специфическое обнаружение вируса MS2

[0165] Были созданы специфические узнаваемые ДНК-последовательности внутри законсервированных областей вируса MS2. Был осуществлен анализ, состоящий из ДНК-транскрипции внутрь С-ДНК MS2 путем амплификации MS2-мишени с помощью полимеразной цепной реакции (ПНР). Были созданы захватные зонды, специфические для ДНК-мишени MS2. Испытание подтвердило воспроизводимость процесса изготовления электрофоретического чипа согласно настоящему изобретению.

[0166] На фиг. 17 показаны флуоресцентные данные относительно электрофоретического накопления и обнаружения ПЦР-амплифицированной ДНК-мишени вируса MS2 на электрофоретическом чипе, раскрытом в данном документе. Статистические данные относительно интенсивности флуоресценции (в виде меток отношения специфические/неспецифические), полученные для специфического обнаружения (синие столбики), т.е. для мишени, захваченной на специфических зондах, в сравнении с неспецифическими зондами (красные), показаны для нескольких анализов (каждый из которых был повторен на новом чипе, изготовленном в соответствии с той же самой процедурой). Стандартная ошибка, полученная при флуоресцентных измерениях в 50 точках для каждого чипа и для серии чипов, составила приблизительно 10%, что наглядно демонстрирует превосходную воспроизводимость изготовления и работы электрофоретического чипа согласно настоящему изобретению при диагностике in vitro.

Пример 6. Накопление и обнаружение различных последовательностей ДНК

[0167] Эксперименты в данном примере были проведены с использованием конструкции и состава электродного матричного чипа, описанных применительно к Эксперименту 2 в Таблице 1 (другие конфигурации показали похожие положительные результаты). На фиг. 18а и 18b показаны примеры результатов анализов накопления и обнаружения специфической ДНК-последовательности, успешно разработанных и испытанных на электрофоретическом чипе согласно настоящему изобретению. На фиг. 18а показаны результаты анализа обнаружения и узнавания Lishmania major в сравнении с другими подвидами лейшмании, часто обнаруживаемыми у нескольких видов москитов. На фиг. 18b показаны результаты идентификация специфической ДНК Legionella pneumoniae как часть результатов тройного анализа на домашнюю пневмонию.

[0168] Хотя некоторые признаки настоящего изобретения были проиллюстрированы и описаны в данном документе, специалистам с обычной квалификацией в данной области техники будут очевидны многие модификации, замены, изменения и эквиваленты. Следовательно, необходимо понимать, что приложенная формула изобретения предназначена для охвата всех таких модификаций и изменений, если они находятся в рамках подлинной идеи настоящего изобретения.

Группа изобретений в целом относится к области биотехнологии, в частности к оборудованию, используемому в данной области, а именно к электрофоретическим чипам и способу их использования, а конкретно к электрофоретическим чипам, содержащим углеродные матричные электроды, и к способу электрофоретического накопления, сепарации и/или обнаружения аналитов. Электрофоретический чип содержит: (а) непроводящую подложку, выполненную с возможностью поддержки элементов электрофоретического чипа; (b) электродную структуру для проведения электрического тока через электрофоретический чип, напечатанную на непроводящей подложке и содержащую противоэлектрод и по меньшей мере один рабочий электрод. Каждый электрод содержит слой проводящей низкоомной пасты, напечатанный на непроводящей подложке, и слой углеродной пасты, напечатанный на верхней поверхности слоя проводящей низкоомной пасты с обеспечением его полного или частичного покрытия; (с) изоляционный слой диэлектрической пасты, размещенный на верхней поверхности электродной структуры с обеспечением ее покрытия. Причем изоляционный слой диэлектрической пасты имеет по меньшей мере одно отверстие над противоэлектродом и по меньшей мере одно отверстие над указанным по меньшей мере одним рабочим электродом для обеспечения образования по меньшей мере одного адресного участка; и (d) гелевую матрицу захвата молекул, расположенную на указанном по меньшей мере одном адресном участке с возможностью его покрытия для обеспечения создания по меньшей мере одной гелевой островковой области. Группа изобретений обеспечивает достижение технического результата, заключающегося в повышении эффективности удобства проведения элетрофоретических процессов при одновременном сокращении матзатрат. 2 н. и 11 з.п. ф-лы, 34 ил., 1 табл.

1. Электрофоретический чип, содержащий:

(а) непроводящую подложку, выполненную с возможностью поддержки элементов электрофоретического чипа;

(b) электродную структуру для проведения электрического тока через электрофоретический чип, напечатанную на непроводящей подложке и содержащую противоэлектрод и по меньшей мере один рабочий электрод, причем каждый электрод содержит:

(1) слой проводящей низкоомной пасты, напечатанный на непроводящей подложке; и

(2) слой углеродной пасты, напечатанный на верхней поверхности слоя проводящей низкоомной пасты;

(с) изоляционный слой диэлектрической пасты, размещенный на верхней поверхности электродной структуры с обеспечением ее покрытия, причем изоляционный слой диэлектрической пасты имеет по меньшей мере одно отверстие над противоэлектродом и по меньшей мере одно отверстие над указанным по меньшей мере одним рабочим электродом, что обеспечивает образование по меньшей мере одного адресного участка; и

(d) гелевую матрицу захвата молекул, точечно нанесенную на указанный по меньшей мере один адресный участок с обеспечением его покрытия, что обеспечивает создание по меньшей мере одной гелевой островковой области.

2. Электрофоретический чип по п. 1, в котором все указанные адресные участки при подаче напряжения на электрофоретический чип принимают приблизительно равные и однородные электрические токи.

3. Электрофоретический чип по любому из пп. 1, 2, в котором гелевая матрица образует по меньшей мере две гелевые островковые области, выполненные таким образом, что смежные гелевые островковые области не находятся в контакте непосредственно друг с другом.

4. Электрофоретический чип по любому из пп. 1-3, в котором гелевая матрица способна захватывать или накапливать молекулы на указанных адресных участках.

5. Электрофоретический чип по любому из пп. 1-4, в котором указанный по меньшей мере один гелевый островковый участок при подаче напряжения на электрофоретический чип способен содействовать электрофоретическому переносу молекул.

6. Электрофоретический чип по п. 4 или 5, в котором гелевая матрица содержит пористую полимерную структуру, пленкообразующую решетку, протеиновую смесь, например фотоформуемую протеиновую смесь, полупроницаемую твердую пленку или газопроницаемую мембрану, функционализируемую химическими функциональными группами, способными образовывать соединительный слой.

7. Электрофоретический чип по п. 6, в котором гелевая матрица также содержит по меньшей мере один соединительный слой для присоединения захватных молекул, способных связываться с молекулами мишени.

8. Электрофоретический чип по любому из пп. 1-6, также содержащий захватные молекулы, присоединенные к гелевой матрице или встроенные внутрь неё, либо присоединенные к слою углеродной пасты на указанном по меньшей мере одном рабочем электроде на адресном участке, причем захватные молекулы способны связываться с молекулами мишени.

9. Электрофоретический чип по п. 7, в котором соединительный слой содержит функциональные группы или химические компоненты для связывания непосредственно с молекулами мишени или для связывания с указанными захватными молекулами.

10. Электрофоретический чип по любому из пп. 1-9, также содержащий нагревательный слой пасты с высокой проводимостью, напечатанный на нижней поверхности непроводящей подложки.

11. Электрофоретический чип по любому из пп. 1-10, также содержащий нагревательный слой пасты с высокой проводимостью, напечатанный на верхней поверхности непроводящей подложки и не находящийся в контакте с электродной структурой.

12. Электрофоретический чип по любому из пп. 1-11, также содержащий толстый изоляционный слой диэлектрика или присоединенную перфорированную подложку, размещенную на верхней поверхности электрофоретического чипа, и крышку для покрытия указанного диэлектрика или присоединенной перфорированной подложки, причем указанный диэлектрик или присоединенная перфорированная подложка содержит функциональную флюидную камеру или канал.

13. Способ электрофоретического накопления и обнаружения по меньшей мере одного аналита в растворе, включающий этапы, согласно которым:

(i) наносят раствор на электрофоретический чип по любому из пп. 1-12;

(ii) подают напряжение на электрофоретический чип, в результате чего происходит накопление молекул указанного по меньшей мере одного аналита на указанном по меньшей мере одном адресном участке;

(iii) удаляют свободные или несвязанные молекулы указанного по меньшей мере одного аналита из раствора; и

(iv) обнаруживают присутствие накопленных молекул указанного по меньшей мере одного аналита на указанном по меньшей мере одном адресном участке.