ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ MUS MUSCULUS L., ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К ГЛИКОПРОТЕИНОВОМУ АНТИГЕНУ 70 КДА МОНОНУКЛЕАРОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА Российский патент 1994 года по МПК C12N5/00 C12P21/08 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для разработки иммунодиагностикумов и экспериментальных исследований.

Известны штаммы гибридных клеток, продуцирующие моноклональные антитела (МКА) к лимфоцитам крупного рогатого скота. Штаммы получены в результате иммунизации мышей мононуклеарными клетками из периферической крови больной лейкозом коровы. Предложенный штамм получают путем иммунизации мышей мононуклеарными клетками, выделенными из периферической крови здоровой коровы. Кроме того, не установлена антигенная специфичность известных антител.

Технический результат изобретения заключается в получении штамма гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L., продуцирующего моноклональные антитела к гликопротеину 70 кДа мононуклеаров периферической крови крупного рогатого скота (КРС).

Штамм получают следующим образом.

Клетки мышиной миеломы NSO гибридизуют с клетками селезенки мышей линии Balb/c, иммунизированной мононуклеарами периферической крови КРС. Используют следующую схему иммунизации: 1 х 10⁷ мононуклеарных клеток/мышь внутривенно (в/в) 3 раза с интервалом 14 дн. После третьей иммунизации определяют титр антител в сыворотке крови мышей и проводят бустирование тем же путем и той же дозой антигена. Через 4 дн мышь забивают, извлекают селезенку и осуществляют гибридизацию клеток миеломы и спленоцитов иммуной мыши в присутствии полиэтиленгликоля (М = 4000). Селекцию гибридных клеток проводят с помощью специальной среды, содержащей гипоксатин, аминоптерин, тимедин (ГАТ).

В результате тестирования полученных гибридных клонов по признаку продукции антител к гликопротеинам мононуклеаров периферической крови КРС и последующего их реклонирования отбирают штамм, продуцирующий МКА необходимой специфичности.

Полученный штамм характеризуется следующими признаками.

Культуральные свойства.

Средой для культивирования штамма служит среда Игла в модификации Дульбекко (ДМЕМ) с добавлением 15% эмбриональной телячьей сыворотки, 4 мм L-глутамина, 80 ЕД/мл гентамицина.

Культивирование проводят при 37^оС в термостате с 5% углекислоты, в атмосфере 95% -ной влажности или в герметических флаконах в термостате без подачи СО₂.

Для выращивания штамма используют культуральные флаконы. Во флакон 25 кв. см в 5 мл среды засевают 1 х 10⁶ клеток. Пассаж 1 раз в 2-3 дня с переносом 1/3 клеток без их подсчета.

Для выращивания асцита используют мышей линии Balb/c. За 2 недели до инъекции штамма мышам вводят внутрибрюшинно (в/б) по 0,5 мл вазелинового масла. Клетки штамма инъецируют в/б (1-2 х 10⁶ клеток/мышь). Асцит собирают через 8-12 дн по 3-7 мл от каждой мыши.

Характеристика полезного продукта.

Штамм продуцирует МКА, относящиеся к IgM. Они связывают поверхностный гликопротеин мононуклеаров периферической крови КРС. Мол. масса антигена 70 кДа. МКА образуются in vitro на седьмой день культивирования. Стабильная продукция антител сохраняется в течение 10 пассажей.

Контроль контаминации.

Бактерии, грибы и микоплазмы не обнаружены при длительном наблюдении и посевах на питательные среды.

Способ криоконсервации.

Клетки штамма ресуспендируют в среде ДМЕМ, содержащей 50% фетальной сыворотки, 10% диметилсульфоксида и в концентрации 3 х 10⁶ клеток в 1 мл помещают в 1 мл ампулы при 4^оС. Затем ампулы замораживают по программе: снижение температуры на 1^оС/мин до -40^оС и на 10^оС/ мин до -196^оС. Размораживание клеток: 1 мин при 37^оС. Клетки разводят в 10 мл полной среды, осаждают центрифугированием, ресуспендируют в 5 мл той же среды с 10% эмбриональной телячьей сыворотки и переносят в культуральный флакон. Жизнеспособность клеток по включению трипанового синего составляет 68%.

П р и м е р 1. Кровь из яремной вены КРС отбирают в пробирки с антикоагулянтом (25-50 Ед/мл гепарина), разбавляют в 2 раза забуференным физиологическим раствором (ЗФР) и наслаивают на градиент верографинфиколла (d = 1,007). Центрифугируют 45 мин при 2000 об/мин.

Мононуклеарные клетки снимают с градиента, отмывают в ЗФР. Единичные эритроциты (если они есть) удаляют с помощью 0,83%-ного хлористого аммония в соотношении 1: 3. Осадок мононуклеарных клеток отмывают в ЗФР (2000 об/мин, 7 мин). Гликопротеины выделяют в результате лизиса мононуклеарных клеток детергентом с последующей очисткой путем эффинной хроматографии. С этой целью 1 х 10⁸ мононуклеарных клеток лизируют 0,5%-ным детергентом NP-40 в 10 мМ трис-HCl (pH = 8,0) в течение 30 мин при 4^оС. Лизат центрифугируют при 12000 об/мин 30 мин, затем определяют содержание белка в супернатанте при спектрофотометре при λ= 280 нм.

Объем раствора, содержащий 30 мг белка, наносят на 5 мл колонку с конканавалин А-сефарозой. Колонку тщательно промывают 0,1 М фосфатным буфером (pH = 7,4) с 0,2% дезоксихолатом натрия, затем гликопротеины элюируют 0,1 М метилманнопиранозидом, белок из элюата осаждают этанолом, высушивают и растворяют в 0,1 М фосфатном буфере в концентрации 0,5 мг/мл.

Аффинно очищенные гликопротеины из периферической крови КРС используют в концентрации 5 мгк/мл.

Для получения МКА клетки штамма прививают сингенным мышам линии Balb/c. Каждой из 10 мышей предварительно вводят внутрибрюшинно по 0,5 мл вазелинового масла. Через 14 дн животным вводят в/б по 1-2 х 10⁶ клеток/мышь.

Через 8-12 дн из брюшной полости мышей извлекают асцитную жидкость, по 3-7 мл от каждой мыши. Клетки отделяют центрифугированием (2000 об/мин 10 мин), а надосадочную жидкость используют как источник МКА.

После электрофореза гликопротеинов из мононуклеаров периферической крови КРС проводят перенос белка на нитроцеллюлозу при токе 500 мА в камере для электроблоттинга в электродном буфере, содержащем 25 мМ трис, 192 мМ глицин, 20% ментанол (pH = 8,3) в течение 3 ч. Оставшиеся свободными места на нитроцеллюлозе блокируют в течение 2 ч раствором, содержащим 0,5 М NaCl, 10 мМ трис-HCl (pH = 7,5) (TBS) и 1%-ный желатин. После электропереноса проводят иммунологическое выявление белков на нитроцеллюлозе. Нитроцеллюлозу и асцитную жидкость, содержащую МКА в разведении 1:100, переносят в TBS с 0,2% Твин-20 в течение 4 ч. Связавшиеся МКА визуализируют с помощью кроличьих антител к иммуноглобулинам мыши, конъюгированных с пероксидазой хрена. Для цветного выявления пероксидазной реакции используют диаминобензидин. Результаты исследований показали, что исследуемые МКА связываются с материалом из мононуклеаров периферической крови КРС в зоне 70 кДа.

П р и м е р 2. Поверхностную локализацию антигенов, специфичных для полученных антител, определяют с помощью комплементзависимого лимфоцитотоксического теста (ЦТТ). Он заключается в следующем.

В лунки микрокамер Терасаки под слой вазелинового масла вносят по 1 мкл исследуемых антител, затем по 1 мкл взвеси лимфоцитов периферической крови КРС (2 х 10⁶ кл/мл). Камеры инкубируют 0,5 ч при комнатной температуре. Затем в лунки вносят по 2 мкл кроличьего комплемента. Камеры инкубируют 1 ч при комнатной температуре. Затем в лунки вносят по 2 мкл 0,25%-ного трипанового синего. Реакцию учитывают через 4-5 мин под микроскопом. Интенсивность реакции выражают в крестах по четырехбалльной системе: 1+ (1-25%) мертвых клеток, 2+ (26-50%) мертвых клеток, 3+ (51-75%) мертвых клеток, 4+ (76-100%) мертвых клеток.

Исследуемые МКА слабо реагируют в ЦТТ с лимфоцитами периферической крови КРС (1+). Они связывают 5-25% лимфоцитов крови КРС. Таким образом, предложенные МКА могут быть использованы для выявления и исследования мембраносвязанных антигенов мононуклеаров периферической крови КРС.

Использование: биотехнология, разработка иммунодиагностикумов и экспериментальные исследования. Сущность изобретения: получение штамма гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L., продуцирующего моноклональные антитела (МКА) к гликопротеиновому антигену мононуклеаров периферической крови крупного рогатого скота. Молекулярная масса антигена составляет 70 кДа. Штамм получают гибридизацией спленоцитов мышей линии Ba l в/с с клетками миеломы NSO. МКА относятся к IgM. Стабильная продукция антител сохраняется in vitro в течение 10 пассажей. МКА могут использоваться для выявления и изучения мембраносвязанных антигенов мононуклеаров периферической крови КРС.

Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L. ВСКК(П) N 554Д, используемый для получения моноклональных антител к гликопротеиновому антигену 70 кДа мононуклеаров периферической крови крупного рогатого скота.