Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS L - продуцент моноклональных антител к М - белку вируса гриппа типа А Советский патент 1991 года по МПК C12N5/18 C12P21/08 A61K39/395 

Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано для разработки диагностических тест-систем.

Цель изобретения - получение штамма гибридных клеток, продуцирующих типо- специфические моноклональные антитела (Мон-AT) в антигенной детерминанте М-белка вируса гриппа типа А, общей для разных подтипов

Штамм получают следующим образом

В качестве антигена используют субвирусные частицы, получаемые после электро- форетическогоудаления

солюбилизированных с помощью детергента дезинтегрона-0 гликопротеинов вируса гриппа типа А (Ленинград) 385/80 R1 (H3N2) (производство Омутнинского химзавода) Непосредственно после получения субвирусные частицы в течение 30сут инкубируют в присутствии дезинтегрона-0 при 4 С

Мышам линии BALB/c внутрибрюшин- но (в/бр) вводят препарат М-белка. содержащий 50 мкг белка, в забуференном фосфатами изотоническом растворе хлорида натрия (ЗФР) с полным адьювантом Фрейнда. Иммунизацию повторяют с двухнедельным интервалом, но антиген вводят с неполным адьювантом. Через три недели после второй иммунизации мышам вводят 100 мкг белка внутрибрюшинно внутривенно без адъюванта. Через 3 дня после этого 10 клеток селезенки иммунных животных гибридизуют с 3 х 107 клеток миеломы Х63-Ад8, 653 с помощью 45%-ного раствора полиэтиленгликоля ПЭГ-1000 После гибридизации клетки высевают в 96-луночные

О

ел

Ю CJ N О

планшеты по 10 на 1 лунку. В качестве питательного слоя используют перитональ- ные мышиные макрофаги, которые высевают по 104 на 1 лунку за 1 сут до слияния. Для культивирования и селекции гибридом используют минимальную среду Игла в модификации Дальбекко (ДМЭМ) с добавлением 15%-ной эмбриональной телячьей сыворотки. М гипоксантина. 4 х 10 М аминоп- терина и 1,6 х М тимидина. Гибридому клонируют Зраза методом конечных разведений,-высевая на 1 клетке на лунку, содержащую 104 макрофагов. После третьего клонирования около 96% полученных субклонов продуцируют Мон-АТ с М-белку вируса гриппа типа А (Ленинград) 385/80 Ri (H3N2), которые являются типоспецифиче- кими. Продукция иммуноглобулинов (ИГ) сохраняется на протяжении 21 пассажа in vivo.

Полученный штамм гибридных клеток обозначают АМ-КРСК-2Д8.

Штамм хранится в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Всесоюзной коллекции клеточных культур Института цитологии АН СССР под номером ВСКК (П) 353D и характеризуется следующими признаками:

Культуральные свойства.

Среда для культивирования - ДМЕМ или RPM1 1640 с добавлением 10-15%-ной эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ глутамина, 100 ед/мл гентамицина; рН 7,6, температура 37°С, 5% углекислоты в атмосфере или без углекислоты. Посевная доза 10 кл/мл. Для выращивания штамма используют стеклянную или пластиковую культура л ьную посуду. Во флакон объемом 25 см засевают 5 х 105-10 клеток штамма АМ-КРСК-2Д8 в 5 мл среды, пассаж 1 раз в

4дня той же дозой клеток, без подсчетов клеток - 1:3-1:5. Через 3-4 дня концентрация антител в культуральной жидкости (КЖ) достигает 10-40 мкг/мл.

Для выращивания опухоли из штамма используются мыши линии BALB/c. Молодым мышам за 5-30 дней до введения клеток вводят в/бр 0,5 мл пристана. Клетки штамма инъецируют внутрибрюшинно по

5х 10 на мышь в 0,5-1,0 мл среды 199. Асцитическую жидкость (АЖ) собирают по мере накопления (на 11-14 день). Процедуру забора АЖ проделывают многократно от живых мышей. Делают не менее трех взятий от каждого животного. Объем АЖ при взятии 4-5 мл. Концентрация антител (ИГ) и АЖ 4,2-15,3 мг/мл при определении методом торможения радиоиммуноадсорбции.

Кариологическая характеристика.

Модальное число хромосом в клетках гибридомы 82 с областью варьирования 76- 86.

Продуктивность.

Стабильная секреция полезного продукта сохраняется до 30 пассажей in vitro с концентрацией IG в КЖ до 20 мкг/мл и до 21 пассажа in vivo с концентрацией ИГ в АЖ до 5,8 мг/мл.

0 Контаминация.

Бактерии и грибы в культуре не обнаружены при длительном наблюдении и посевах на питательной среде. Заражения микоплазмой не выявлено по окрашиванию

5 красителями на ДНК и тимидиновой метке в культуральной среде.

Криоконсервирование. Клетки штамма ресуспендируют в культуральной бычьей сыворотке, содержащей

0 10% длиметилсульфоксида (концентрация клеток 5 х 10-10 в 1 мл), разливают в пластиковые ампулы при 4°С, помещают в толстостенную коробку из полипеноуретана и переносят на 24 ч в холодильник (70°С). За5 тем клетки хранят в жидком азоте. Возможно программное замораживание со снижением температуры на 1°С в 1 мин до - 40°С с последующим переносом в жидкий азот. Размораживание осуществляют в

0 течение 3 мин при 37°С. Клетки разводят в 10 мл среды для культивирования, осаждают центрифугированием, ресуспендируют в 5 мл той же среды и переносят в посуду для культивирования. Жизнеспособность кле5 ток по включению трипанового синего составляет более 80%.

Характеристика полезного продукта. Мон-АТ, продуцируемое штаммом АМ- КРСК-2Д8, относится к IGy 1 подкласса и

0 взаимодействует с антигенной детерминан- той М-белка вируса гриппа типа А, общей для различных подтипов, являясь типоспе- цифической. Взаимодействие антитела с различными штаммами вируса гриппа типа

5 А можно выявлять с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) и им- муноблоттинга. В отличие от Мон-АТ к гемагглютинину заявляемое вместе со штаммом Мон-АТ к М-белку не оказывает влия0 ние на гемагглютинацию, гемолиз и. инфекционность, связанные с вирусом гриппа.

Использование полезного продукта штамма АМ-КРСК-2Д8 иллюстрируется сле5 дующими примерами.

П р и м е р 1. Полихлорвиниловые 96-лу- ночные пластины покрывают вирусными материалами разных штаммов типа А в ЗФР в концентрации 1-10 мкг/мл по 50 мкл на 1 лунку. Спустя 8 ч лунки промывают в трех

сменах ЗФР с 0,05% твин-20 в течение 10 мин. В дальнейшем отмывают так же. Инкубируют на всех стадиях при комнатной температуре. Свободные валентности планшет насыщают в течение 1 ч 1 %-ным раствором человеческого сывороточного альбумина (ЧСА) в ЗФР, после чего лунки отмывают и добавляют в них КЖ от заявляемой гибридо- мы по 50 мкл в 1 лунку на 1 ч. Далее лунки отмывают и инкубируют с кроличьей антисывороткой против IG мыши, разведенной ЗФР в 100 раз, в течение 1 ч. Избыток антисыворотки отмывают и добавляют на 1 ч комплекспероксидаза-антипероксидаза (ПАП-реагент). Пап-реагент получают, готовя смесь КЖ от гйгЗридомы АР-РС-2В4, сек- ретирующей Мон-АТ против пероксидазы хрена, с пероксидазой хрена (конечная концентрация в ПАП-реагенте 50 мкг/мл). Отмыв избыток ПАП-реагента. пероксидазную активность выявляют с помощью субстрата на основе ортофенилендиамина (ОРД): 5.1 мл 0,2 М N32HP04, 4,4 мл 0,1 М лимонной кислоты; 9,5 мл деион зованной воды; 0,04% ОРД.и 0,05% Н202. С помощью концентрированной НзНОз рН доводят до 5,0. Положительная реакция проявляется желто-коричневым окрашиванием лунок. Реакцию останавливают через 15 мин концентрированной H2S04 (по 5 мкл на 1 лунку со 100 мкл субстрата). Оптическую плотность оценивают при длине волны 492 нм с помощью прибора Minireader (Dynatech, США). Контрольные лунки вместо Мон-Ат к М-белку обрабатывают КЖ от ми- еломы.

Используют также модификацию ИФА, когда вместо вирусных антигенов на поли- хлррвиниловые планшеты адсорбируют кроличьи моноспецифические антисыворотки против различных штаммов вируса гриппа и типа А, разведенные ЗФР в 100 раз. Спустя 8 ч их избыток отмывают, свободные валентности насыщают 1 %-ным раствором ЧСА в ЗФР, спустя 3 ч лунки отмывают и вносят, соответственно, вирусные материалы различных штаммов и другие реагенты в последовательности, аналогичной описанной.

П р и м е р 2. Вирусные материалы различных штаммов типа А подвергают электрофорезу с ДСН по Лэммли, предварительно обрабатывая 2-меркапроэтанолом (2МЭ)и не обрабатывая их. Диск-электрофорез проводят в пластинчатых полиакрила- мидных гелях (ПААГ толщиной 1 мм с

градиентом концентрации 5/30%. Фракционированию с помощью ДСН-ПААГ электрофореза подвергали как цельные вирусы, так и препараты очищенных пикопротеинов вирусов, полученные путем седимента- ционного отделения солюбилизировэнных дезинтегроном-0 гликопротеинов от вирусных коров. Кроме того, анализируют изолированный М-белок вируса гриппа,

полученный методом хлороформ-метаноль- ной экстракции, По завершении электрофореза белки из геля переносят на нитроцеллюлозную мембрану пассивной в трис-глицоновом буфере с 20% метанол а (18

ч). Свободные валентности нитроцеллюлозы насыщают в течение 1 ч 1 %-ным раствором ЧСА в ЗФР, после чего мембрану обрабатывают тестируемыми Мон-АТ 1 ч. Отмывку на всех этапах проводят в трех

сменах ЗФР с 0,05% твин-20 по 5 мин на шейкере при комнатной температуре. После отмывки мембрану обрабатывают кроличьей антисывороткой против IG мыши (разведение 1:100) 1 ч при комнатной температуре, отмывают и обрабатывают ПАП-ре- агентом (см. пример 1) 1 ч. Отмыв избыток ПАП-реагента, в опыт вносят субстрат: 0,05% тетрагидрохлорида диаминобензи- дина; 0,01 % Н202 в 0,05 М трис-буфере с рН

7,6, на 5 мин при комнатной температуре. Реакцию останавливают, погружая мембрану в дистиллированную воду Мон-АТ проявляют зону белка с молекулярной массой около25 кДа как в вирусе, обрабатывавшемся 2МЗ, так и в вирусе, не проходившем такой обработки, что говорит о специфичности антител в М-белку, а не к легкой цепи . гемагглютимина (ГА2). В материалах солю- билизированных гликопротеинов, очищенных от коров ультрацентрифугированием при 100000 д, проявляемый Мон-АТ белок не выявляют, В тоже время, изолированный с помощью кислого хлороформ-метанола М-белок вируса гриппа отчетливо

реагирует с Мон-АТ.

Таким образом, штамм гибридных клеток АМ-КРСК-2Д8 секретирует Мон-АТ в антигенной детерминанте М-белка вируса гриппа типа А (Ленинград) 385/80 RI (Нз№),

общей для группы исследованных штаммов вируса А различных подтипов.

Формула изобретения Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L ВСКК(П) Nfc

354D - продуцент моноклональных антител к М-белку вируса гриппа типа А.

Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано для разработки диагностических тест-систем. Цель изобретения - получение штамма гибридных клеток, продуцирующих типоспецифические моноклональные антитела к антигенной детерминанте М-белка вируса гриппа типа А, общей для разных подтипов Штамм получают при гибридизации клеток селезенки мышей BALB/c, иммунизированных препаратом М-белка вируса гриппа ти па А (Ленинград) 385/80 Ri (H3N2) выделенным элекгрофоретически с помощью детергента дезинтегрона-0, с клетками миеломной линии 363-Ад8 653 Секретируемое гидридомой моноклональ- ное антитело связывается с М-белком вируса гриппа типа А различных подтипов Штамм культивируется в стандартных уело виях для выращивания гибридом и легко переводится в асцитическую форму Продуктивность штамма 20 мкг/ил в культу- ральной жидкости и 5,8 мг/мл в асцитической жидкости. Штамм депонирован под № ВСКК (П) 354D СО с