Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS L.-продуцент моноклонального антитела к гликопротеиду миелина головного мозга, угнетающего активность естественных киллеров человека Советский патент 1992 года по МПК C12P21/08 

Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано при изучении действия естественных киллеров (ЕК) крови человека, а также в медицине в диагностических целях и для оценки иммунологического статуса организма.

Известны моноклональные антитела- (МонАт), выявляющие антигены на поверх- ностной мембране ЕК клеток. Среди них известны МонАт, полученные с использованием в качестве антигена связанного с миелином головного мозга человека гликопротеида (MAG) с мол.м. 110 кД, на котором представлены эпитопы, распознаваемые МонАт Zeu-7 (или HNK-1), взаимодействующие с дифференцировочным антигеном HNK-1 ЕК крови человека.

Цель изобретения - получение штамма гибридомы, продуцирующей МонАт к антигену миелина мозга, влияющие на активность естественных киллеров (ЕК).

Штамм гибридомы получают при гибридизации клеток мышиной мйеломы Sp 2/0 с клетками селезенки мыши линии Balb/c. иммунизированной связанным с миелином гликопротеидом белого вещества головного мозга человека (МАГ).

МАГ получают из белого вещества головного мозга человека и освобождают препарат от низкомолекулярных примесей согласно известным методикам. Из 5 г белого вещества головного мозга человека (трупный материал) экстрагируют глико- и липопротеиды мягкой гомогенизацией в 20- кратном объеме 0,32 М сахарозы. СуспенVI

ю

о ю

ю

зйю центрифугируют в градиенте плотности 0,32-0,85 М сахарозы 30 мин при 75000 д. Осадок, образовавшийся на границе двух сред, промывают 40-кратным объемом дистиллированной воды в 3 приема с центрифугированием при 75000-30000 д. Затем осадок суспендируют в 20-кратном объеме 0,32 М сахарозы и вновь подвергают градиентному центрифугированию в тех же условиях, что и первый раз. Полученный средний слой лиофияьно высушивают. Все процедуры проводят при температуре 2-4°С.

1,5-2 г лиофилизированного белка де- липидизируют 40 объемами смеси хлоро- форм;метанол (3:1) в течение 1 ч при встряхивании. Суспензию центрифугируют- ЗО.мин при 75000д. Осадок эфиром (10 мл) переносят в колбу, эфир удаляют газообразным азотом, а осадок раствора ютв 20 мл 0,3 М Ll-дииодсалицилата на 0,05 М трмс-буфе- ре рН 7.4. Раствор депротеинизируют равным объемом водо насыщен но го фенола. После депротеинизации фенол и остатки LI- дииодсалицилата убирают диализом против дистиллированной воды, а затем физиологического .раствора а общей сложности не менее 3 сут (до удаления следов лития по показаниям пламенного фотометра). Если после диализа объем раствора превышает 8 мл, его концентрируют с помощью этиленг- ликоля. Полученный диализат центрифугируют 1 ч при 10000 g и затем выделяют на сефадексе G200 из водного раствора фракцию 100-110 кД. Эту фракцию используют как антиген при иммунизации мышей и тестировании моноклональных антител (МонАт).

Иммунизация животных.

Мышей линии Balb/c в возрасте 6-8 недель иммунизируют по следую щей схеме; первую инъекцию проводят внутрибрюшинно - 50 мкг МАГ с полным эдъювантом Фро- инда на мышь. Через 7 суток внутрибрюшинно вводят 25 мкг препа.ратэ с полным адъювантом Фрейнда на мышь. Еще через 4 сут в течение 3 Дн по 5 мкг препарата на мышь без адъюванта вводят внутрибрюшинно и внутривенно. Через 2 сут после последней инъекции клетки селезенки берут на слияние. Перед слиянием в сыворотке крови иммунизированных мы-, шей проверяют наличие антител к МАГ: в реакции преципитации в агаре получена отчетливая полоса преципитации при использовании ТО мкг белка и вдвое разведенной сыворотки крови. При тестировании имму- ноферментным методом получена положительная реакция при использовании 0,7 мкг МАГ на лунку и разведении сыворотки крови 1:1000.

Получение гибридомы. Спленоциты иммунизированной мыши сливают с клетками миеломы линии Sp 2/0 в соотношении 5:1 с помощью полиэтиленгликоля (мол.м. 1500) в соответствии с общепринятой методикой. После слияния смесь спленоцитов с клетками миеломы в гибри- домной среде помещают в 96-луночные панели с нанесенными макрофагами

перитонеального эксудата мышей Ва1Ь/с. На следующие сутки в лунки добавляют равный объем гибридомной среды с удвоенным количеством ГАТ. Клоны гибридомных клеток появлялись на 5-7-е сутки после слияния в 50-70% лунок. В эти сроки начинают замену среды ТАТ. Тестирование наличия в среде МонАт к МАГ проводили иммунофер- ментным методом через 12-18 сут после слияния. Идентифицированные клетки-продуценты клонируют на питающих слоях макрофагов, культивируют IH витро или замораживают жидким азотом в смеси 90% эмбриональной сыворотки и 10% DMSO. Получение асцитной формы гибридомы.

. Мышам линии Ва1Ь/с вводят внутрибрюшинно по 0;5 мл пристана. Через 8-10 дней этим мышам внутрибрюшинно вводят культуру гибрйдомных клеток в растворе 0,14 М NaCI на 0,2 М фосфатном буфере рН

7,2 по 1х106 клеток на мышь. Через 7-8 сут у мышей развивается асцит, от каждой мыши получают 2-7 мл асцитической жидкости. Клетки, отделяемые мягким центрифугированием (150 g, 7 мин, стерильно) используют для дальнейших перевивок гибридомы, в асцитическую жидкость - как источник МонАт.

. Анализ специфичности моноклонально- го антитела.

Культуральную среду исходных и вторичных клонов гибридомы, а также асцитическую жидкость проверяют на наличие МонАт к МАГ иммуноферментным методом (ELISA). При тестировании используют 96ячеечные платы (фирма Flow), в каждую лунку которых вносят по 0,5-0,6 мкг антигена (МАГ) в 0,1 М карбонатном буфере рН 9,5, в качестве блокирующего белка используют яичный альбумин в растворе РВ рН 7,2.

Конъюгат пероксидазы с антимышиной сывороткой (фирма Sigma) в разведений 1:1000 на PBS с 0,5% альбумином. О ходе ферментативной реакции судят по изменению окраски о-фенилендиамйна (Sigma) в

разведении 1 мг/мл 0,1 М цитратного буфера рН 4,5. Все промывки между отдельными

процедурами проводят раствором PBS рН

7,2 в присутствии 0,05 М Т«вина-20 и водой..

Степень развивающейся окраски оценивают в спектрофотометре-мультискане (фирма Flow) при длине волны 450 нм.

Взаимодействие МонАт с поверхностными антигенами мононуклеаров определяют методом реакции непрямой иммунофлуоресценции в модификации для пробирок.

Для этого в пробирки к осадку мононук- леаров, выделенных в градиенте плотности фиколл-верографина, содержащему (3-4)х106 клеток добавляют 0,5 мл тестируемых МонАт. Время инкубации составляет 30 мин при 37°С в атмосфере 5% С02. Затем клетки отмывают 3 раза в растворе Хенкса и добавляют Г(ав) фрагменты, полученные из люми- несцирующей сыворотки против иммуноглобулинов белой мыши (НИИ ЭМ им.А.Ф. Гамалеи). Клетки ресуспендируют и инкубируют 30 мин при 4°С. Затем клетки вновь отмывают 3 раза в растворе Хенкса и помещают на покровное стекло. Препараты высушивают и консервируют клетки 50%- ным глицерином на физиологическом растворе. Регистрацию светящихся клеток на препаратах проводят на флуоресцентном микроскопе при просмотре 300-500 клеток.

При определении цитотоксической активности ЕК-клеток крови человека в качестве клеток-мишеней используют культуру клеток эдитробластоза человека К 562, ме- ченных Н-уридином (35-40 Бк на ТО клеток). Лимфоидные клетки-эффекторы (мононуклеары) получают из донорской крови человека в градиенте плотности фиколл- верографина. Мононуклеары (по 7x10 клеток в 0,5 мл), обработанные МонАт в реакции связывания комплемента, инкубируют с клетками-мишенями в соотношении 1:25 в полной среде РРМ 16-18 ч при температуре 37°С в атмосфере 5% С02. В контрольном варианте вместе МонАт используют питательную среду RPMI1640. Оставшиеся после инкубации неразрушенными клетки-мишени фиксируют на фильтрах и подсчет радиоактивности проводят в толуолычрм сцинтилляторе на счетчике Векмап. О цитотоксической активности ЕК- клеток до и после обработки их МКА МонАт судят по изменению цитотоксического индекса, определяемого по формуле

, радиоактивность опытной пробы , .„ радиоактивность в контроле х

Показано, что полученные МонАт снижают не менее чем на 40% цитотоксическую активность фракции мононуклеаров крови человека по отношению к клеткам культуры лимфобластоза человека К 562.

Для определения класса иммуноглобулинов исследуемых антител используют метод иммунодиффузии в агаре по общепринятой методике. В качестве конт- ролей используют МонАт с известным и изотопами. В качестве преципитирующего агента используют кроличьи антитела против мышиных антител (RAM). Реакцию проводят в ПЭГ, содержащем агар-агар 1% с 2% ПЭГ на 0.1 М ФСР, рН 8.6. В случае слияния изотопов - исследуемого и известного - происходит слияние линий преципитации в одну линию, в данном случае IgM и IgM. 13 случае различия (IgM и IgG)слияния не происходит.

Физиологические и культуральные свойства штамма.

Штамм культивируют на ростовой среде ДМЕМ с добавлением 10% эмбриональной сыворотки, 1 мМ заменимых аминокислот, 1 мМ пирувата натрия, 2 мМ глютамина, 5.10 М меркаптоэтанола и 40 ед./мл гентамици- на при 37°С в атмосфере 5% С02. Способ культивирования суспензионный. Время удвоения популяции 36 ч. Кратность рассева 1:3,2 три раза в неделю.

Криоконсервирование проводят в ростовой среде с добавлением 10% диметил- сульфоксида при концентрации (0,5-1). 10 клеток в 1 мл. Жизнеспособность клеток штамма Н 10/2 после размораживания 70%. Прививка культивируемых гибридных клеток штамма Н 10/2 сингенным мышам Ва1Ь/с вызывает у них образование асцит- ной формы опухоли, В асцитической жидкостисодержатся . МонАтк дифференцировочному антигену HNK-1 ЕК- клеток. Способность к продукции МонАт сохраняется при нескольких последовательных перевивках опухоли (не менее 16). Титр Ат определяли в разведении асцита не менее чем 10 . Клетки сохраняют жизнеспособность при переводе их на ростовую среду. При культивировании ин виво от одной мыши получают 2,5-7 мл асцитической жидкости (в среднем 4 мл).

Штамм депонирован в специализированной коллекции клеточных культур Института цитологии АН СССР - ВСКК. Регистрационный номер депонирования - 453Д.

Формула изобретения

Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L № ВСКК(П)453Д - продуцент моноклонального антитела к гли- копротеиду миелина головного мозга, угнетающего активность естественных киллеров человека.

Изобретение относится к гибридомной технологии. Штамм (Ш) гибридных клеток получен при слиянии клеток мышиной мие- ломы Sp 2/0 с клетками селезенки мыши линии Balb/c, иммунизированной гликоп- ротеидом мозга, связанным с миелином. Гибридные клетки продуцируют иммуноглобулины класса М. Прививка клеток Ш син- генным мышам вызывает у них образование асцитной опухоли. В асцитической жидкости мыши содержатся специфические антитела. Титр разведения асцитической жидкости в иммунрфермёнтном анализе 10 . Способность к продукций антител стабильно сохраняется на протяжении не менее 16 пассажей. Моноклоналкные антитела, продуцируемые Ш, способны подавлять на 40% естественную киллерную активность мононуклеаров периферической крови человека. Штамм депонирован под № ВСКК(П)453Д.