Штамм гибридных культивируемых клеток MUS мUSсULUS L, используемый для получения моноклональных антител к общей антигенной детерминанте альфа-1-антитрипсина человека и обезьян Советский патент 1992 года по МПК C12N5/00 C12P21/08 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в медико- биологических и приматологических исследованиях,

Известны моноклональные антитела (МКА) к ААТ, однако все они направлены к ААТ человека. Так они получили аллелеспе- цифичные моноклональные антитела к ААТ человека, т.е. направленные к антигенной детерминанте, присутствующей на ААТ, контролируемом аллелем Z (аллель Z - редкий генетический вариант, встречающийся только у человека).

Наиболее близким к изобретению является гибридный штамм, продуцирующий МКА к нативному ААТ человека. Проводили иммунизацию мышей очищенным препаратом ААТ человека (нативным, окисленным и в комплексе с трипсином). Кроме МКА, реагирующих с нативным МКА человека, получили и МКА, реагирующие только с окисленной формой человеческого ААТ, а также МКА, специфичные к комплексу ААТ- трипсин.

Взаимодействие перечисленных моно- клональных антител с ААТ обезьян неизвестно.

Цель изобретения - получение штамма гибридных клеток, продуцирующего моноклональные антитела к антигенной детерминанте ААТ, общей для человека и обезьян.

Ч

ел

со ел ю

Штамм получают следующим образом.

Мышей линии BALB/c иммунизируют очищенным ДАТ человека по следующей схеме: 100 мкг ААТ в полном адьюванте- Фрейнда в/мышечно в две задние ляпы; через 28 дней 4 ежедневных введения (в/брюшинно, в/венно) по 100 мкг ААТ а забуференном фосфатами физиологическом растворе (ЗФР). На следующий день после последней иммунизации проводят слияние, процедура которого включает следующие этапы.

Спленоциты, полученные путем гомо- генезирования селезенки в среде 199, помещают в центрифужную пробирку и отстаивают в вертикальном положении в течение 10 мин, затем 9/10 суспензии переносят в пластиковую центрифужную пробирку, заполняют ее до 40 мл средой 199, однократно отмывают в среде 199 и суспендируют в среде RPMI 1640 (107 кл/мл). Паралельно миеломные клетки (линия Х63-Ад.8,653) трижды отмывают средой 199 и также суспендируют в среде RPM1 1640 в той же концентрации. Спленоциты (10 клеток) и миеломные клетки (2 10 ) смешивают в пластиковой центрифужной пробирке, заполняют средой RPM1 1640, тщательно суспендируют и центрифугируют при 800 об/мин в течение 10 мин. Суперна- тачт удаляют практически насухо, осадок разрыхляют постукиванием пальцем о дно пробирки и по каплям в течение 1 мин добавляют к клеточному осадку 50%-ный раствор полиэтиленгликоля 6000. Нижнюю часть пробирки опускают в водяную баню (37°С) на 1.5 мин, постоянно встряхивая ее вращательными движениями. Слияние останавливают разбавлением средой RPMI 1640 - в течение первых 30 с вносят 1 мл среды, в следующие 30 с - еще 3 мл среды и затем в течение 1 мин-около 15мл среды. Далее пробирку заполняют средой до 40 мл, суспензию инкубируют в течение 5 мин при комнатной температуре и центрифугируют при 800 об/мин в течение 10 мин. Осадок осторожно ресуспендируют в среде RPMI 1640 с 15% телячьей эмбриональной сыворотки и ГАТ (гипоксантин, аминоптерин, тимидин) до концентрации 5 106 кл/мл (без учета потерь при слиянии). За 24 ч до слияния в 9б-луноч- ные плоскодонные панели для клеточных культур засевают перитонеальные клетки нормальных мышей BALB/c (перитоне- альная кормушка).

Для получения последних мышам в/б вводят 0,34 М раствор сахарозы, брюшко массируют, животных забивают и отбирают раствор с клетками, среди которых не менее 50% составляют макрофаги. После отмывания в среде 199 клетки суспендируют в среде RHMI 1640 с 15% телячьей змбриочальной сыворотки + ГАТ и рассеивают в лунки (150 мкл, 5000 клеток на лучку). Немедленно после завершения слияния в каждую лунку вносят около 2,5 10 клеток смешанной суспензии. Панели с. михрокуль0 турами инкубируют при 37°С в атмосфере с содержанием 5-7% . Клетки просматривают под инвертированным микроскопом ежедневно, начиная с 5-х суток посла слияния. С этого же момента через день в каж5 дои лунке меняют приблизительно половину среды.

Культивирование гибридных клеток в присутствии ГАТ проводят в течение первых двух недель после слияния, затем еще 4 дня

0 клетки культивируют в присутствии ГТ (без аминоптерина) и далее переводят на обычную среду без добавок. Отбор гибридом, продуцирующих МКА требуемой специфичности, осуществляют с помощью твердофаз5 ного иммуноферментного анализа (ИФА). В первом случае ча твердой фазе адсорбируют ААТ человека, во втором - ААТ павиана гамадрила. Для реакции используют 96-лу- ночные ИФА панели, в лунки которых вно0 сят ААТ (2 мкг/мл, 100 мкл на пупку), разведенный в 50 мМ карбонатном буфере, рН 9,5, Адсорбцию ведут при 4°С в течение 16-18 ч, после чего панели трижды отмывают ЗФР, содержащим 0,05% Твина 20

5 (ЗФР-Тв). Затем в лунки вносят исследуемые культуральные жидкости в разведении 1:5 (100 мкл на лукку) и инкубируют в течение 1 ч при 37°С. Пластины трижды отмыва- ютЭФР-ТВ и в каждую лунку вносят 100 ккл

0 коньюгата - антисыворотку к иммуноглобулинам мыши, меченную пероксидазой (1:1000 вЗФР-Твс 1% обезжиренного сухого молока). Используют коммерческий конью- гат, адсорбированный иммуноглобулинами

5 человека и ряда животных, Инкубацию с конь- югатом проводят при 37°С в течение 1 ч.

После 5 отмываний ЗФР-Тв в лупки вносят по 100 мкл раствора субстратэ-ортофе- нилендиамина/Н202(рН 6,0).

0 Инкубацию с субстратом осуществляют в темноте при 37°С, обычно в пределах 10-30 мин (обеспечивая максимальную разницу между положительным и отрицательным контролями). Реакцию останавли5 вают 1М серной кислотой (25 мкл на лунку). Результаты учитывают на спектрофотометре при длине волны 492 нм. В каждую постановку включают контроли: положительный, отрицательный и контроль коньюгата. Гибридому, продуцирующую МКА

нужной специфичности, клонируют в лунках 96 луночных панелей, содержащих перето- ниальную кормушку. Плотность рассева при клонировании - 1 клетка на 3 пунки.

Полученный штамм обозначают как ААГ-ЕС1, он депонирован во Всесоюзной коллекции клеточных культур под номером ВССК(П)464Д и характеризуется следующими признаками.

Культуральные свойства. Способ культивирования - в стеклянных или пластиковых флаконах на 50 -250 мл, посевная доза 500 тыс. клеток в 1 мл, кратность рассева - 1:2, время субкультивирования 3-4 дня. Культивирование в среде RPWM 1640 с 15% телячьей эмбриональной сыворотки при 37°С в атмосфере с содержанием 5% С02.

Культивирование гибридомы в организме животного, Мыши BALB/c обработаны пристаном (1 мл в/б за 10 дней до инокуляции). Доза инокуляции 5-10 млн клеток, время образования асцита 10-20 дней.

Характеристика полезного продукта. Моноклонагьные антитела относятся к IgGL, специфически реагируют с общей антигенной детерминантой ААТ человека и обезьян. Специфичность оценивают имму- ноферментнмм методом с использованием в качестве антигена очищенного препарата ААТ человека, а также иммуноблоттингом после изоэлектрофокусировзния в полиак- риламидном геле (рН 4-5) сывороток крови различных видов приматов с использованием в качестве контроля коммерческой моноспецифической антисыворотки к этому белку.

Продуктивность штамма. Концентрация моноклональчых антител в культураль- ной среде около 5 мкг/мл, в асцитной жидкости около 5 мг/мл. Титры данных антител 10 {в среде) и 10 (асцит) при концентрации антигена 2 мкг/мл. Продукция моноклональ- ных антител стабильна, по крайней мере, в течение 20 пассажей in vitro.

Контроль контаминации бактериями, грибами, микоплазмами и вирусами нет.

Способ криоконсервирования 5-6 млн клеток в телячьей эмбриональной сыворотке + 10% ДМСО, программное замораживание в жидком азоте. Жизнеспособность после размораживания составляет 70% (оценка жизнеспособности по включению трипанового синего).

Пример. Известно, что каждый род (а в ряде случаев и вид) обезьян характеризуется своим собственным вариантом (или

вариантами) АГТ. Эти варианты включают мажорные и минорные полосы, расположенные в строго определенных участках геля при осуществлении изоэлектрофокусирования. Сведения о полиморфизме ААТ у приматов позволяют изучать реактивность полученных МКА с ААТ большого числа родов и видов обезьян. Процедура исследования включает изоэлектрофокусирование в

полиакриламидном геле, белковый перенос и имму-юпроявление с помощью МКА. Изоэлектрофокусирование проводят в полиакриламидном геле в градиенте рН 4-5 или 4-6,5 в течение 4 ч (включая 1 ч префокусирования) при напряжении 2000 В и температуре охлаждения 4°С. Сыворотки человека и обезьян с известными вариантами ААТ наносят на бумажные аппликаторы (1:5 в Н20, 20 мкл), которые помещают на гель на

расстоянии 1 см от катода. После окончания изоэлектрофокусирования методом контактной диффузии осуществляют перенос белка с геля на нитроцеллюлоз ную- мембрану. Для предотвращения неспецифической адсорбции мембрану выдерживают 1 ч при комнатной температуре в растворе 8%-ного сухого обезжиренного молока и после отмывки ЗФР/ Тв инкубируют с МКА (в разведении 14 для культуральной жидкости и

1:500 для асцита). После трех отмываний ЗФР/Тз мембрану инкубируют с антимышиным пеооксидазным коньюгатом в разведении 1:250 в ЗФР/Тв+1%-ное сухое молоко. После тщательного отмывания мембрану помещают в раствор субстрата (ди- аминобензидин/Й202} и инкубируют в темноте при 37°С, Результаты свидетельствуют о том, что полученные МКА взаимодействуют с древней консервативной

детерминантной ААТ приматов, сохранившейся в процессе эволюции этого отряда. Последнее определяет равную эффективность МАТ как в отношении разных родов и видов приматов, так и в отношении разных

аллельных вариантов внутри одного рода.

Полученные МКА могут быть использованы в медицинских исследованиях для моделирования заболеваний человека и в научной работе.

Формула изобретения

Штамм гибридных культивируемых клеток Mus musculus I BCKK/П) N 464 D, используемый для получения монокло- нальных антител к общей антигенной детермиианте альфа-1-антитрипсина человека и обезьян.

Использование: биотехнология, медико-биологические и приматологические ис- следования. Сущность изобретения: получение штамма гибридных культивируемых клеток Mus musculus L, продуцируемого моноклонального антитела (МКА) к общей антигенной детерминанте альфа- 1-антитрипсина человека и обезьян. Штамм получают гибридизацией слено- цитоз мышей линии Balb/C, иммунизированных очищенным альфа-1-антитрипсином человека, с клетками миеломы мыши Х63- Ад8,653. Концентрация МКА в культураль- ной жидкости состаляет 5 мкг/мл, в асцитной - 5 мг/мл. Продукция МКА стабильна по крайней мере в течение 20 пассажей. Ё