СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВИДОСПЕЦИФИЧНЫХ ЭЙМЕРИЙНЫХ АНТИГЕНОВ Российский патент 1994 года по МПК A61K39/02 A61K39/12 

Изобретение относится к ветеринарии, а именно к получению биологических препаратов.

Изобретение может быть использовано для серологической диагностики эймериозов кур, вызванных различными видами эймерий.

Известны способы получения эймерийных антигенов, заключающиеся в разрушении возбудителя с помощью замораживания и оттаивания или воздействия стеклянными шариками. К их недостаткам относятся малый выход, низкая специфичность и активность конечных продуктов.

Известен также взятый за прототип способ, включающий получение стерильных, спорулированных ооцист, их разрушение ультразвуком с предварительной гомогенизацией. Это увеличивает выход антигена, однако они имеют низкую активность и перекрестно реагируют с видоспецифическими антиэймерийными сыворотками.

Целью изобретения является получение высокоактивных и видоспецифичных эймерийных антигенов.

Цель достигается тем, что в способе, включающем получение стерильных споррулированных ооцист, их разрушение ультразвуком с предварительной гомогенизацией, вводится дополнительный этап фракционирования с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии высокого давления (ВЭЖХ).

Заявляемый способ, в отличие от прототипа, позволяет получить фракции антигенов мол.м. 100-200 кД, содержащие высокоактивные и видоспецифические антигены эймерий. Основное количество белков с низкой антигенной активностью и перекрестно реагирующих с гетерологичными антиэймерийными сыворотками содержится в других фракциях.

Способ осуществляется следующим образом. Стерильные спорулированные ооцисты получают путем обработки 20 мл суспензии центрифугата культуры эймерий, содержащей 9,7 млн/мл возбудителей, раствором хромовой кислоты (174 мл серной кислоты и 100 мл 20%-ного раствора бихромата калия). Ооцисты суспендируют в 0,01 М фосфатном буферном растворе рН 7,4, охлажденном до 4^оС, гомогенизируют в стеклянном гомогенизаторе в течение 5 мин и обрабатывают ультразвуком при частоте 15 кГц, амплитуде 15 мкм и мощности 150 Вт в течение 15 мин.

Полученный гомогенизат центрифугируют при 15 тыс. об/мин в течение 20 мин при температуре 4^оС. Супернатант, содержащий 3 мг/мл белка (по Лоури), хроматографируют последовательно на колонках Zorbax (G250 и G450), заполненных селикалегем с привитым диолом (LKB, Швеция). Фракции элюируют при давлении 100 атм со скоростью 0,5 мл/мин при 4^оС 0,01 М фосфатным буферным раствором рН 7,4. Профиль элюции регистрируют при длине волны 280 нм. Для определения молекулярной массы были использованы стандарты S-200 (Sigma, ФРГ).

Полученные фракции (объемом 3 мл каждая) анализируют на антигенную активность и специфичность в непрямом варианте иммуноферментного метода (ИФМ) с использование трех видоспецифических антисывороток к возбудителям E.tenella, E.acervulina, E.maxima и пероксидазного антикуриного коньюгата.

П р и м е р 1. Получение видоспецифичных эймерийных антигенов по предлагаемому способу с использованием стерильных споруллированных ооцист Eimeria tenella.

Эффективность озвучивания по данным световой микроскопии составила 100% . Фракции, полученные с помощью ВЭЖХ имели мол.м. в диапазоне 1-200 кД. Антигенной активностью обладали фракции с молекулярным весом от 20 до 200 кД. Максимум активности приходился на фракции мол.м. 100-200 кД. Для этих же фракций характерен и максимум видовой специфичности.

П р и м е р 2. Получение видоспецифичных эймерийных антигенов по предлагаемому способу с использованием стерильных споруллированных ооцист Eimeria maxima.

Аналогично примеру 1, только для получения антигенов была использована культура E.maxima.

П р и м е р 3. Получение видоспецифичных эймерийных антигенов по предлагаемому способу с использованием стерильных спорулированных ооцист Eimeria acervulina.

Аналогично примеру 1, только для получения антигенов была использована культура E.acervulina.

Антигенная активность фракций с мол.м. 100-200 кД для всех трех видов эймерий более чем в 2-3 раза превышает исходную антигенную активность ультразвукового дезинтеграта. Во фракциях с мол.м. 20-100 кД антигенная активность значительно ниже и полностью отсутствует в низкомолекулярных фракциях (1-20 кД). Результаты испытаний сведены в табл. 1.

Специфичность максимальна для фракций с мол.м. 100-200 кД. Перекрестные взаимодействия с гетерологичными сыворотками уменьшаются в 2-3 раза по сравнению с прототипом. Фракции с мол. м. 20-100 кД имеют ярко выраженные перекрестные взаимодействия при низкой антигенной активности, что отражено в табл. 2.

Таким образом, заявляемый способ придает получаемым эймерийным антигенам новые свойства и существенные отличия по сравнению с прототипом, а также устраняет его недостатки.

Изобретение относится к ветеринарии, а именно к получению биологических препаратов. Целью изобретения является получение высокоактивных и видоспецифичных эймерийных антигенов. Сущность изобретения состоит в том, что в способе, включающем получение стерильных спорулированных ооцист, их разрушение ультразвуком с предварительной гомогенизацией, вводят дополнительный этап фракционирования ультразвукового гомогенизата с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии высокого давления, что обеспечивает выделение белковых фракций мол. м. 100 - 200 кД, характеризующихся максимальной антигенной активностью и видоспецифичностью. Способ проверен при использовании различных видов эймерий E. Tenella, E maxima и E. acervulina. Предлагаемый способ позволяет значительно повысить активность и видоспецифичность эймерийных антигенов по сравнению с прототипом. Эймерийные антигены, полученные по предлагаемому способу, обеспечивают в контрольных иммунохимических тестах (ИФМ) с использованием антисывороток к различным видам эймерий практически полное отсутствие перекрестных реакций. 2 табл.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВИДОСПЕЦИФИЧНЫХ ЭЙМЕРИЙНЫХ АНТИГЕНОВ, включающий получение стерильных спорулированных ооцист, их разрушение ультразвуком и выделение белковой фракции, отличающийся тем, что, с целью повышения антигенной активности и специфичности, ультразвуковой гомогенизат разделяют посредством высокоэффективной гель-хроматографии на силикагеле с привитым диолом при давлении 100 атм и скорости элюции 0,5 мл/мин при 4^oС и используют фракции с мол.м. 100 - 200 кП.