ШТАММ Л-3-2 EIMERIA MAXIMA (ВОЗБУДИТЕЛЯ КОКЦИДИОЗА) ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА ВАКЦИН, ДИАГНОСТИКУМОВ И ПРОВЕДЕНИЯ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ Российский патент 2011 года по МПК C12N1/20 A61K39/12 

Изобретение относится к ветеринарной паразитологии и биотехнологии, а точнее к производству диагностических и вакцинных препаратов против кокцидиоза кур, вызываемого Eimeria maxima (E.maxima), и проведению научных исследований.

Кокцидиоз кур, вызываемый Е. maxima, имеет широкое распространение во всех странах и наносит существенный экономический ущерб промышленному птицеводству.

Многие научно-исследовательские центры занимаются изучением как самого паразита, так и вызываемого им заболевания у птиц. Основной целью научных исследований является получение знаний о возбудителе болезни и создание средств и методов диагностики, химио- и специфической профилактики вызываемого им заболевания.

Специфическая профилактика является одним из важных методов борьбы с кокцидиозом кур, используемых в птицеводстве. Технология производства и применения антикокцидийных вакцин такова, что используемые при их изготовлении штаммы должны обладать высокой иммуногенной активностью, не быть устойчивыми к действию различных кокцидиостатиков (химиопрепараты и ионофорные антибиотики).

Известен ряд штаммов Е. maxima [1, 2, 3]. Эти штаммы выделены в других странах и используются при проведении научных исследований и производстве вакцин.

В России при проведении исследований обычно использовали не чистые штаммы различных видов кокцидий, а их смеси. Однако при разработке эффективных вакцин необходимо иметь чистые лабораторные штаммы возбудителя. Поэтому возникла необходимость выделения такого штамма Е. maxima, который можно было бы использовать для указанных целей.

В качестве прототипа использован штамм Е. maxima, описанный Edgar S.A. and Siebold C.T., 1964 [4].

Этот штамм вызывает у зараженных восприимчивых цыплят острое переболевание с характерными клиническими признаками (угнетенный вид, взъерошенные перья, бледность гребешков и слизистых оболочек, жажда, отказ от корма, жидкий слизистый, иногда кровянистый помет). На вскрытии у павших птиц отмечается вздутие всего тонкого отдела кишечника, стенка утолщена, на серозной оболочке слизистой видны петехии, реже геморрагические поражения. У переболевших цыплят образуется иммунитет к повторному заражению.

Таблица 1 Характеристика прототипа Показатели   Размеры ооцист, мкм:   длина 21,5-42,5 (средняя 30,5) ширина 16,5-29,8 (средняя 20,7) Форма ооцист Овоидная Препатентный период*, час 123 Место локализации в кишечнике Весь тонкий кишечник Заражаемость ХХХХ** Смертность XX** Встречаемость Обычен Течение заболевания, дни 9 Чувствительность к кокцидиостатикам Неизвестна * Время от заражения до начала выделения ооцист во внешнюю среду. ** Х-ХХХХ - степень заражаемости и смертности.

Однако у нас отсутствуют Е. maxima, описанного Edgar S.A. and Siebold C.T., 1964 [4] сведения об иммуногенности и чувствительности штамма к антикокцидийным препаратам.

Задачей изобретения является получение штамма Е. maxima, обладающего высокими иммуногенными свойствами, чувствительного к кокцидиостатикам.

Поставленная задача достигается штаммом Л-3-2 Eimeria maxima (возбудителя кокцидиоза) для производства вакцин, диагностикумов и проведения научных исследований.

Штамм Л-3-2 Eimeria maxima выделен путем заражения восприимчивого цыпленка одной спорулированной ооцистой из материала, полученного от больных цыплят с одной из птицефабрик Ленинградской области. В лабораторных условиях изучены его иммунобиологические (морфологические, репродуктивные, вирулентные, иммуногенные) свойства и чувствительность к антикокцидийным препаратам.

Штамм Л-3-2 Eimeria maxima депонирован в коллекции Всероссийского научно-исследовательского ветеринарного института птицеводства Россельхозакадемии под номером КЭ №3.

Характеристика штамма Л-2-3 Eimeria maxima (возбудителя кокцидиоза)

Систематическое положение. Штамм Л-3-2 Е. maxima относится к роду Eimeria, семейству Eimeriidae, отряду Coccidiida.

Морфологическая характеристика. Ооцисты овоидной формы, длиной 26,0-36,0 мкм, шириной 18,0-27,0 мкм (средняя 30,0-22,0 мкм).

Биологические свойства. Препатентный период развития паразита составляет 126 часов. Место эндогенного развития паразита в кишечнике инвазированных цыплят - весь тонкий кишечник.

Клинические и патолого-анатомические признаки. Характерные для данного вида.

Вирулентные свойства. При заражении 15-дневных цыплят ооцистами, хранившимися не более 2-х месяцев, в дозе 3 млн. ооцист на голову летальность составляет не менее 30%.

Иммуногенные свойства. Заражение цыплят ооцистами вызывает формирование специфического иммунитета (гуморального и клеточного).

Культурально-биохимические свойства. Штамм не культивируется на питательных средах. Поддерживается путем пассирования на цыплятах, вызывая через 96 часов характерные поражения в кишечнике с выделением ооцист, начиная с 126-го часа после заражения.

Штамм чувствителен к антикокцидийным препаратам - ампролиуму, никарбазину, фармкокциду, химкокциду, клинакоксу, ко всем ионофорным антибиотикам.

Специфичность. Штамм Л-3-2 Е. maxima специфичен только для кур.

Пример 1. Использование штамма Л-3-2 Е. maxima для наработки вакцины против кокцидиоза кур.

Для иммунизации птицы используются специально подобранные штаммы кокцидий, обладающие слабой вирулентностью и высокой иммуногенностью, в дозах, не вызывающих клинического переболевания кокцидиозом. Такими свойствами обладает штамм Л-3-2 Е. maxima. Иммуногенный материал получают следующим образом. 14-дневных цыплят, свободных от кокцидий, заражают перорально ооцистами штамма Л-3-2 Е. maxima из матричной расплодки в дозе 20 тысяч на 1 голову. На 6-9 сутки после заражения из собранного от цыплят помета выделяют ооцисты методом флотации в насыщенном растворе поваренной соли. Споруляцию ооцист проводят в 2%-ном растворе двухромовокислого калия при температурном режиме 26±2°C в течение 3-5 суток. Спорулированные ооцисты штамма Л-3-2 Е. maxima используют при изготовлении антикокцидийной вакцины.

Вакцина против кокцидиоза представляет собой гомогенную стерильную смесь серовато-оранжевого цвета без посторонних примесей, плесени, неразбивающегося осадка, безвредную для цыплят. Пероральное применение культуры кокцидий вызывает субклиническое переболевание цыплят с последующим выделением ооцист во внешнюю среду, что создает возможность естественного реинвазирования хозяина и формирования у него иммунитета, напряженность которого может быть определена после контрольного заражения.

Пример 2. Изучение в экспериментальных условиях антикокцидийной активности препаратов.

В настоящее время основным методом профилактики кокцидиозов кур является использование антикокцидийных препаратов. В связи с тем, что длительное применение кокцидиостатиков вызывает появление резистентных форм паразитов, что существенно снижает эффективность химиопрофилактики, необходимо знать степень чувствительности лабораторных штаммов к применяемым препаратам. Кроме того, эффективность вновь синтезированных кокцидиостатиков также должна проверяться на чувствительных штаммах кокцидий с известной вирулентностью. К таким штаммам относится штамм Л-3-2 Е maxima.

Интактных цыплят заражают перорально ооцистами штамма Л-3-2 Е. maxima в дозе ЛД₅₀ и сразу начинают давать с кормом изучаемые препараты. Наблюдения за птицей ведут в течение 10 дней. Для оценки антикокцидийной активности препарата используют показатели выживаемости и привесов, которые служат для определения противококцидиозного индекса (ПКИ).

Таблица 2 Сравнительная оценка эффективности различных кокцидиостатиков при заражении цыплят кокцидиями штамма Л-3-2 Е. maxima Назначение групп Наименование препаратов Доза препарата, % к корму Доза ооцист, тысяч Процент   выживаемости привеса ПКИ Подопытная химкокцид 0,07 3000 100 84,5 194 Подопытная никарбазин 0,125 3000 100 83.7 193 Контрольная зараженная, без препарата - - 3000 30,0 12,1 43 Контрольная незараженная 0 0 0 100 90,4 200

В данном опыте установлено, что химкокцид и никарбазин обладают выраженной антикокцидийной активностью при заражении цыплят кокцидиями штамма Л-3-2 Е. maxima.

Таким образом, штамм Л-3-2 Е. Maxima (возбудителя кокцидиоза) обладает такими иммунобиологическими свойствами, которые позволяют использовать его для проведения экспериментальных исследований, а также в целях получения антигенного и иммуногенного материала, используемого для диагностики и специфической профилактики заболевания.

Источники информации

1. Norton С.С., Hein Н.Е. Eimeria maxima: a comparison of two laboratory strains with a fresh isolate. Parasitology, 72 (3), 1976.

2. Long P.L. and Millard B.J. Immunological differences in Eimeria maxima: effect of a mixed immunizing inoculum on heterologous challenge. Parasitology, 79, 1979.

3. Long P.L. and Rose M.E. Prospects for the Control of Coccidiosis by Immunization. World's Poultry Sci. J., 38 (2), 1982.

4. Edgar S.A., Siebold C.T. A new coccidium of chickens, Eimeria mivati sp.n. (Protozoa: Eimeriidae) with details its life history. Journal of Parasitology 50 (2), 1964.

Изобретение относится к ветеринарной паразитологии. Штамм депонирован в коллекции ГНУ ВНИВИП Россельхозакадемии под регистрационным номером КЭ №3. Штамм используется для производства вакцин, диагностикумов и проведения научных исследований. Штамм обладает высокими иммуногенными свойствами, чувствителен к кокцидиостатикам, специфичен только для кур. 2 табл.

Штамм возбудителя кокцидиоза Eimeria maxima Л-3-2, депонированный в коллекции ГНУ ВНИВИП Россельхозакадемии под регистрационным номером КЭ №3, для производства вакцин, диагностикумов и проведения научных исследований.