ШТАММ Л-2-15 EIMERIA ACERVULINA (ВОЗБУДИТЕЛЯ КОКЦИДИОЗА) ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА ВАКЦИН, ДИАГНОСТИКУМОВ И ПРОВЕДЕНИЯ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ Российский патент 2011 года по МПК C12N1/20 A61K39/12 

Изобретение относится к ветеринарной паразитологии и биотехнологии, а точнее к производству диагностических и вакцинных препаратов против кокцидиоза кур, вызываемого Eimeria acervulina (E. acervulina), и проведению научных исследований.

Кокцидиоз кур имеет широкое распространение во всех странах, птицеводство терпит от него существенные потери.

Многие научно-исследовательские центры занимаются изучением как самого паразита, так и вызываемого им заболевания у птиц. Основной целью научных исследований, как правило, является получение знаний о возбудителе болезни и создание средств и методов диагностики, химио- и специфической профилактики вызываемого им заболевания.

Специфическая профилактика является одним из важных методов борьбы с кокцидиозом кур, используемых в птицеводстве. Технология производства и применения антикокцидийных вакцин такова, что используемые при их изготовлении штаммы должны обладать высокой иммуногенной активностью, не быть устойчивыми к действию различных кокцидиостатиков (химиопрепараты и ионофорные антибиотики).

К особенностям кокцидий вида Eimeria acervulina относится наличие иммуногенных различий у штаммов (1).

Известен ряд штаммов Е. acervulina (2, 3, 4). Эти штаммы выделены в других странах и используются при проведении научных исследований и производстве вакцин.

В России при проведении исследований обычно использовали не чистые штаммы различных видов кокцидий, а их смеси. Однако при разработке эффективных вакцин необходимо иметь чистые лабораторные штаммы возбудителя. Поэтому возникла необходимость выделения такого штамма Е. acervulina, который можно было бы использовать для указанных целей.

В качестве прототипа использован штамм Е. acervulina, описанный Edgar S.A. and Seibold C.G., 1964 (5).

Штамм только в высокой дозе вызывает у зараженных восприимчивых цыплят острое переболевание с характерными клиническими (угнетенный вид, взъерошенные перья, бледность гребешков и слизистых оболочек, жажда, отказ от корма, жидкий слизистый помет) и патологоанатомическими (у павших птиц отмечается незначительное утолщение стенки 12-перстной кишки, ленточные поражения или петехии на слизистой оболочке) признаками. У переболевших цыплят образуется иммунитет к повторному заражению.

Таблица 1 Характеристика прототипа Показатели   Размеры ооцист, мкм:   длина 17,7-20,2 (средняя 18,3) ширина 13,7-16,3 (средняя 14,6) Форма ооцист Овоидная Препатентный период,* ч 97 Место локализации в кишечнике Передняя половина тонкого кишечника Заражаемость XXX** Смертность X** Встречаемость Весьма обычен Течение заболевания, дни 6 Чувствительность к кокцидиостатикам Неизвестна * Время от заражения до начала выделения ооцист во внешнюю среду ** Х-ХХХХ - степень заражаемости и смертности

Однако у нас отсутствуют сведения об иммуногенности и чувствительности штамма Е. acervulina, описанного Edgar S.A. and Seibold C.G., 1964, к антикокцидийным препаратам.

Задачей изобретения является получение штамма Е. acervulina, обладающего высокими иммуногенными свойствами, чувствительного к кокцидиостатикам, а также с возможностью использования его для производства вакцин, диагностикумов и проведения научных исследований.

Поставленная задача достигается штаммом Л-2-15 Eimeria acervulina (возбудителя кокцидиоза) для производства вакцин, диагностикумов и проведения научных исследований.

Штамм Л-2-15 Eimeria acervulina выделен путем заражения восприимчивого цыпленка одной спорулированной ооцистой из материала, полученного от больных цыплят с одной из птицефабрик Ленинградской области. В лабораторных условиях изучены его иммунобиологические (морфологические, вирулентные, иммуногенные) свойства и чувствительность к антикокцидийным препаратам.

Штамм Л-2-15 Eimeria acervulina депонирован в коллекции Всероссийского научно-исследовательского ветеринарного института птицеводства Россельхозакадемии под номером КЭ №2.

Характеристика штамма Л-2-15 Eimeria acervulina

Систематическое положение. Штамм Л-2-15 Е. acervulina относится к роду Eimeria, семейству Eimeriidae, отряду Coccidiida.

Морфологическая характеристика. Ооцисты овоидной формы, длиной 14,0-23,0 мкм, шириной 13,0-18,0 мкм (средняя 18,7-14,6 мкм).

Биологические свойства. Препатентный период развития паразита составляет 96 часов. Место эндогенного развития паразита в кишечнике инвазированных цыплят - 12-перстная кишка и верхняя треть тонкого кишечника.

Клинические и патологоанатомические признаки. Характерны для данного вида.

Вирулентные свойства. При заражении 15-дневных цыплят ооцистами, хранившимися не более 2-х месяцев, в дозе 6 млн ооцист на голову летальность составляет не менее 30%.

Иммуногенные свойства. Заражение цыплят ооцистами вызывает формирование специфического иммунитета (гуморального и клеточного).

Культурально-биохимические свойства. Штамм Л-2-15 Е. acervulina не культивируется на питательных средах. Поддерживается путем пассирования на цыплятах, вызывая через 72 часа характерные поражения в кишечнике с выделением ооцист, начиная с 96-го часа после заражения.

Штамм чувствителен к антикокцидийным препаратам - ампролиуму, никарбазину, фармкокциду, химкокциду, клинакоксу, ко всем ионофорным антибиотикам.

Специфичность. Штамм Л-2-15 Е. acervulina специфичен только для кур.

Пример 1. Использование штамма Л-2-15 Е. acervulina для наработки вакцины против кокцидиоза кур

Для иммунизации птицы используются специально подобранные штаммы кокцидий, обладающие слабой вирулентностью и высокой иммуногенностью, в дозах, не вызывающих клинического переболевания кокцидиозом. Такими свойствами обладает штамм Л-2-15 Е. acervulina. Иммуногенный материал получают следующим образом. 14-дневных цыплят, свободных от кокцидий, заражают перорально ооцистами штамма Л-2-15 Е. acervulina из матричной расплодки в дозе 50 тысяч на 1 голову. На 5-8 сутки после заражения из собранного от цыплят помета выделяют ооцисты методом флотации в насыщенном растворе поваренной соли. Споруляцию ооцист проводят в 2%-ном растворе двухромовокислого калия при температурном режие 26±2°C в течение 3-5 суток. Спорулированные ооцисты штамма Л-2-15 Е. acervulina используют при изготовлении культуры кокцидий, предназначенной для вакцинации цыплят.

Вакцина против кокцидиоза представляет собой гомогенную стерильную смесь серовато-оранжевого цвета без посторонних примесей, плесени, неразбивающегося осадка, безвредную для цыплят. Пероральное применение культуры кокцидий вызывает субклиническое переболевание цыплят с последующим выделением ооцист во внешнюю среду, что создает возможность естественного реинвазирования хозяина и формирования у него иммунитета, напряженность которого может быть определена после контрольного заражения.

Пример 2. Изучение в экспериментальных условиях антикокцидийной активности препаратов

В настоящее время основным методом профилактики кокцидиозов кур является использование антикокцидийных препаратов. В связи с тем что длительное применение кокцидиостатиков вызывает появление резистентных форм паразитов, что существенно снижает эффективность химиопрофилактики, необходимо знать степень чувствительности лабораторных штаммов к применяемым препаратам. Кроме того, эффективность вновь синтезированных кокцидиостатиков также должна проверяться на чувствительных штаммах кокцидий с известной вирулентностью. К таким штаммам относится штамм Л-2-15 Е. acervulina.

Интактных цыплят заражают перорально ооцистами штамма Л-2-15 Е. acervulina в дозе ЛД₅₀ и сразу начинают давать с кормом изучаемые препараты. Наблюдения за птицей ведут в течение 10 дней. Для оценки антикокцидийной активности препарата используют показатели выживаемости и привесов, которые служат для определения противококцидиозного индекса (ПКИ)**.

Таблица 2 Сравнительная оценка эффективности различных кокцидиостатиков при заражении цыплят кокцидиями штамма Л-2-15 Е. acervulina Назначение групп Наименование препаратов Доза препарата, % к корму Доза ооцист, тыс. Процент           выживаемости привеса ПКИ Подопытная химкокцид 0,07 6000 100 81,2 190 Подопытная никарбазин 0,125 6000 100 79,7 188 Контрольная зараженная,
без препарата - - 6000 53,3 8,1 62 Контрольная незараженная 0 0 0 100 90,4 200

В данном опыте установлено, что и химкокцид, и никарбазин обладают выраженной антикокцидийной активностью при заражении цыплят кокцидиями штамма Л-2-15 Е. acervulina.

Таким образом, штамм Л-2-15 Е. acervulina обладает такими иммунобиологическими свойствами, которые позволяют использовать его для проведения научных исследований, а также в целях получения антигенного и иммуногенного материала, используемого для диагностики и специфической профилактики заболевания.

Источники информации

1. Joyner L.P. Immunological variation between two strains of Eimeria acervulina. Parasitology, 59 (3), 1969.

2. Long P.L. Studies on the relationship between Eimeria acervulina and Eimeria mivati. Parasitology, 67 (2), 1973.

3. Norton C.C., Joyner L.P. Studies with Eimeria acervulina and E.mivati: pathogenicity and cross-immunity. Parasitology, 81 (2), 1980.

4. Long P.L. and Rose M.E. Prospects for the control of coccidiosis by immunization. World's Poultry Sci. J. 38(2), 1982.

5. Edgar S.A., Siebold C.T. A new coccidium of chickens, Eimeria mivati sp.n. (Protozoa: Eimeriidae) with details of its life history. Journal of Parasitology 50 (2), 1964.

Изобретение относится к ветеринарной паразитологии. Штамм депонирован в коллекции ГНУ ВНИВИП Россельхозакадемии под регистрационным номером КЭ №2. Штамм используется для производства вакцин, диагностикумов и проведения научных исследований. Штамм специфичен только для кур, обладает высокими иммуногенными свойствами, чувствителен к кокцидиостатикам. 2 табл.

Штамм возбудителя кокцидиоза Eimeria acervulina Л-2-15, депонированный в коллекции ГНУ ВНИВИП Россельхозакадемии под регистрационным номером КЭ №2, для производства вакцин, диагностикумов и проведения научных исследований.