СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММУННОЙ СЫВОРОТКИ Советский патент 1994 года по МПК A61K39/395 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способам получения моноспецифических сывороток к тейхоевым кислотам (ТК) стафилококков, и может быть использовано для дифференциальной диагностики стафилококковой инфекции.

Известен способ получения иммунных сывороток, включающий введение антигена в смеси с адъювантом Фрейнда в оба подколенных лимфоузла с повторной иммунизацией через месяц без адъюванта внутривенно, внутримышечно.

Однако, данным способом невозможно получить моноспецифические сыворотки к ТК.

Целью изобретения является получение моноспецифической сыворотки к ТК стафилококков.

Это достигается внутривенным введением кроликам ТК, конюъгированных с аутологической кровью.

П р и м е р 1. Для получения ТК используют штаммы Wood - 46 и ССМ 2124 S. epidermidis, полученных из международных коллекций. Штаммы выращивают в течение 18-20 ч на плотной питательной среде, следующего состава: агар Хоттингера, дрожжевой экстракт, гидролизат казеина и глицин. Микробные клетки в концентрации 10^11,4/мл разрушают стеклянными микрошариками Ballotini N 11 в гомогенизаторе L-17. Неразрушенные клетки, оставшиеся после дезинтеграции, удаляют 10-минутным центрифугированием при 14-16 тыс. об/мин 20-30 мин при 4^оС.

Для инактивации уралитических ферментов клеточные стенки прогревают в водяной бане при 100^оС 16 мин. Клеточные стенки обрабатывают 1М NaCl в течение 16-18 ч при 4^оС с последующим удалением ионов хлора пятикратным отмыванием дистиллированной водой с помощью центрифугирования при 14-16 тыс. об/мин 30 мин при 4^оС. Затем клеточные стенки подвергают воздействию 0,1% тритона Х-100 30 мин при 30^оС для освобождения от белков цитоплазматической мембраны с трехкратным отмыванием дистиллированной водой для удаления остатков тритона, с последующим воздействием ферментов: трипсина - 20 ч, рН 7,2-7,4; 3 ч при 37^оС, РНКазы, ДНКазы - 3 часа, рН 7,8.

Экстракцию ТК из клеточных стенок проводят 10%-ной трихлоруксусной кислотой (ТХУ) в течение 16-18 ч при 4^оС при встряхивании.

Экстрагированные ТК отделяют от пептидогликана центрифугированием при 14-16 тыс. об/мин 30 мин при 4^оС.

К надосадочной жидкости по каплям добавляют пять объемов этанола, охлажденного до -20^оС, оставляют на ночь при -20^оС до образования осадка. Центрифугируют при 6 тыс. об/мин, 30 мин при 4^оС. Надосадочную жидкость отбрасывают, осадок растворяют в минимальном объеме 10% ТХУ и повторно переосаждают этанолом.

В препарате ТК, выделенной из штамма Wood-46 S.aureus содержание органического фосфора составляют 14-8%. Количественное содержание аминокислот и углеводов определяют методом жидкостной хроматографии. Кроме аланина, присутствующего в ТК, обнаружено до 0,37% примесей других аминокислот. Из присутствующих моносахаридов N-ацетилглюкозамин составлял 87,9%. Обнаружено наличие до 8% глюкозы.

Чистоту препарата определяют в реакции двойной диффузии (РДД) в геле с гомологичными сыворотками к вакцине S.aureus Wood-46. Получена одна полоса преципитации. Полоса не идентична линиям преципитации, которые образовывают с указанными сыворотками гомологичные пептидогликан и цитоплазма. Препарат ТК не реагировал с гетерологичными сыворотками.

ТК S.aureus используют для иммунизации кроликов.

П р и м е р 2. ТК S.epidermidis получают таким же способом, как в примере 1. В ТК, полученной из штамма ССМ 2124 S.epidermidis, обнаружено от 18 до 20% органического фосфора. Из моносахаридов выявлена только глюкоза (100%), а также небольшие примеси аминокислот (до 1,5%).

Приготовленный из S.epidermidis препарат образует одну полосу преципитации в реакции двойной диффузии в геле с гомологичными сыворотками к вакцине S.epidermidis CCM 2124. Полоса не идентична линиям преципитации, которые образуют с указанными сыворотками гомологичные пептидогликан и цитоплазма. Препарат ТК S.epidermidis не реагирует с гетерологничными сыворотками.

Полученные ТК S.epidermidis используют для иммунизации кроликов.

П р и м е р 3. Для иммунизации берут кроликов породы Шиншилла весом не менее 3 кг в возрасте 1,5-2 лет.

Для первой иммунизации дозу 500 мкг ТК S.aureus разводят в 0,7 мл стерильного физиологического раствора и перемешивают с помощью шприца с 0,7 мл НАФ до образования однородной белой пены. Полученный препарат вводят внутривенно по 0,1 мл в 9 точек вдоль позвоночника, в области поколенных лимфоузлов и внутрибрюшинно. Вторую иммунизацию проводят через две недели, 1,2 мг ТК разводят в 1 мл стерильного физиологического раствора, тщательно перемешивают с 1 мл НАФ и вводят по 0,2 мл внутривенно в 4 точки вдоль позвоночника, по 0,5 мл внутримышечно в ягодицы и 0,2 мл внутрибрюшинно. Спустя неделю берут кровь из сердца кролика в количестве 10 мл и добавляют к ней 500 единиц гепарина, 10 мл среды N 199 и 1,5 мг ТК. Смесь выдерживают при 37^оС 45 мин при постоянном перемешивании, а затем вводят в ушную вену 15 мл и внутрибрюшинно 5 мл. Эту же процедуру через неделю повторяют, но с дозой 2 мг ТК.

Кровь берут из ушной вены на 7 и 13 дни после последней иммунизации и проверяют на присутствие антител к ТК в ПДД в геле. Сыворотки против ТК S. aureus, взятые на 7 день, работают в разведении 1:8, а взятые на 13 день в разведении 1:256. Полученные сыворотки не дают преципитации с гетерологичными препаратами ТК в реакции двойной диффузии в геле, а также с гомологичными препаратами цитоплазмы и пептидогликана.

П р и м е р 4. Способ получения сывороток к ТК S.epidermidis такой же, как в примере 3. Сыворотки, полученные к ТК S.epidermidis, взятые на 7 и 13 дни после последней иммунизации, проверяют в РДД в геле. Сыворотки, взятые на 7 день, работают в разведении 1:8, взятые на 13 день в разведении 1:256. Полученные сыворотки не дают преципитации с гетерологичными препаратами ТК в ПДД в геле, а также с гомологичными препаратами цитоплазмы и пептидогликана.

П р и м е р 5. Из полученных моноспецифических сывороток выделяют гаммаглобулиновую фракцию и пpоверяют в ИФА и РНГА. Высокоочищенная ТК не реагируют с IgG, выделенными из моноспецифических сывороток к ТК, в реакции ИФА и РНГА, что подтверждает ее полисахаридную природу. В то же время целые клетки стафилококка работают в тест-системах ИФА и РНГА в концентрациях 10⁶-10⁷ клеток/мл. Клеточные стенки в тех же системах работают в концентрации 15-17 мкг/мл.

П р и м е р 6. Сыворотки к ТК исследовали на специфичность. IgG, выделенные из моноспецифической сыворотки, полученной к S.aureus, не реагировали в ИФА и РНГА с клеточными стенками S.epidermidis, а также с неочищенной ТК, выделенной из клеточных стенок стрептококка, вакциной пневмококка. ТК Bacillus subtilis и липосахаридом менингококка. IgG, выделенные из моноспецифичской сыворотки S.epidermidis не работали в ИФА и РНГА с неочищенной ТК стрептококка, вакциной пневмококка, ТК Bacillus sibtilis и липополисазаридом менингококка (см. таблицу).

П р и м е р 7. Кроликов заражают внутривенно 1 миллилитром культуры S. aureus и S.epidermidis в концентрации 10⁹ клеток-мл. В течение 3 ч у кролика берут кровь с интервалом 30 мин. Полученные сыворотки проверяют в ИФА и РНГА. Показано, что во всех пробах выявляются антигены, содержащие тейхоевые кислоты стафилококка. Показана возможность использования моноспецифических сывороток к ТК S.auereus и S.epidermidis для выявления антигенов в сыворотках животных.

П р и м е р 8. Тейхоевыми кислотами S.aureus и S.epidermidis в концентрациях 100-2000 мкг/мл сенсибилизируют эритроциты барана, обработанные танином и не обработанные. Показано, что ТК не взаимодействуют с поверхностью эритроцитов.

Предложенный способ иммунизации животных высокоочищенными тейхоевыми кислотами впервые дает возможность получить моноспецифические сыворотки к тейхоевым кислотам стафилококка.

Способ позволяет получить сыворотки, работающие в реакции двойной диффузии в геле в разведении 1:256, что свидетельствует о высоком титре антител в полученных сыворотках. Полученные из сывороток IgG специфичны и не дают перекрестных реакций в ИФА и РНГА с гетерологичными антигенами стафилококка, культурой пневмококка, неочищенной тейхоевой кислотой стрептококка, тейхоевой кислотой Bacillus subtilis и липополисахаридом менингококка. Моноспецифические сыворотки к тейхоевым кислотам S.aureus и S.epidermidis можно использовать для выявления стафилококков в биологических жидкостях.

Использование: в области биотехнологии. Цель: получение моноспецифических сывороток к тейхоевым кислотам стафилококков. Сущность изобретения: способ иммунизации состоит в том, что тейхоевые кислоты вводят кроликам внутрикожно с неполным адьювантом Фрейнда в разные точки двукратно с интервалом в две недели. Спустя неделю берут кровь из сердца кролика, смешивают с тейхоевой кислотой и гепарином и вводят внутривенно и внутрибрюшинно. Процедуру повторяют через неделю, увеличивая дозу тейхоевой кислоты в два раза. Положительный эффект: изобретение позволяет получать сыворотки, работающие в реакции двойной диффузии в геле в разведении 1 : 256, что свидетельствует о высоком титре антител в полученных сыворотках. Полученные из сыворотки IgG специфичны и не дают перекрестных реакций в ИФА и РНГА с гетерологичными антигенами стафилококка, культурой пневмококка, неочищенной тейхоевой кислотой стрептококка и др. 1 табл.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММУННОЙ СЫВОРОТКИ, включающий введение антигена в смеси с адъювантом Фрейнда в подколенные лимфоузлы и повторную иммунизацию антигеном внутримышечно и внутривенно с последующим выделением сыворотки, отличающийся тем, что, с целью получения моноспецифической сыворотки к тейхоевой кислоте стафилококков, в качестве антигена используют тейхоевую кислоту стафилококков, которую вводят внутривенно с аутологичной кровью, обработанной гепарином.