СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЦИТОТОКСИЧНОСТИ МАЛОРАСТВОРИМЫХ ПЫЛЕЙ Российский патент 1994 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к медицине, а именно к гигиене и токсикологии и касается сравнительной экспериментальной оценки способности пылевых частиц к повреждению макрофагов, именуемой цитотоксичностью, в качестве одного из подходов у ускоренной гигиенической регламентации промышленных аэрозолей.

Регламентация аэрозолей преимущественно фиброгенного действия, в соответствии с принятой методологией, основана на определении места предельно допустимой концентрации (ПДК) регламентируемого аэрозоля в фиксированном диапазоне величин соответственно их сравнительной фиброгенности. Для ускоренной оценки этого места используются данные об их сравнительной цитотоксичности. Последнее оправдано тем, что для малорастворимых пылевых частиц существует определенная корреляция между цитотоксичностью и способностью вызывать развитие пневмокониоза, основанная на зависимости как механизмов длительной задержки этих частиц в легких, так и других патогенетических механизмов развития заболевания от степени повреждения макрофагов.

Сравнительный принцип широко применяется также для ускоренной регламентации вредных веществ общетоксического действия: например, в рядах близких по строению соединений или при решении вопроса о возможности установления групповой ПДК для всех или значительной части применяемых соединений одного и того же токсического элемента. При этом обычно ориентируются на сравнение параметров острой токсичности (ЛД₅₀, порог острого действия), однако для токсических аэрозолей эти параметры недостаточно надежны, а для малорастворимых аэрозолей, к которым, в частности, относятся имеющие особое значение для промышленности оксиды металлов и композитные материалы на их основе, в целом ряде случаев вообще не могут быть определены. В этих случаях адекватным вариантом того же сравнительно-токсикологического принципа ускоренной регламентации является сравнительная оценка цитотоксичности регламентируемых аэрозолей для макрофагов.

Общей особенностью всех указанных подходов к гигиенической регламентации является то, что они исключают классификацию регламентируемых веществ по каким-либо диапазонам абсолютных значений используемых параметров токсичности, фиброгенности или цитотоксичности, а основаны исключительно на сравнении величин, относящихся к вновь изучаемому и к ранее регламентированным веществам. В частности, сравнительная оценка цитотоксичности проводится либо путем исследования тех или иных показателей клеточной реакции организма, либо чаще всего путем измерения тех или иных показателей (определенной ферментной активности, хемолюминесценции, жизнеспособности по невключению красителя, релиза предварительно фиксированной радиометки и др.) в культуре изолированных макрофагов или макрофагоподобных клеток после инкубации ее в течение фиксированного времени с фиксированными дозами сравниваемых (вновь изучаемых и эталонных) пылевых суспензий. Все эти тесты на сравнительную цитотоксичность ин витро могут рассматриваться как аналоги предлагаемого способа. Вместе с тем, каждому тесту присущи свои ограничения и возможности артефактов, и поэтому общей тенденцией развития методологии ускоренной гигиенической регламентации является создание адекватного набора ("батареи") взаимодополняющих тестов. Например, были приведены 4 теста на цитотоксичность пылевых частиц, основанные на различных эффектах их действия на клеточную культуру или ин виво, что далеко не исчерпывает все подобные тесты, описываемые в литературе.

Как было указано, некоторые из этих тестов основываются на оценке угнетения тех или иных макрофагальных ферментов при инкубации клеток с цитотоксичными частицами. Наиболее широко известен тест на способность частиц к подавлению суммарной дегидрогеназной или ТТС-редуктазной активности макрофагов, который и может рассматриваться в качестве прототипа предлагаемого способа. Тест основан на снижении способности дегидрогеназ жизнеспособных макрофагов восстанавливать 2,3,5-трифенилтетразолиумхлорид с образованием окрашенного продукта - формазана. К недостаткам данного прототипа относятся значительная зависимость развития цветной реакции от рН среды (что нередко дает завышенные результаты при испытании минеральных пылей, содержащих щелочные примеси) и то неустранимое обстоятельство, что при разрушении части клеток тест-культуры цитотоксичной пылью образующиеся продукты разрушения макрофага (ПРМ) оказывают активирующее действие на клетки, еще сохраняющие жизнеспособность.

Одним из проявлений этой активации, как показано в специальных экспериментах с внесением ПРМ в культуру жизнеспособных макрофагов, является существенное повышение их ТТС-редуктазной активности. В результате итоговое снижение ТТС-редуктазной активности культуры макрофагов, инкубируемой с цитотоксичной пылью, (по сравнению с параллельной контрольной) не полностью соответствует степени ее повреждения, и пыли существенно, неодинаковой цитотоксичности могут различаться недостаточно четко, причем иногда имеет место даже парадоксальное повышение активности этого фермента.

Этот недостаток является общим для всех тестов, в которых действие цитотоксичной пыли на макрофаги оценивается по показателю, испытывающему противонаправленные сдвиги при повреждении и при активации клеток культуры. Если же оба эффекта сдвигают используемый показатель в одном направлении, то дискриминирующая способность теста повышается, поскольку более цитотоксичная пыль по сравнению с менее цитотоксичной вызывает более выраженный сдвиг показателя как за счет повреждения и гибели одной части клеток, так и за счет вторичной активации другой. Именно это преимущество используется в предлагаемом изобретении.

Цель изобретения - повышение чувствительности и надежности сравнительной оценки цитотоксичности пылей.

Данная цель достигается благодаря использованию в качестве показателя цитотоксичности при действии определенной дозы пыли на культуру макрофагов - снижения активности фермента 5'-нуклеотидазы. Предложенный способ основан на том, что указанная активность может снижаться как в результате уже самого начального повреждающего действия пылевых частиц на клетку (ввиду того, что 5'-нуклеотидаза локализуется на наружной поверхности цитоплазматической мембраны, которая и приходит в первое соприкосновение с пылевыми частицами), так и в результате вторичной активации жизнеспособных клеток в культуре при действии на них продуктов разрушения поврежденных. Этот механизм снижения ферментной активности, подтверждаемый описываемым ниже специальным экспериментом, обусловлен тем, что ингибирование 5'-нуклеотидазы является одним из ключевых механизмов физиологической активации макрофага и часто используется именно в качестве показателя последней (Edelson, 1981).

Способ осуществляется следующим образом.

Перитонеальные макрофаги получают у крыс через 48 ч после внутрибрюшинного введения 10-15 мл стерильного вазелинового масла путем промывания брюшной полости стерильным физраствором. Полученную промывную жидкость центрифугируют при 550 g в течение 5 мин, клеточный осадок дважды промывают физраствором с повторным центрифугированием и ресуспендируют в среде, содержащей 0,05 моль трис(оксиметил)аминометана, 0,004 моль хлорида магния и 0,15 моль хлорида калия. Активность 5'-нуклеотидазы определяется по отщеплению неорганического фосфата от аденозинмонофосфата (АМФ) при параллельном контроле на активность неспецифических фосфатаз, в качестве субстрата которых используется Na-β-глицерофосфат (ГФ). Этот метод определения известен.

Для оценки цитотоксичности каждая проба пыли испытывается в 5-10 параллельных повторностях, причем наряду с вновь изучаемыми испытываются пылевые частицы, известные своей высокой или низкой цитотоксичностью.

В пробирку, содержащую 1 мл среды с 0,002 моль АМФ, и в пробирку, содержащую 1 мл среды с 0,002 моль ГФ, добавляют 0,5 мл суспензии макрофагов при концентрации 1,2 х 10⁷ клеток/мл на трис-буфере с рН 7,5 и 0,5 мл суспензии пылевых частиц в концентрации 20 мг/мл на том же буфере. Таким образом, проба содержит 3 х 10⁶ макрофагов и 5 мг пыли в 1 мл. В контрольные пробы вместо пылевой суспензии вносят по 0,5 мл трис-буфера. Все пробы инкубируют при 37^оС в течение 2,5 ч, фильтруют через бумажные фильтры средней плотности, и в фильтратах определяют содержание неорганического фосфора, для чего к 0,25 мл фильтрата каждой пробы добавляют 0,25 мл дистиллированной воды. 2,5 мл рабочего реагента (РР) и 0,5 мл восстанавливающего реагента (ВР). Для приготовления РР смешивают при объемном соотношении 2:2: 1 муравьиную кислоту плотностью 1,22, стабилизатор, представляющий собой раствор 300 мл глицерина в 700 мл дист.воды, и 1%-ный раствор молибдата аммония. Для приготовления ВР растворяют 0,178 г двухводного хлорида олова в 100 мл 1н., соляной кислоты.

Те же реагенты в той же последовательности вносят в 0,25 мл стандартного раствора К₂НРО₄, содержащего 10,0 г фосфора в 1 л. Пробы с реагентами выдерживаются в течение 30 мин при комнатной температуре для развития окраски и колориметрируются на спектрофотометре при 640 нм против смеси 0,25 мл трис-буфера; 0,25 мл воды, 2,5 мл РР и 0,5 мл ВР. Расчет в мкг отщепленного фосфора на 3 х 10⁶ макрофагов проводится по формуле
Е_оп/Е_ст х 40, где Е_оп и Е_ст - экстинкция опытной (или контрольной) и стандартной пробы, соответственно.

Для оценки активности 5'-нуклеотидазы из результата, полученного при анализе пробы с АМФ, вычитается результат анализа параллельной пробы с ГФ.

Показателем цитотоксичности пыли является выраженное в процентах снижение активности 5'-нуклеотидазы в культуре макрофагов, инкубировавшейся с данной пылью, по сравнению с активностью этого фермента в контрольной культуре без пыли. По средним для каждой исследуемой пыли значениям этого показателя устанавливается шкала сравнительной цитотоксичности, причем для обоснования предложений по ускоренной регламентации учитывается близость показателя цитотоксичности, характеризующего вновь регламентируемую пыль, к показателю, характеризующему пыль, для которой уже установлена величина ПДК (либо степень различия этих показателей).

Метод испытан для сравнительной оценки цитотоксичности ряда групп промышленных пылей в сопоставлении с оценкой, полученной при использовании других тестов из числа названных выше, в том числе теста на снижение жизнеспособности макрофагов по включению красителя трипановый синий, а также теста на снижение ТТС-редуктазной активности макрофагов (прототип). Концентрация пылевых частиц в пробах при использовании этих тестов также была равной 5 мг/мл, что укладывается в диапазон концентраций, рекомендуемых для них методическими рекомендациями.

В качестве иллюстрации приводятся результаты двух экспериментов (см. табл. 1 и 2). При использовании любых тестов сравнительная цитотоксичность изучавшихся пылей совпадает по рангу при использовании любых тестов, если сопоставляются пыли, резко отличающиеся по цитотоксической активности. В приведенных примерах такими заведомо являются диоксид титана (низкая цитотоксичность) и стандартный кварц DQ₁₂ (крайне высокая цитотоксичность). Вместе с тем, для пылей промежуточного диапазона тест на снижение активности 5'-нуклеотидазы может выявить различия там, где они выявляются на основе других методов оценки цитотоксичности пыли для клеточной культуры.

Из табл.1 видно, что снижение жизнеспособности макрофагов под влиянием хро- мата бария и диоксида марганца практически совпало, между тем как ин виво при сравнении тех же образцов ранее было показано, что диоксид марганца более цитотоксичен для альвеолярных легочных макрофагов. По снижению активности 5'-нуклеотидазы является определенное различие того же знака. Цитотоксичность пыли первоуральского кварцита по этому тесту значительно больше отличается от цитотоксичности пыли диоксида титана, чем по тесту на снижение жизнеспособности макрофагов. Это существенное различие более соответствует существенно неодинаковой фиброгенной активности данных пылей.

Таким образом, подтверждается высокая дискриминационная, и тем самым, прогностическая информативность предлагаемого теста как для токсичных, так и для преимущественно фиброгенных веществ.

Данные табл.2 иллюстрируют возможность ошибочных суждений на основании способа-прототипа: из всех исследованных пылей только высоко цитотоксичный стандартный кварц дал значимое снижение активности ТТС-редуктазы, в то время как при действии всех остальных она была не изменена или даже повышена, особенно при действии заведомо цитотоксичной кварцитной пыли. Напротив, и тест на снижение жизнеспособности, и тест на снижение активности 5'-нуклеотидазы четко свидетельствовали о высокой цитотоксичности всех 6 пылей, испытанных в этом эксперименте, при примерно одинаковом ранговом порядке.

То, что снижение активности 5'-нуклеотидазы обусловлено не только повреждением клеток, но и активацией неповрежденных макрофагов при действии на них пpодуктов разрушения макрофагов (ПРМ), подтверждено в дважды повторенном эксперименте. Исследовалось действие ПРМ, полученных повторным замораживанием и оттаиванием клеток. Так, в одном случае активность фермента в системе, состоящей из 3 х 10⁶ жизнеспособных и 1,2 ×10⁷ предварительно разрушенных макрофагов, равнялась 21,27 ±0,64 мкг фосфата, в то время, как активность параллельно инкубировавшихся 3 х 10⁶ жизнеспособных макрофагов - 10,78± 0,60 мкг и 1,2 х 10⁷ разрушенных - 18,75 ± 0,60 мкг. Сумма последних двух величин (29,53 ± 1,20 мкг) отличается от первой величины статистически значимо при Р < 0,001. Аналогичный результат получен во втором случае: активность в системе "макрофаги + РПМ" равнялась 36,16 ± 0,24 мкг, что значимо ниже суммы активностей в не соединенных компонентах системы (43,10 ± 0,88 мкг, Р < 0,001).

Таким образом, благодаря однонаправленности влияния на активность данного фермента обоих сопряженных эффектов действия цитотоксичных пылей на культуру макрофагов (т. е. как их повреждения, так и их активации) новый способ свободен от тех искажений шкалы сравнительной цитотоксичности разных пылей, которые может дать способ-прототип. В этом отношении предлагаемый способ не уступает наиболее широко применяемому аналогу, каким является оценка цитотоксичности пыли по снижению жизнеспособности макрофагальной культуры, не зависящему от активирующего действия продуктов макрофагального разрушения, а для некоторых пылей, как было показано, дискриминирующая способность (чувствительность) нового способа выше.

Использование: в медицине, гигиене и токсикологии. Сущность изобретения: для определения цитотоксичности пылевой суспензии определяют степень вызываемого ею подавления активности 5′ -нуклеотидазы при кратковременной инкубации с культурой крысиных перитонеальных макрофагов. Способ позволяет повысить точность анализа. 2 табл.

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЦИТОТОКСИЧНОСТИ МАЛОРАСТВОРИМЫХ ПЫЛЕЙ, включающий инкубацию крысиных перитонсальных макрофалов с равными дозами различных пылей и регистрацию измерения активности фермента-маркера по сравнению с контролем, отличающийся тем, что, с целью повышения точности способа, в качестве фермента-маркера используют 5'-нуклеотидазу, а о цитотоксичности судят по снижению активности 5'-нуклеотидазы.