СПОСОБ ПРЕДВАРИТЕЛЬНОГО ОТБОРА ВЕЩЕСТВ, ОБЛАДАЮЩИХ ЗАЩИТНЫМ ДЕЙСТВИЕМ ПРИ ОСТРЫХ ИНТОКСИКАЦИЯХ ЯДАМИ-ОКСИДАНТАМИ Российский патент 1997 года по МПК G01N33/53 A61K47/10 

Изобретение относится к области медицины, а именно к токсикологии, и касается ускоренного прогнозирования защитного действия химических веществ против повреждения организма ядами-оксидантами, осуществляемого с целью первичного отбора (скрининга) протекторов-антиоксидантов.

Целенаправленный поиск эффективных протекторов из числа известных или вновь синтезируемых веществ требует первоначального проведения скрининговых испытаний на основе кратковременных нетрудоемких тестов. Наиболее распространено прямое испытание всех таких препаратов на организменном уровне в условиях действия какого-либо яда-оксиданта на лабораторных животных /Elgayed N. M. Mustafa M. Y. 1982 с др./, которое не отвечает указанным условиям скринингового теста. Второй подход, реализуемый в различных вариантах, состоит в измерении антиоксидантных свойств испытываемых препаратов на неклеточной модельной системе, что может рассматриваться в качестве прототипа заявляемого способа. А. Г. Одынец и соавт. (1986) предложили использовать для скрининга антиоксидантов тест на торможение перекисного окисления липидов (ПОЛ), индуцированного внесением прооксиданта (метгемоглобина или тетрахлорметана) в модельную систему, содержащую липосомы фосфатидилхолина или печеночный гомогенат.

К недостаткам этого прототипа относится следующее:
1. Неклеточная модель дает возможность оценить лишь антиоксидантные свойства вещества, но не дает представления о том, является ли оно в соответствующей концентрации цито- и органопротектором или, напротив, само оказывает токсическое действие.

2. Моделирование ПОЛ на фосфолипидных липосомах не вполне адекватно воспроизводит процесс, происходящий "ин виво", который включает в себя, помимо прямой pеакции кислорода с ненасыщенными жирными кислотами, также ряд ферментативных механизмов. Использование печеночного гомогената лишь частично устраняет этот недостаток, поскольку нарушение субклеточных структур нарушает нормальное функционирование ферментных систем.

3. Метод требует использования дорогостоящей аппаратуры и дефицитных реактивов.

Задача изобретения создание краткосрочного малотрудоемкого и недорогостоящего способа отбора препаратов, могущих обладать защитным действием против ядов-оксидантов. Эта задача решается путем оценки цитопротекторного эффекта испытываемых веществ для культуры крысиных перитонеальных макрофагов, оксидантное повреждение которых моделируется путем инкубации с частицами стандартного диоксида кремния.

Такая инкубация макрофагов с диоксидом кремния и предполагаемым веществом-цитопротектором ранее была предложена для поиска препаратов с возможным противосиликотическим действием (методические рекомендации Минздрава СССР от 19.03.86. "Методические подходы к выбору и экспериментальным испытаниям средств патогенетической терапии и профилактики пневмокониозов"), однако в целях отбора веществ, обладающих антидотным действием при отравлениях ядами-оксидантами, эта модель не использовалась и не предлагалась. Теоретической предпосылкой к такому использованию является возможная роль усиления ПОЛ и других свободнорадикальных окислительных процессов в качестве механизмов кварцевого повреждения макрофага. Показано, в частности, что при различных дозах и временных интервалах действия диоксида кремния на культуру макрофагов между усилением ПОЛ и повреждением клеток существует тесная корреляция (Н. С. Кислицина, 1986).

Способ осуществляется следующим образом:
У белых лабораторных крыс одного возраста и пола (предпочтительно одной линии) через 48 ч после асептического внутрибрюшинного введения 10 мл стерильного вазелинового масла промывают брюшную полость стерильным физиологическим раствором. Полученную клеточную взвесь дважды отмывают с 10-минутным центрифугированием при 700, причем в первый раз клетки ресуспендируют в физ. растворе, а во второй в среде для последующей инкубации: 0,05 М трис-НС буфере, содержащем 0,15 М КС. Клетки, полученные от нескольких крыс, объединяют, доводя взвесь до концентрации 1,2х10⁷ клеток в мл. Для моделирования кварцевого повреждения используется тонкодисперсный порошок кварца, доведенный растиранием и отмучиванием до практического отсутствия частиц крупнее 5 мкм. Такой пылевой препарат должен использоваться в качестве постоянного (стандартного) в лаборатории, проводящей тестирование, либо используется один из широко распространенных эталонных образцов высоко- цитотоксичного кварца, например DQ₁₂. Порошок суспендируется в среде инкубации указанного состава в концентрации 8 мг/мл. Испытываемое вещество готовят в концентрациях 4х10^-3 М, 4х10^-4 М и т.д. в той же среде. В каждую опытную пpобу вносят 0,5 мл клеточной суспензии, 0,25 мл кварцевой суспензии и 0,25 мл раствора вещества в одной из испытываемых концентраций. Параллельно из того же клеточного пула ставят контрольные пробы с кварцем, в которые вместо испытуемого вещества вносят 0,25 мл инкубационной среды, и контрольные бескварцевые пробы (0,5 мл клеточной суспензии +0,5 мл инкубационной среды).

Все пробы помещают на 90 мин в термостат при 37^oС, после чего к каждой добавляют по 0,1 мл 0,5% раствора красителя "трипановый синий". Через 3 мин порция каждой пробы помещается в счетную камеру Горячева, и под микроскопом при увеличении х400 подсчитывается процент окрасившихся, т.е. потерявших жизнеспособность клеток. Эксперимент проводится в 5-10 повторностях.

Степень статистически значимого снижения среднего процента нежизнеспособных клеток при различных концентрациях испытываемого вещества по сравнению с соответствующим показателем при действии одного кварца используется как критерий для прогнозирования защитного эффекта. В случае положительного результата ставится дополнительный тест для оценки собственной цитотоксичности испытываемого вещества по повышению процента нежизнеспособных клеток при инкубации макрофагов без кварца (0,5 мл клеточной суспензии) с 0,25 мл того же вещества в эффективных концентрациях и 0,25 мл инкубационной среды по сравнению с указанной выше контрольной бескварцевой пробой.

В качестве иллюстрации применения заявляемого способа может быть приведен следующий пример. На описанной выше модели с использованием стандартного кварца DQ₁₂ испытывалось противокварцевое цитопротекторное действие семи водорастворимых веществ, синтезированных на основе этилимидазола. В другой лаборатории независимо оценивалось защитное действие этих же веществ при однократной острой затравке крыс диоксидом азота, который использован в качестве классического яда-оксиданта,вызывающего резкое усиление реакций пероксидации в легочной ткани с повреждением клеточных и внутриклеточных (мембранных) структур (например, М. Sagai et al, 1984, 1987).

Крысы подвергались в течение 1 ч однократному воздействию диоксида азота в концентрации 700 мг/м³. За 30 мин до затравки им вводили внутрибрюшинно испытываемые препараты в эквималярной дозировке, которая (при условии равномерного распределения в организме) примерно соответствует концентрации 10^-4 М в клеточной среде. Контрольной затравлявшейся группе крыс вводили в/б по 0,1 мл физиологического раствора на 10 г массы тела. Показателем эффективности препарата служило статистически значимое снижение летальности крыс после затравки.

Сопоставление основных результатов двух экспериментов приводится в таблице. Как видно при таком сопоставлении 5 препаратов из испытанных 7 дали статистически значимое повышение резистентности макрофагов "ин витро" к цитотоксическом действию кварца и, вместе с тем, снижение летальности при острой ингаляционной затравке диоксидом азота (в 4 случаях из 5 в статистически значимое). Остальные 2 препарата обладали статистические не значимым либо нулевым защитным действием в обоих тестах. Хотя не прослеживается четкой количественной корреляции между степенью защитного действия "ин витро" и "ин виво" в группе препаратов, обладающих таким действием вообще, однако для целей скрининга, т. е. для разграничения тех веществ, которые могут им обладать и, тем самым, заслуживают дальнейшего изучения, и тех, для которых оно явно нецелесообразно, предложенный тест на макрофагах вполне эффективен. Собственное статистически значимое повреждающее действие препаратов на культуру даже при их концентрации 10^-3 М наблюдалось только в одном cлучае (препарат СА-26-821 не обладающий защитным действием).

Использование: изобретение относится к области медицины, а именно к токсикологии, и касается ускоренного прогнозирования защитного действия химических веществ против повреждения организма ядами -оксидантами для первичного отбора протекторов-антиоксидантов. Цель: создание краткосрочного малотрудоемкого способа отбора препаратов такого действия на основе оценки их цитопротекторного эффекта для культуры макрофагов, оксидантное повреждение которых моделируется путем их инкубации с частицами стандартного диоксида кремния. Сущность изобретения состоит в получении культуры крысиных перитонеальных макрофагов, инкубации ее с кварцевой суспензией в постоянных условиях в присутствии испытываемых веществ в различных молярных концентрациях или в их отсутствии, определении процента нежизнеспособных клеток, окрашивающихся трипановым синим, и завершающем отборе для испытания в качестве протекторов при ингаляционном отравлении газами-оксидантами только тех веществ, которые дали статистически значимое снижение этого эффекта в тех концентрациях, в которых они сами не обладают существенной цитотоксичностью для той же клеточной системы. Положительный эффект: способ позволяет значительно сократить расходы труда и средств на прямое испытание антитоксической эффективности предполагаемых защитных препаратов в ингаляционных экспериментах на животных и сделать такое испытание более целенаправленным и эффективным. 1 табл.

1 Способ предварительного отбора веществ, обладающих защитным действием при острых интоксикациях ядами-оксидантами, включающий испытание их на биологической модели in vitro, отличающийся тем, что на биологической модели in vitro определяют цитопротекторную эффективность веществ путем одновременной инкубации с их растворами и со стандартной кварцевой суспензией культуры крысиных перитонеальных макрофагов, после чего добавляют в полученную пробу краситель и подсчитывают под микроскопом процент окрасившихся, т.е. потерявших жизнеспособность, клеток при снижении их среднего процента при различных концентрациях испытываемого вещества, относительно соответствующего показателя при действии только кварца отбирают вещество как обладающее защитным действием при острых интоксикациях ядами-оксидантами.