СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОИЗВОДНОГО ГЕМАТОПОРФИРИНА В ЛИОФИЛИЗИРОВАННОЙ ФОРМЕ Российский патент 1994 года по МПК A61K31/40 

Изобретение относится к лиофилизированным композициям, содержащим опухольизбирательные порфириновые соединения и предназначенным для использования в фотодинамической терапии, в частности изобретение относится к лиофилизированным композициям, содержащим препарат простого/сложного эфира полигематопорфирина, известного как фотофрин II^Rи к способам получения указанного лиофилизированного препарата.

Фетодинамическая терапия, использующая порфирины и родственные соединения, давно применяется специалистами. Уже в 1940 г было известно, что порфирин обладает способностью к флуоресцированию в опухолевой ткани. Очевидно, локализуясь в опухолевой ткани, порфирины абсорбируют свет на определенных длинах волн, а затем излучают его, и тем самым, путем локализации флуоресценции, способствуют обнаружению опухоли. В соответствии с этим препараты, содержащие порфирины, обычно используются для диагностики и обнаружения опухолевой ткани. Кроме того, порфириновые соединения также обладают способностью к разрушению опухолевой ткани при облучении на определенной длине волны, возможно, посредством образования синглетного кислорода (Weishaupt, K.P., et al, Cancer Research (1976) p. 2326-2329).

Было установлено, что при систематическом введении светопоглощающие соединения, в частности соединения, родственные порфиринам, могут быть использованы для лечения опухолей. Использование указанных соединений основано на их способности к локализации в опухолевой ткани, в результате чего ее можно отличить от окружающей нормальной ткани (см. например, Dougherty, T. Т. et al., "Cancer: Principles and Practice of Oncology" 1982. v.T. de Vita. Ir. et al., eds., p. 1836-1844).

Кроме того, в последних публикациях помимо использования указанных соединений для лечения опухолей было предложено альтернативное их применение. Известно использование порфиринов для лечения кожных заболеваний, фотосенсибилизирующие соединения, а именно фурокурамин и их производные, используются для стерилизации биологических проб, содержащих инфецирующие организмы, такие, как бактерии и вирусы. Известны фотосенсибилизирующие порфирины, использующиеся для обнаружения и лечения атеросклеротических бляшек. Кроме того, известно использование меченных порфириновых соединений для визуализации опухолей.

Препараты, содержащие фотосенсибилизатор например, неочищенные производные гематотропина, называемые также HpD, или производные Липзона, широко используются на ранних стадиях фотодинамической терапии. В публикациях широко освещалось использование этого препарата и его производного при лечении злокачественных опухолей (Cancer Res. (1978) : 2628-2635; I. Natl. Cancer Inst. (1979) : 231-237).

Dougherty и его соавторы получили более эффективную форму производного гематопорфина путем ультрафильтрации HpD в целях снижения содержания низкомолекулярных частиц. Упомянутая форма описываемого лекарственного средства является сложной смесью, содержащей порфириновые элементы, соединенные простыми эфирными связями (Dougherty, T.T. et al., Adv. Exp. Med. BioI. (1983) : 3-13) и сложными эфирными связями (KesseI, D. et al., Photochem. Photobi oI. (1987) : 463-568). Указанная сложная смесь, называемая в описании полигематопорфириновые простые/сложные эфиры PHE и доступная под торговой маркой фотофрин II^R, является предметом изобретения.

В настоящее время PHE используется в виде раствора 2,5 или 5 мг/мл, содержащего PHE в нормальном физиологическом растворе. Под действием тепла PHE легко разлагается и поэтому является относительно нестабильным при комнатной температуре. Следовательно, для поддержания его активности раствор должен содержаться в замороженном состоянии. Более того, указанный раствор обнаруживает тенденцию к образованию макрочастиц при повышенных температурах, что делает его непригодным для использования в качестве инъецируемого раствора и еще раз свидетельствует о том, что его необходимо держать в замороженном состоянии и оттаивать непосредственно перед употреблением.

Однако использование такого замороженного раствора имеет множество недостатков. Эти недостатки связаны с необходимостью хранения и транспортировки указанного продукта в замороженном состоянии, что влечет за собой необходимость обеспечения специальных условий замораживания. Например, транспортировка должна осуществляться в специальных контейнерах с использованием сухого льда или других хладагентов. И это является главным недостатком указанного продукта, что делает его дорогостоящим и вызывает значительные затруднения в его поставке. Для дальнейшего применения указанный замороженный раствор должен храниться при -20^оС, что значительно ниже рабочих температур некоторых холодильников, в результате чего хранение этого раствора требует специального охлаждающего устройства. Кроме того, для размораживания указанного продукта требуется определенное количество времени и поэтому он не может быть немедленно использован по назначению.

В соответствии с указанным очевидно, что необходимо создать препарат, который был бы стабильным при комнатной температуре в течение длительного периода времени и не требовал бы специальных условий замораживания, а следовательно, хранения и транспортировки.

Специалистам в этой области известно, что при лиофилизации продукта, который является относительно нестабильным в водном растворе, можно получить стабилизированный продукт, т. е. продукт, обладающий большей устойчивостью при хранении, чем водный раствор. Кроме того, лиофилизированный продукт имеет то преимущество, что он может находиться в виде быстрорастворимого порошка и поэтому может быть легко приготовлен для введения в виде инъекции. Другим преимуществом лиофилизации нестабильного в водном растворе продукта является возможность его обработки и наполнения в лекарственные формы в жидком состоянии, высушивания при низких температурах, что исключает неблагоприятные тепловые воздействия, и хранения в сухом состоянии, при котором этот продукт является более стабильным (см. Remin gton's Parmaceutical Sciences, 15th edition, 1975, p. 1483-1485). Таким образом, лиофилизация является идеальным способом получения препарата PHE, который обладает устойчивостью при комнатной температуре и поэтому не требует хранения в условиях замораживания.

Известен препарат, содержащий производное гематопорфирина, предназначенный для наружного применения при лечении псориаза и других кожных заболеваний и полученный путем лиофилизации 5 мг/мл физиологического раствора PHE c добавлением приемлемого для наружного употребления наполнителя.

Хотя лиофилизация замороженного солевого раствора PHE может быть использована в целях получения продукта для наружного употребления, однако при лиофилизации солевого раствора возникают определенные трудности и полученный в результате продукт является непригодным для инъекций. При попытках получения лиофилизованного концентрированного солевого раствора, содержащего 15 мг/мл PHE и 5,4% хлорида натрия (присутствие хлорида натрия необходимо для получения изотонического раствора после разбавления водой для инъекций в целях образования 2,5 мг/мл раствора PHE, наблюдалось частичное осаждение (высаливание) активного ингредиента PHE. Кроме того, вследствие указанного осаждения чрезвычайно трудно осуществить фильтрацию концентрата, так как эта процедура требует частой смены фильтров. И к тому же с фильтром часто удаляется некоторое количество активного ингредиента. Более того, лиофилизированный продукт является негомогенным и состоит из отдельных фаз: PHE и хлорида натрия. Разделение этих фаз, вероятно, происходит во время замораживания, в результате различной кристаллизации.

Альтернативно может быть лиофилизован солевой раствор, содержащий 2,5 мг/мл PHE, но процесс лиофилизации занимает слишком много времени, так как требуется удалить большее количество воды. Кроме того, проблемы фильтрации и осаждения остаются неразрешенными вследствие присутствия в растворе хлорида натрия.

В связи с указанным необходимость получения препарата PHE, который являлся бы стабильным при комнатной температуре в течение длительного периода времени и лиофилизация которого была бы свободна от недостатков, связанных с лиофилизацией солевого водного раствора, является совершенно очевидной.

Целью изобретения является способ получения препарата PHE, являющегося относительно нестабильным в водном растворе, таким образом, что указанный препарат становится стабильным при комнатной температуре в течение продолжительного периода времени.

Другой целью изобретения является получение препарата PHE, который был бы гомогенным и пригодным для инъекцирования.

Кроме того, целью изобретения является способ лиофилизации РНЕ-раствора, который не имел бы недостатков, связанных с лиофилизацией солевого РНЕ-раствора.

В основе изобретения лежит получение композиции фотосенсибилизатора РНЕ, являющейся устойчивой при комнатной температуре в течение длительного периода времени, путем лиофилизации. Кроме того, устранение недостатков, связанных с лиофилизацией солевого раствора РНЕ, может быть осуществлено путем удаления хлорида натрия из раствора и лиофилизации РНЕ из водного раствора с последующим разведением в несолевом растворе, таком, как 5%-ный инъекционный раствор декстрозы.

Было обнаружено, что препарат полигематопорфиринового сложного/простого эфира, являющийся стабильным при комнатной температуре в течение продолжительного периода времени, может быть получен путем лиофилизации фотосенсибилизатора из несолевого раствора с последующим разбавлением лиофилизированного продукта несолевым разбавителем. Изобретение относится к способу получения лиофилизированного РНЕ, который может быть легко осуществлен из-за небольшого первоначального объема, причем указанный способ позволяет избежать осаждения РНЕ-компонента и в результате получить гомогенный продукт.

Описание активного ингредиента РНЕ, рассматриваемого в изобретении, и способ его получения можно найти в патенте США N4649151.

В соответствии с изобретением, лиофилизированный препарат РНЕ получают из концентрата, содержащего приблизительно 15 мг/мл РНЕ в воде. Этот концентрат затем подвергают процессу лиофилизации и в результате получают продукт, который является пригодным для хранения и транспортировки. Затем лиофилизированный продукт непосредственно перед его использованием разбавляют достаточным количеством несолевого разбавителя, такого, как 5%-ный инъекционный раствор декстрозы, в целях получения изотонического 2,5 мг/мл раствора для лечения или диагностики заболеваний.

В предпочтительном осуществлении изобретения, приблизительно 5 мл концентрата, содержащего около 15 мг/мл РНЕ, помещают в пробирку, подходящую для проведения лиофилизации. Таким образом, каждая пробирка содержит меченый образец 75 мг простых/сложных эфиров полигематопорфирина. Затем каждую 5 мл пробирку охлаждают в камере для лиофилизации в течение достаточного периода времени до температуры -35^оС или ниже до получения полностью замороженного продукта. Затем продукт лиофилизируют при повышенной температуре до тех пор, пока не получат продукт с достаточным содержанием влаги, после чего давление в камере доводят до атмосферного, а пробирки герметизируют. Благодаря небольшому исходному объему (5 мл) процесс лиофилизации продукта протекает довольно быстро, обычно за 24 ч. Указанная процедура является значительно менее дорогостоящей, чем процедура лиофилизации с использованием больших объемов, содержащих большее количество разбавленного раствора. Полученный в результате продукт может затем храниться при комнатной температуре в течение более 6 месяцев, сохраняя при этом свою активность. Перед употреблением, т.е. введением пациенту, лиофилизованный продукт разбавляют 30 мл 5%-ного инъекционного раствора декстрозы, получая тем самым изотонический 2,5 мг/мл раствор.

Предпочтительным разбавителем, используемым для восстановления лиофилизированного продукта, является 5% -ный инъекционный раствор декстрозы, однако могут быть использованы и другие разбавители, не содержащие солей, например стерильная вода для инъекций.

При разбавлении лиофилизированного продукта нормальным солевым раствором и после фильтрации с использованием 0,2 мкм фильтров под оптическим микроскопом наблюдается большое количество нежелательных макрочастиц. А при восстановлении продукта с помощью инъекционного раствора декстрозы значительных образований макрочастиц не наблюдалось. Поэтому желательно использовать несолевой растворитель.

В соответствии с изобретением в препарат, содержащий рассматриваемый продукт, могут быть включены и другие ингредиенты. Такими ингредиентами могут быть буферы, влияющие на рН раствора, смачивающие или эмальгирующие агенты, противомикробные средства и/или предохраняющие средства, по необходимости. В целях улучшения характеристик лиофилизированного осадка могут быть добавлены неэлектролитические наполнители, такие, как маннит или декстроза. Наряду с указанными наполнителями могут быть также включены и другие приемлемые наполнители, выбранные самим специалистом в соответствии с описанием изобретения. Само собой разумеется, что возможные варианты осуществления изобретения не должны выходить за рамки объема изобретения.

Приведенные примеры иллюстрируют сравнение лиофилизированного препарата с замороженным раствором, применяющимся в настоящее время. Однако указанные примеры не должны ограничивать возможные варианты осуществления изобретения.

П р и м е р 1. Концентрированный водный раствор РНЕ, содержащий приблизительно 15 мг/мл простых/сложных эфиров полигематопорфирина, получали в соответствии с процедурами, описанными Dougherty в патенте США N 4 649 151. Указанный концентрат хранили в замороженном виде и перед лиофилизацией рамораживали в водяной бане при температуре 3^оС (± 2^оС) для осуществления постепенного оттаивания. Затем размороженный концентрат взвешивали и выливали тарированный стеклянный светозащищенный смеситель. После чего загруженную партию размешивали до получения однородного состава.

После получения гомогенной смеси измеряли рН этого размороженного объемного концентрата и, не по необходимости, доводили значение рН до 7,2-7,8 с помощью 5% -ной соляной кислоты или 5%-ным водным раствором гидроокиси натрия. Затем концентрат фильтровали в стерильных условиях в две стадии: с использование 0,45 мкм поливинилидендифторного фильтра предварительной очистки и 0,2 мкм стерильного фильтра того же типа.

После фильтрации концентрата соответствующий объем дополняли до получения 75 мг меченного продукта на пробирку и загружали в 30 мл пробирки. После чего эти пробирки помещали в камеру для лиофилизации. Стерильный концентрат замораживали в течение, по крайней мере, 2 ч до температуры -35^оС или ниже. Затем лиофилизировали указанный продукт при температуре +35^оС до тех пор, пока он не достигнет температуры 20-25^оС, после чего его выдерживали при этой температуре в течение 5 ч. Затем температуру в камере доводили до атмосферной путем удаления безводного азота, пробирки вынимали из камеры и герметизировали.

Непосредственно перед использованием продукта в фотодинамической терапии содержимое пробирок разбавляли 30,0 мл инъекционного раствора декстрозы.

П р и м е р 2. Лиофилизированный РНЕ с содержанием влаги менее 1% (как было установлено с помощью анализа Карла Фишера) получали в соответствии с процедурой, описанной в примере 1, с тем лишь исключением, что использовали дополнительную стадию, т. е. после выдерживания продукта при температуре 20-25^оС в течение 5 ч, повышали температуру до 33-37^оС и выдерживали этот продукт при указанной температуре в течение 6-10 ч. Затем давление камеры доводили до атмосферного, а пробирки вынимали и герметизировали.

П р и м е р 3. Лиофилизированный РНЕ получали в соответствии с процедурой, описанной в примере 1. После чего продукт подвергали на стабильность с варьированием температур и временных интервалов, используя жидкостную хроматографию высокого давления (ЖХВД) при следующих условиях:
Подвижная фаза А: смесь (1:1:1) тетрагидрофурана, метанола и воды, содержащая 0,02% ледяной уксусной кислоты; рН доводили до 5,0-5,1 с помощью NaOH.

Подвижная фаза В: 90% тетрагидрофурана в воде.

Колонка: Ультрасфера ODS, размер частиц 5 мкм; 150 х 4,6 мм (Beckman).

Температура: окружающей среды
Скорость потока: 1,0 мл/мин
Объем ввода 20 мкл
Тип детектора: УФ-поглощение при 410 нм.

Хроматограмма: 100% подвижная фаза A до получения полностью элюированного пика фотопорфирина (около 9,5-13 мин)
- линейная программа до 100% подвижной фазы В в течение 1 мин.

- 100% мобильная фаза В до полного элюирования РНЕ около 16-25 мин.

- линейная программа до 100% подвижной фазы А в течение 3 мин.

- уравновешивание 100% подвижной фазой А в течение, по меньшей мере, 5 мин между вводами.

Результаты испытаний представлены в табл. 1.

В табл. 2 представлены результаты испытаний замороженного раствора РНЕ на стабильность с помощью ЖХВД при аналогичных условиях.

Исследование результатов, приведенных в табл. 1 и 2, показали, что лиофилизованная композиция РНЕ изобретения обнаружила большую стабильность, чем стабильность замороженного раствора, и эта композиция сохраняет свою активность при комнатной температуре, по меньшей мере, в течение 6 месяцев.

П р и м е р 4. В соответствии с процедурой, описанной в примере 1, получали лиофилизированный РНЕ, который затем исследовали на макрочастицы с использованием HIAC-счетчика. Результаты представлены в табл. 3.

Все числа представляют собой частицы размером более ≥10 мкм.

Результаты анализа частиц замороженного раствора, проведенного с использование счетчика Coulter, представлены в табл. 4.

Исследование приведенных данных показало, что лиофилизированный продукт поддерживает уровень образования частиц, который является значительно ниже известного (не более 10000 частиц, которые имеют размеры более или равные 10 мкм на пробирку), тогда как замороженный раствор обнаруживает значительное образование частиц при температуре выше -20^оС за период времени 3 месяца.

П р и м е р 5. В соответствии с описанием в примере 1 получали лиофилизированный РНЕ и исследовали его на биологическую активность с использованием процедуры, описанной Dougherty et al, Т. Nat. Cancer Inst 55:115. В соответствии с этой процедурой SMT-F-опухоль от мышей-доноров DBA/2HA имплантировали мышам DBA/2HA в целях испытания. После имплантации отбирали десять мышей с размером опухоли 4 х 4 мм - 6 х 6 мм и вводили им внутрибрюшинно 4,2 мг/кг РНЕ-раствора, полученного путем восстановления лиофилизированного РНЕ добавлением 5% декстрозы в воде. Через 24 ч после введения дозы опухоль облучали в течение 30 мин ксеноновой лампой с использованием красного света 630 нм при отношении интенсивности света к расстоянию 157,5 мВ/см², как было измерено с помощью измерителя мощности. Результат принимался как приемлемый, если у 50% или более из десяти испытуемых мышей через 7 дней после облучения не обнаруживалось видимой или пальпируемой опухоли. Результаты биоанализа с использованием восстановленного лиофилизированного РНЕ представлены в табл. 5.

В табл. 6 представлены результаты биоанализа замороженного РНЕ-раствора с использованием указанной процедуры.

Из сравнения результатов табл. 5 и 6 видно, что лиофилизированный РНЕ изобретения сохраняет свою биологическую активность in vivo при комнатной температуре, по меньшей мере, в течение 6 месяцев, тогда как замороженный раствор обнаруживает значительные колебания биологической активности при аналогичных условиях.

П р и м е р 6. Лиофилизированный РНЕ, содержащий маннит в качестве наполнителя, получали согласно процедуре, описанной в примере 1, путем добавления маннита в количестве, равном массе РНЕ до размораживания концентрата в стеклянном смесителе.

П р и м е р 7. Лиофилизированный РНЕ, содержащий в качестве наполнителя декстрозу, получали в соответствии с процедурой, описанной в примере 6, используя вместо маннита декстрозу.

Использование: изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и касается способа получения производного гематопорфирина в лиофилизированной форме. Целью изобретения является повышение качества целевого продукта. Сущность изобретения заключается в лиофилизации замороженного раствора фотофрина II, не содержащего хлорида натрия, при температуре от 35 до 20 - 25°С, выдерживании в течение 5 ч, повышении температуры до 33 - 37°С и выдерживании в течение 6 - 18 ч. Положительный эффект заключается в повышении стабильности целевого продукта. 6 табл.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОИЗВОДНОГО ГЕМАТОПОРФИРИНА В ЛИОФИЛИЗИРОВАННОЙ ФОРМЕ путем замораживания его водного раствора и лиофилизации, отличающийся тем, что, с целью повышения качества целевого продукта, в качестве производного гематопорфирина используют раствор фотофрина 11, не содержащего хлорид натрия, а лиофилизацию замороженного раствора проводят при температуре от 35 до 20 - 25^oС, после чего выдерживают в течение 5 ч, затем повышают температуру продукта до 33 - 37^oС и выдерживают в течение 6 - 18 ч, при этом лиофилизированная композиция имеет содержание влаги менее 1%.