СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТЕЛ Российский патент 1994 года по МПК G01N33/535 

Изобретение относится к медицине. С его помощью можно определять количество лимфоцитов - продуцентов специфических антител у больных различными инфекционными заболеваниями. Это дает возможность проводить не только диагностику, но и определять количество лимфоцитов, продуцирующих специфические антитела, тем самым появляется возможность охарактеризовать иммунологический статус этих больных. Также при использовании предложенного способа можно определять чистоту гибридомных линий, продуцирующих моноклональные антитела, что является важным при преклонировании культур.

Известен способ определения антител с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА). Этот способ основан на том, что для исследования уровня специфических иммуноглобулинов в сыворотке или супернатанте проводят сенсибилизацию твердой фазы антигеном, добавлением исследуемого материала к этому антигену и определением результатов иммунной реакции с помощью конъюгата. Однако, данный способ недостаточно точен для характеристики иммунного ответа у больных и реконвалесцентов, поскольку не дает ясного результата в присутствии иммунных комплексов в крови, наличии неспецифических реакций, а также при невысоком уровне выработки специфических антител. ИФА, вместе с тем, не позволяет определять процентное соотношение гибридомных клеток, продуцирующих моноклональные антитела. Тем самым не дает ясного представления о сроках переклонирования.

Способ осуществляется следующим образом. Лимфоцитарную культуру, подлежащую исследованию, трехкратно промывают в забуференном физиологическом растворе (ЗФР) (NaCl 0,15 М, Tris-HCl рН 7,4) ресуспендированием с последующим центрифугированием при 1000 об/мин в течение 10 мин. После этого клетки в концентрации 5000000 клеток в миллилитре инкубируют в растворе с антигеном 2 ч при 37^оС. Антиген используют в разведении, в 10 раз меньшем рабочей концентрации, применяемой в твердофазном иммуноферментном анализе для сорбции на твердую фазу (1/100-1/500). Далее клетки трехкратно промывают ЗФР, используя указанный режим центрифугирования, а затем ресуспендирование проводят в ЗФР с 30%-ной сывороткой крупного рогатого скота в концентрации 2000000 клеток в миллилитре. Полученную суспензию вносят по 25 мкл на предметные стекла и высушивают при комнатной температуре. После полного высыхания препарат фиксируют в ацетоне при -20^оС 30 мин и промывают ЗФР 5 мин. Фиксированные препараты хранят при 15-20^оС.

Следующим этапом является проведение клеточного иммуноферментного анализа. Для предотвращения нежелательного воздействия эндогенной пероксидазы лимфоцитов на субстрат, проводится блокирование активности этого фермента. В связи с этим, фиксированные клетки инкубируют 30 мин в 7,5%-ном растворе перекиси водорода на метаноле при 20^оС. После трехкратной отмывки препарата ЗФР, проводят инкубацию с раствором субстрата (3 мг диаминобензидина, 100 мкл 0,5%-ной перекиси водорода, растворенных в 6 мл ЗФР) от 10 мин до 1 ч, контролируя под световым микроскопом появление специфического окрашивания мембран лимфоцитов в коричневый цвет.

В качестве примера можно привести использование предложенного способа для изучения количества клеток, продуцирующих антиНВ core антитела у больных острым гепатитом В. 6 мл крови больного забирают в пробирки с 2 мл гепарина, разведенного 1/50 в среде 199. Затем гепаринизированную кровь в объеме 6 мл наслаивают в центрифужных пробирках на раствор фиколл-верографина (36 г порошка фиколла разводят в 400 мл дистиллированной воды. Этот раствор смешивают с 83,29 мл 76%-ного верографина с последующим добавлением 91,71 мл дистиллированной воды. Плотность приготовленного раствора должна составлять 1,077). После этого приготовленный материал центрифугируют 10 мин при 1000 об/мин в горизонтальном роторе. Затем при помощи пастеровской пипетки забирают отделившиеся лимфоциты, которые выглядят в виде опалесцирующего кольца на поверхности плотности фиколл-верографина. Далее необходимо провести манипуляции, указанные выше. Концентрация core антигена при этом должна быть не менее 5 мг/мл. Результаты опыта показывают, что у больных с острым гепатитом В с титром антиНВ core антител 1/100000 в ИФА около 3% лимфоцитов имеют отношение к продукции специфических антител.

Изобретение относится к медицине и может быть использовано при определении количества лимфоцитов - продуцентов специфических антител у больных различными инфекционными заболеваниями. Целью изобретения является повышение точности способа за счет выявления антител на поверхности лимфоцита, продуцирующих антитела. Для этого исследуемые лимфоциты инкубируют со специфическим антигеном. После образования комплексов клетки фиксируют ацетоном на предметных стеклах. Затем с помощью перекиси водорода ингибируют эндогенную пероксидазную активность, после чего проводят инкубацию с конъюгатом и субстратом последовательно. Реакция считается положительной, когда у лимфоцитов мембрана принимает коричневую окраску. С помощью данного способа можно определять продукцию антител единичными клетками. Столь низкий уровень иммуноглобулина нельзя определять с помощью общеизвестного иммуноферментного твердофазного анализа.

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТЕЛ, включающий добавление к исследуемому материалу специфического антигена с последующим инкубированием и регистрацией реакции с помощью иммуноферментной метки, отличающийся тем, что, с целью повышения точности способа за счет выявления антител на поверхности лимфоцитов, в качестве исследуемого материала используют лимфоциты, далее после инкубации лимфоцитов с антигеном, клетки фиксируют в ацетоне и добавляют перекись водорода.