СИНТЕТИЧЕСКИЕ ОЛИГОПЕПТИДЫ, СПЕЦИФИЧЕСКИ ВЗАИМОДЕЙСТВУЮЩИЕ С АНТИТЕЛАМИ К ВИРУСУ ГЕПАТИТА С, СПОСОБЫ ДИАГНОСТИКИ HCV-ИНФЕКЦИИ (ВАРИАНТЫ) Российский патент 1998 года по МПК C07K7/08 G01N33/576 G01N33/68 

Изобретение относится к медицине, молекулярной биологии и вирусологии и представляет собой биологически активные соединения - синтетические олигопептиды, соответствующие аминокислотным остаткам (а. о.) 1711-1732 и 1921-1940 неструктурного белка NS4 вируса гепатита C (HCV), обладающего способностью специфически взаимодействовать с антителами к HCV, а также способы диагностики гепатита C с использованием данных олигопептидов.

Вирус гепатита C - один из главных этиологических агентов хронического гепатита и заболеваний печени во всем мире. Специфическая диагностика вирусного гепатита C является актуальной проблемой здравоохранения человека.

Известны синтетические пептиды, с помощью которых возможна детекция специфических антител к HCV в сыворотках крови человека (Cerino A., Mondelli M. U. , J.Immunol., 1991, 147, 2692 - 2696). Пептиды представляют собой фрагменты неструктурного белка NS4 из района, соответствующего рекомбинантному антигену 5-1-1. Аминокислотная последовательность данных пептидов соответствует сиквенсу с100-3, опубликованному Chiron Corporation. Эти пептиды могут быть выбраны в качестве ближайшего аналога представленных синтетических пептидов. Существенные признаки, характеризующие эти пептиды, следующие: это - синтетические олигопептиды; они специфически взаимодействуют с антителами к вирусу гепатита C; они являются фрагментами неструктурного белка NS4 вируса гепатита C.

Предлагаемые пептиды отличаются от прототипа по следующим признакам: пептиды соответствуют другим участкам белка NS4 HCV, а именно а. о. 1711-1732 и 1921-1940; описанные свойства олигопептида, отвечающего а. о. 1711-1732, распространяются на все его аналоги, синтезированные в соответствии с известными геномными последовательностями HCV, в то время как последовательности прототипа являются фрагментами с100-3 (Chiron Corporation).

Известен способ диагностики HCV-инфекции - иммуноферментный скрининг антител к вирусу гепатита C (анти-HCV антител) с помощью рекомбинантного полноразмерного нуклеокапсидного антигена HCV (HCcAg) (Фаворов М.О., Ю.Е. Худяков, Т. Л. Яшина и др. // Тезисы докладов Всероссийской научно-практической конференции "Состояние и перспективы разработки препаратов для диагностики вирусных гепатитов и инфекций, управляемых специфическими средствами профилактики". Пермь: 1993, с. 126-127). По данным авторов, чувствительность диагностикума, основанного на рекомбинантном HCcAg, по сравнению с тест-системами 2-го поколения фирм "Abbott" (USA) и "Ortho" (USA) составляет 96,7 и 92,9%, соответственно.

Существенным недостатком данной тест-системы является ограниченность спектра выявления антител к вирусу гепатита C только антителами к нуклеокапсидному белку (анти-HCc антителами). Вследствие этого становится невозможной постановка диагноза гепатит C у инфицированных вирусом гепатита C лиц, в сыворотках крови которых отсутствуют анти-HCc антитела.

Способы диагностики HCV-инфекции на основе смеси синтетических олигопептидов, отвечающих а. о. 1711-1732 и 1921-1940 белка NS4 HCV, а также на основе использования комбинации данных пептидов в качестве дополнительных антигенов к рекомбинантному HCcAg , либо другим белкам и пептидам, иммунореактивным с анти-HCV антителами, для усиления диагностических свойств исходных реагентов, не описаны.

Ближайшим аналогом-прототипом представленных способов диагностики HCV-инфекции можно считать европейский патент EP0445423.

К существенным признакам изобретения, совпадающим с признаками прототипа, относятся следующие.

1. Антигены сорбируются на твердую фазу, в качестве чего могут использоваться целлюлозные материалы, такие как бумага и нитроцеллюлоза; натуральные и синтетические полимерные материалы, такие как полиакриламид, полистирол; пористые гели, например силикагель, желатина, агароза, декстран; неорганические материалы, такие как стекло, дезактивированный алюминий, магнезиум сульфат. Эти материалы могут быть использованы для приготовления различных адсорбционных поверхностей, таким как микротитровальные планшеты, стрипы, мембраны, микроносители. Антигены могут быть сорбированы на твердую фазу не непосредственно, а будучи связанными с гаптенами, в то время как на твердую сорбирован антигаптен. Пример - авидин-биотиновая система, где биотинилированные пептиды прикрепляются к микротитровальным планшетам посредством взаимодействия с авидином, инкубированным на полистирольной поверхности.

2. Контактирование адсорбированных на твердой фазе антигенов HCV с жидкими образцами, представляющими собой такие биологические жидкости, как цельная кровь, сыворотка, плазма, церебральная или спинальная жидкость, лимфоциты и супернатанты клеточных культур, в результате чего при положительном взаимодействии формируется комплекс антиген-антитело.

3. Обнаружение этого комплекса известными иммунологическим методами, например иммуноферментными, радиоизотопными, флюоресцентными, люминисцентными, хемилюминисцентными.

4. Возможность использования комбинации отличных друг от друга антигенов HCV, связанных с твердой фазой, для выявления антител к вирусу гепатита C в биологических жидкостях. Например, комбинации белка (рекомбинантного) и одного из олигопептидов.

К существенным признакам изобретения, отличающимся от признаков прототипа, можно отнести.

1. Использование в качестве антигенов определенных синтетических олигопептидов, соответствующих а. о. 1711-1732 и 1921-1940 белка NS4 HCV, не заявленных в вышеназванном европейском патенте, и их комбинаций.

2. Для расширения спектра выявления антител к вирусу гепатита C синтетические олигопептиды, соответствующие а. о. 1711-1732 и 1921-1940 белка NS4 HCV, используются как дополнительные антигены к исходным реагентам, например, к рекомбинантному белку HCcAg.

В изобретении предложены оригинальные синтетические пептидные антигены - фрагменты белка NS4 HCV, иммунореактивные с анти-HCV антителами, и разработаны способы диагностики вирусного гепатита C с использованием комбинации данных синтетических олигопептидов.

Пептиды соответствуют а. о. 1711-1732 (пептид 1) и а. о. 1921-1940 Ala-Phe-Ala-Ser-Arg-Gly-Asn-His-Val-Ser-Pro-Thr-His-Tyr-Val-Pro-Glu-Ser-Asp-Ala (пептид II) белка NS4 HCV. В связи с высокой вариабельностью участка 1711-1732 в зависимости от генотипического варианта вируса структурная формулы не приводится. В то же время подразумевается использование пептида I, синтезированного в любом варианте. Для выявления анти-HCV антител в биологических образцах, полученных от больных гепатитом C на территории Российской Федерации, предпочтение отдается использованию пептида I, соответствующего геномной последовательности изолитов HCV-J b HCV-BK, входящих в субтип 1b, поскольку в данном регионе субтип 1b HCV наиболее распространен. Структурная формула пептида I, соответствующего субтипу HCV 1b, приведена в примере 1.

Синтезу пептидов предшествовали компьютерный анализ относительной гидрофильности, расчет вторичной структуры более NS4 и проведение пептидного сканирования области 50101 белка NS4. Пептиды были синтезированы на твердой фазе (тефлон с радиационно привитым полистирилом) с использованием трет.-бутилоксикарбонил/бензил (Boc/Bzl)-стратегии и применение активированных эфиров и симметричных ангидридов Boc-аминокислот. Пептид I был синтезирован в различных вариантах с аминокислотными заменами, соответствующими известным генотипическим вариантом вируса. После отщепления от полимера действием трифторметансульфокислоты в трифторуксусной кислоте в присутствии тиоанизола пептиды были очищены гель-хроматографией на сефадексе G-15 и полупрепаративной обращеннофазовой высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ). Индивидуальность полученных соединений контролировали с помощью тонкослойной хроматографии на пластинках "Cellulose F" в системе пропанол-25% водный аммиак-вода, 6: 3: 1, полупрепаративной ВЭЖХ и аминокислотным анализом. Антигенная активность синтетических пептидов и инвариантных по концентрации пептидных смесей определялась различными методами иммунодиагностики, в том числе методом непрямого твердофазного иммуноферментного анализа по их взаимодействию в ИФА с сыворотками крови пациентов с диагнозом острый гепатит C и хронический гепатит C, содержащими анти-HCV антитела по данным ИФА и иммуноблоинга с коммерческими тест-системами второго поколения "ELISA-II" и "RIBA-II" (Chiron Corp., Emeryville, CA and Ortho Diagnostics).

Пример 1. Сравнительное исследование антигенной активности синтетического пептида из области 5-1-1 HCV (пептид I, а.о. 1711-1732, субтип 1b HCV, Cys-Ala-Ser-His-Leu-Pro-Tyr-Ile-Glu-Gin-Gly-Met-Gln-Leu-Ala-Glu-Gln-Phe-Lys-Ala) и рекомбинантного антигена 5-1-1 из коммерческой тест-системы "RIBA-II" (Chiron Corp., Emeryville, CA and Ortho Diagnostics) по данным ИФА и иммунооблотинга.

Анализ антигенной активности пептида I проводился методом непрямого твердофазного неконкурентного ИФА. В ИФА использовались 32 сыворотки. Из них 29 были получены от больных острым и хроническим гепатитом C и содержали антитела к антигену 5-1-1 по данным иммуноблотинга "RIBA-II" (Chiron Corp., Emerville, CA and Ortho Diagnostics"). Три сыворотки использовались в качестве отрицательного контроля: одна - от здорового донора, одна - от больного гепатитом B, одна - от больного гепатитом A.

Иммунологические планшеты сенсибилизировали по 120 мкл/лунку раствором пептида 1 концентрацией 0,85 мкг/мл карбонатного буфера (pH 9,5) в течение ночи при 20^oC. Планшеты отмывали пятикратно бидистиллированной водой. Вносили сыворотки в разведении 1:100 по 100 мкл в буфере, содержащем 0,05 М трис (pH 7,2), 0,85% NaCl, 10% сыворотки крупного рогатого скота (КРС) в физиологическом растворе. Проводили инкубацию в течение 60 мин при 37^oC и встряхивании. Отмывали 5 раз 0,85% NaCl с 0,1% тритона X-100 в физиологическом растворе. Добавляли античеловеческий пероксидазный конъюгат (в рабочем разведении) по 100 мкл в буфере, содержащем 0,05 М трис (pH 7,2), 0,85% NaCl, 5% сыворотки КРС в физиологическом растворе. Проводили инкубацию в течение 50 мин при 87^oC и встряхивании. Отмывали 5 раз 0,85 NaCl с 0,1% тритона X-100 в физиологическом растворе. Добавляли по 100 мкл раствора субстрата OPD (ортфенилендиамин) в концентрации 0,5 мг/мл в цитратном буфере (pH 4,5) с 0,1% H₂O₂. Реакцию останавливали вселением в лунки по 50 мкл 10% H₂SO₄. Степень поглощения образцов регистрировали на приборе "Titertec Multiscan" фирмы "Flow" (Англия) при длине волны 492 нм. Результаты ИФА оценивали количественно по величине S/N в "+" по отношению поглощения образца (S) к среднему арифметическому сигналов (N) в лунках с отрицательными сыворотками, где 2,1 ≤ 1+ < 3,5; 3,5 ≤ 2+ <<5,0; 5,0 ≤ 3+ < 10,0; 4+ ≥ 10,0. Негативными по пептиду считали сыворотки, для которых значение S/N было меньше 2,1. Как видно из табл. 1, эффективность выявления в сыворотках крови больных гепатитом C анти-HCV антител в ИФА пептидом I составляет 83% по сравнению с зарегистрированной в иммуноблотинге антителосвязывающей способностью рекомбинантного антигена 5-1-1. Все синтетические аналоги пептида I, синтезированные в соответствии с геномными последовательностями других известных субтипов HCV, отличались от пептида I меньшей эффективностью взаимодействия с данным сыворотками, представленными в табл. 1 - 3.

Пример 2. Выявление в сыворотках крови больных гепатитом C антител к белку NS4 HCV с помощью синтетических пептидов I (а. о. 1711-1732, субтип 1b HCV) и II (а. о. 1921-1940), а также рекомбинантных антигенов 5-1-1 и с100-3 из диагностического набора "RIBA-II" (Chiron Corp., Emeryville, CA and Ortho Diagnostics).

Растворы пептидов I и II концентрацией по 0,85 мкг/мл физиологического раствора и их смесь, содержащую по 0,85 мкг каждого пептида в 1 мл физиологического раствора, вносили в лунки планшет. Сорбцию вели в течение ночи при 37^oC. В ИФА использовались 16 сывороток. Из них 13 были получены от больных острым и хроническим гепатитом C и содержали анти-HCV антитела, выявляемые методом иммуноблотинга с помощью антигенов 5-1-1 и с100-3 из коммерческого диагностикума "RIBA-II" (Chiron Corp. , Emeryville, CA and Ortho Diagnostics). Три сыворотки использовались в качестве отрицательного контроля: одна - от здорового донора, одна - от больного гепатитом B, одна - от больного гепатитом A. ИФА проводили аналогично тому, как описано в примере 1.

Из табл. 2 видно, что антигенная активность пептида I сравнима с активностью рекомбинантного антигена 5-1-1, а способность пептида II взаимодействовать с анти-HCV позитивными сыворотками в ряде случаев превышают таковую для рекомбинантного антигена с100-3. В данном примере показано, что для выявления анти-HCV антител смесь пептидов I и II может быть использована с большей эффективностью, чем антигены 5-1-1 и с100-3.

Пример. 3. Использование синтетических пептидов I и II в качестве дополнительных антигенов к рекомбинантному HCcAg для выявления антител к HCV в сыворотках крови больных гепатитом C.

Иммунологические планшеты сенсибилизировали антигенной смесью, содержащей в 1 мл физиологического раствора 0,33 мкг рекомбинантного полноразмерного HCcAg, 0,85 мкг пептида I (а.о. 17111-17326 субтип 1b HCV) и 0.85 мкг пептида II (а. о. 1921-1940). Сорбцию вели в течение ночи при 37^oC. В ИФА использовались 16 сывороток. Из них 13 были получены от больных острым и хроническим гепатитом C содержали анти-HCV антитела, выявляемые методом иммуноблотинга с помощью антигенов 5-1-16 с100-3, с33с и с22-3 из коммерческого диагностикума "RIBA-II" (Chiron Corp. , Emeryville, CA and Ortho Diagnostics). Три сыворотки использовались в качестве отрицательного контроля: одна - от здорового донора, одна - от больного гепатитом B, одна - от больного гепатитом A. ИФА проводили аналогично тому, как описано в примере 1. Антигенную активность составленной смеси сравнивали с активностью рекомбинантных HCcAg и антигенов из "RIBA-II". Из табл. 3 видно, что добавление к рекомбинантному HCcAg синтетических пептидов I и II значительно повышает эффективность скрининга анти-HCV антител.

Таким образом, синтетические олигопептиды, соответствующие а.о. 1711-1732 и 1921-1940 неструктурного белка NS4 вируса гепатита C, могут быть использованы самостоятельно как специфические антигены для выявления антител к вирусу гепатита C в жидких образцах, а также в качестве дополнительных антигенов для повышения эффективности существующих диагностических тест-систем на гепатит C.

Использование: в медицине, молекулярной биологии и вирусологии для диагностики вирусного гепатита C. Сущность изобретения: для иммунодиагностики HCV-инфекции используют синтетические олигопептиды, которые специфически взаимодействуют с антителами к вирусу гепатита C и являются фрагментами неструктурного белка NS4 вируса гепатита C, соответствующими аминокислотным остаткам 1711-1732 и 1921-1940, при этом для диагностики HCV-инфекции на основе пептидов, иммунореактивных с антигенами к вирусу C, антигенная смесь состоит из комбинации указанных синтетических олигопептидов, а для диагностики на основе комбинации белков и пептидов, иммунореактивных с антителами к вирусу гепатита C, или на основе рекомбинантного нуклеокапсидного белка вируса гепатита C (HCcAg) антигенная смесь дополнительно содержит указанные синтетические олигопептиды. Способы просты, позволяют получить достоверные результаты. 5 с.п. ф-лы, 3 табл.

1. Синтетический олигопептид, специфически взаимодействующий с антителами к вирусу гепатита С и являющийся фрагментом неструктурного белка NS4 вируса гепатита С, отличающийся тем, что пептид соответствует аминокислотным остаткам 1711 1732. 2. Синтетический олигопептид, специфически взаимодействующий с антителами к вирусу гепатита С и являющийся фрагментом неструктурного белка NS4 вируса гепатита С, отличающийся тем, что пептид соответствует аминокислотным остаткам 1921 1940. 3. Способ диагностики HCV-инфекции, включающий выявление антител к вирусу гепатита С путем использования антигенной смеси, содержащей пептиды, иммунореактивные с антителами к вирусу гепатита С, отличающийся тем, что в качестве антигенной смеси используют смесь, содержащую комбинацию синтетических олигопептидов по пп. 1 и 2. 4. Способ диагностики HCV-инфекции, включающий выявление антител к вирусу гепатита С путем использования антигенной смеси, содержащей комбинацию белков и пептидов, иммунореактивных с антителами к вирусу гепатита С, отличающийся тем, что в составе антигенной смеси дополнительно используют синтетические олигопептиды по пп. 1 и/или 2. 5. Способ диагностики HCV-инфекции, включающий выявление антител к вирусу гепатита С путем использования антигенной смеси, содержащей рекомбинантный нуклеокапсидный белок вируса гепатита С, отличающийся тем, что в составе антигенной смеси дополнительно используют синтетические олигопептиды по пп. 1 и/или 2.